Minimamente invasiva muscolo incorporamento (MIME) - una nuova tecnica sperimentale per facilitare la miogenesi donatore-cellulo-mediata

Riepilogo

Descriviamo una tecnica sperimentale che chiamiamo minimamente invasiva muscolo Embedding (MIME), che si basa sull'evidenza che il tessuto muscolare scheletrico contiene cellule miogeniche vitali che possono facilitare la miogenesi donatore-cellula-mediata quando impiantato nel un muscolo di host.

Abstract

Muscolo scheletrico possiede capacità rigenerativa a causa di tessuto-residente, generazione di fibra muscolare (miogeniche) cellule satelliti (SCs), che può formare nuove fibre muscolari nelle giuste condizioni. Sebbene SCs può essere raccolto da tessuto muscolare e coltivate in vitro, le cellule dei mioblasti risultante non sono molto efficaci nel promuovere la miogenesi quando trapiantate in muscolo di host. Chirurgicamente esponendo il muscolo di host e l'innesto di segmenti di tessuto muscolare donatore, o le fibre muscolari isolate con loro SCs sul muscolo host, promuove la miogenesi migliore rispetto al trapianto di mioblasti. Abbiamo sviluppato una nuova tecnica che noi chiamiamo minimamente invasiva muscolo Embedding (MIME). MIME coinvolge passando un ago chirurgico attraverso il muscolo di host, disegno di un pezzo di tessuto muscolare donatore attraverso la pista dell'ago e poi lasciando il tessuto erogatore incorporato nel muscolo host in modo che possa agire come una fonte di SCs per il muscolo di host. Qui descriviamo in dettaglio i passaggi coinvolti nell'esecuzione di MIME in un modello di topo immunodeficiente che esprime una proteina fluorescente verde (GFP) in tutte le sue cellule. Immunodeficenza nel topo host riduce il rischio di rigetto immunitario del tessuto donatore, ed espressione di GFP consente la facile identificazione delle fibre muscolari di host (GFP +) e donatore-cellula-derivati di fibre muscolari (GFP-). I nostri dati pilota suggeriscono che MIME può essere utilizzato per impiantare un muscolo estensore digitorum lungo (EDL) da un mouse di donatore nel muscolo tibiale anteriore (TA) di un mouse di host. Anche i nostri dati suggeriscono che quando un myotoxin (cloruro di bario, BaCl₂) viene iniettato nel muscolo host dopo MIME, ci è prova della miogenesi donatore-cellula-derivati nel muscolo host, con circa 5%, 26%, 26% e 43% delle fibre in un singolo host TA muscolo che mostrano nessun contributo di host, contributo minimo host, host moderato contributo e contributo massimo host, rispettivamente.

Introduzione

Muscolo scheletrico sano, anche se post-mitotici, possiede eccellenti capacità rigenerativa per la presenza di cellule miogeniche residente in tessuto conosciuto come cellule satelliti (SCs)^1,2; e rivisti in^3,4. Tuttavia, nelle circostanze patologiche causate da distrofie muscolari, traumi o invecchiamento accelerato, la rigenerazione muscolare potrebbe non tenere il passo con la degradazione muscolare, e così, la perdita progressiva della fibra muscolare si verifica⁵. Anche se sono stati sviluppati metodi efficaci per isolare SCs dal muscolo ed espanderli in coltura per generare un gran numero di mioblasti (e successivamente miotubi), tentativi di generare numeri fisiologicamente rilevanti delle fibre muscolari nel muscolo host hanno ha reso solo successo minimo⁶. Come con molti altri tipi di cellule, quando mioblasti vengono iniettati da solo nel tessuto ospite, la maggior parte delle cellule non attecchire^7,8. Abbiamo dimostrato che la stimolazione elettrica neuromuscolare (NMES) facilita la miogenesi donatore-cellula-derivati nel muscolo del mouse di rigenerazione-carenti host che è stato iniettato con mioblasti umano⁸. Gli altri hanno dimostrato che chirurgicamente innesto muscolo biopsiato o singole fibre muscolari con annesso SCs, facilitare la miogenesi moderata anche senza NMES, suggerendo che l'impianto di fibre di muscolo intere con SCs potrebbe essere più vantaggioso di impiantare cellule miogeniche da solo^9,10. Dal donatore o tessuto muscolare ingegnerizzato innestati nel muscolo host produce risultati migliori rispetto a trapianto di cellule da solo, è possibile che il tessuto o tessuto-come le strutture potrebbero fornire spunti cruciale per engraftment donatore-cellula; un concetto che sta diventando sempre più evidente negli studi di terapia cellulare che coinvolge vari cella tipi^10,11,12.

Dati recenti suggeriscono che SCs ottenuti dagli esseri umani più di 2 settimane post-mortem generare miotubi in coltura¹³. Abbiamo quindi intenzione di valutare se l'impianto di muscolo tessuto raccolto post mortem in un ospite vivente sarà invertire la perdita di fibre muscolari. Abbiamo sviluppato una nuova tecnica chiamata MIME per impiantare il tessuto muscolare donatore nel tessuto del muscolo scheletrico di un ospite vivente al fine di promuovere la miogenesi donatore-cellula-derivati. MIME implica il passaggio di un ago chirurgico attraverso il muscolo di host per creare una pista dell'ago; disegno di un piccolo segmento del tessuto muscolare donatore attraverso la pista dell'ago; lasciando il tessuto erogatore incorporato nel muscolo host; e chiusura dei fori di spillo con adesivo del tessuto. Dopo che pratica la tecnica nei topi eutanasizzati studiato in altri esperimenti, abbiamo ora hanno effettuato MIME in topi dal vivo che sono immunodeficienti ed ubiquitariamente esprimere una proteina fluorescente verde (GFP), e follow-up a 3 e 14 giorni post-MIME. Alle 3 giorni post-MIME, confermiamo che muscolo EDL di donatore del mouse (GFP-) impiantato in mouse host del muscolo (GFP +) TA, resti incorporati nel muscolo host. A post-MIME 14 giorni, dopo l'infortunio di BaCl₂ myotoxin per indurre danni e miogenesi, confermiamo che circa 5%, 26%, 26% e 43% delle fibre in un singolo host muscolo TA non mostrano nessun contributo di host, contributo minimo host, host moderata contributo e maximal host contributo, rispettivamente. Nucleazione centrale (un indicatore di degenerazione e successiva rigenerazione) è visto in circa il 95% delle fibre muscolari TA dopo l'iniezione di MIME e myotoxin.

Studiamo i muscoli TA 14 giorni dopo MIME + BaCl₂ perché questo punto di tempo acquisisce lo stadio intermedio della rigenerazione, quando una maggioranza delle fibre rigenerate sono centralmente nucleate. Studiamo la GFP + topi come host per MIME, quando alla fine si trapiantare muscolo cadaverico umano nei topi di host, saremo in grado di distinguere facilmente le fibre muscolari di origine host e donatore. Usiamo il mouse del muscolo EDL come il tessuto erogatore sperimentale, poiché le singole fibre da questo muscolo hanno dimostrato una maggiore potenziale myogenic di TA muscoli⁹. Il muscolo EDL è anche sinergico al muscolo TA e ha composizione simile tipo di fibra. I nostri dati preliminari suggeriscono che MIME è in grado di facilitare la miogenesi donatore-cellula-derivati nel muscolo host.

Protocollo

tutti gli studi che coinvolgono animali vivi sono approvati dall'istituzione Animal Care e uso Committee (IACUC) alla Wayne State University, Detroit, Michigan, USA e sono in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio ( 8a edizione, 2011, pubblicato da National Academies Press, 500 Fifth Street, NW, Lockbox 285, Washington, DC 20055, USA). Secondo i protocolli approvati IACUC, procedure che comportano dolore e/o afflizione sono state eseguite in anestesia generale, che è indotto e mantenuto da inalazione isoflurane (1.5-5% di effetto). L'anestesia è stata verificata da mancanza di recesso alla punta pizzico e di palpebrale o risposte di vibrisse (la percentuale di isoflurane è stata aumentata come necessario per mantenere l'effetto). A causa della natura mini-invasiva dei protocolli, un " sterile suggerimenti " tecnica è stata seguita. Mentre gli animali erano sotto anestesia, gelatina di petrolio è stato applicato agli occhi per prevenire la secchezza. Senza trattamenti speciali sono stati richiesto; Tuttavia, gel di dieta è stato fornito agli animali per 24 h seguendo le procedure che ha coinvolto l'anestesia generale. lo sperimentatore è approvato da IACUC di trattenere l'analgesia dopo MIME, poiché la procedura non comporta chirurgicamente esponendo l'host muscolare, perché è limitata ad un arto posteriore e non pregiudica la funzione normale, e perché molti farmaci analgesici comuni sono noti per influenzare la rigenerazione muscolare normale.

1. Modelli animali

1. topi Host per MIME
   1. topi uso NSG-GFP (8-10 settimane, maschio) come host per il muscolo innesti studi.
      Nota: Questi topi sono padroni ideali per innesti allogeneic muscolo perché mancano di linfociti T e B maturi e funzionali le cellule natural killer, sono carenti di cytokine signaling e sono stati utilizzati da altri per le celle non muscolo-allografting o trapianto xenogenico < sup classe = "xrif" > 14. Espressione di GFP ubiquitaria permette per una facile identificazione dell'host (GFP +) e donatore-cellula-derivati di fibre muscolari (GFP-).
2. Topi donatore per MIME
   1. uso C57BL/6J topi (12-16 settimana) come topi donatore.
      Nota: Questi topi sono topi donatore adatto perché hanno un genoma completamente connessa, non sono noti per avere qualsiasi patologia del muscolo scheletrico, sono facilmente disponibili ed economici e non esprimono GFP.

2. Preparazione tessuto muscolare donatore

1. legatura guida suture e raccolta donatore EDL muscoli
   1. eutanasia i topi di donatore di dislocazione cervicale ed il thoracotomy eseguita in anestesia generale, amministrato da un tavolo vaporizzatore di isoflurane guidato da ossigeno medicale (isoflurano inalato; 2-5% di effetto).
   2. Per accedere i muscoli EDL, usare un paio di forbici chirurgiche per aprire la pelle sopra la superficie anteriore della gamba. Individuare il muscolo TA alla gamba anteriore e rimuoverlo per visualizzare il muscolo EDL che si trova dietro il muscolo di TA. Far scorrere la punta di un paio di pinze dietro il muscolo EDL e applicare la trazione delicata per vedere se estende le dita dei piedi (questo conferma che il muscolo è l'EDL).                                                                                                                                                          
      Nota: zona del tessuto donatore dovrebbe essere chirurgicamente, asetticamente preparato prima della vendemmia.
   3. Uso ~ segmenti di 10 cm di seta 4-0, sutura intrecciata, non riassorbibile, sterile e fare due doppi nodi per applicare le suture Guida ai tendini prossimali e distali del muscolo EDL. ( Figura 1A).
   4. Tagliare il tendine distale di EDL, riflettono il muscolo EDL e tagliare il tendine prossimale.
   5. Posto il donatore EDL muscoli in una capsula Petri riempito con soluzione di Ringer mouse.

3. Preparazione Host topi per MIME

1. anestesia
   1. posizionare il mouse host in anestesia generale (isoflurano inalato; 1,5-5% per effetto) amministrato da un vaporizzatore da tavolo isoflurano guidato da ossigeno medicale.
   2. Inducono anestesia in un'aula di induzione e poi trasferire il mouse di un cono di naso per mantenere l'anestesia durante l'esecuzione di altre procedure sull'animale. Fornire supporto termico con un gel isotermico, rilievo di riscaldamento, mentre l'animale è sotto anestesia.
2. La preparazione della pelle
   1. per rimuovere l'animale ' s pelliccia, applicare una crema depilatoria sopra la funzione anteriore della gamba posteriore sinistra. La gamba destra serve come una gamba di controllo per le procedure successive.
   Pelliccia
   2. lasciare la crema depilatoria su per 2 min pulite fuori la crema depilatoria insieme la staccata con panni imbevuti di fosfato tampone salino (PBS). Dopo la rimozione di pelliccia, strofinare la pelle con tre salviette alternati di povidone-iodio sfregatura soluzione 70% etanolo e.
3. Creazione di una pista dell'ago nel muscolo TA host
   1. passare un ago chirurgico di calibro 18 (1 in lungo) attraverso il centro dell'ospite del muscolo TA lungo il muscolo ' asse lungo di s ( Figura 1B). Passare l'ago in senso cefalo-caudale, lungo la lunghezza del muscolo TA e attraverso il centro del ventre muscolare ( Figura 1B).
      Nota: Lo scopo di questo passaggio è quello di creare una traccia di ferro, in cui può essere incorporato un pezzo di muscolo di donatore. L'incorporamento del tessuto donatore al centro del muscolo TA potenzialmente permetterebbe la SCs dal tessuto del donatore per migrare e facilitare la miogenesi attraverso l'intero host muscolo TA.
4. Tessuto erogatore Embedding nella pista dell'ago dell'host del muscolo TA
   1. una volta che l'ago chirurgico è all'interno dell'host del muscolo TA, passare le suture guida ad una estremità del tessuto donatore attraverso il lume dell'ago chirurgico in un direzione caudo-cefalico ( Figura 1).
   2. Disegnare il tessuto donatore attraverso la pista dell'ago come l'ago è ritirato dal muscolo host TA in senso caudo-cefalico.
   3. Utilizzare le suture di guida alle estremità cefalica e caudale del tessuto donatore per regolare il posizionamento del tessuto donatore. Assicurarsi che il tessuto del donatore è sistemato all'interno dell'host muscolo TA ( Figura 1).
   4. Una volta che il posizionamento del tessuto donatore è ottimizzato, tagliare le suture guida, apportare regolazioni finale il posizionamento del tessuto donatore con una pinza appuntita.
   5. Guarnizione cutanei dell'ago ferite ( Figura 1E -F) approssimando il bordo della ferita con il forcipe e applicando adesivo veterinario del tessuto con la punta di un ago chirurgico calibro 27.

4. Iniezione intramuscolare di Myotoxin per indurre la degenerazione muscolare concertata e rigenerazione

1. dopo MIME, iniettare 50-60 µ l di 1,2% BaCl ₂ (myotoxin) per l'host del muscolo TA per indurre il danno della fibra di muscolo vasto nel muscolo host e il tessuto erogatore incorporato all'interno di esso ¹⁵.
   1. Iniettare BaCl ₂ in 3 siti lungo la lunghezza dell'host TA muscolare (prossimali e distali, un terzo del ventre muscolare).
      Nota: Iniettando myotoxins come BaCl ₂, cardiotossine e notexin nel muscolo scheletrico induce il danno concertata della fibra di muscolo seguita da rigenerazione ¹⁶.

5. Post-procedurale Animal Care

1. dopo MIME e BaCl ₂ iniezione, pulire il mouse host ' s sinistra posteriore gamba con etanolo e applicare un sottile strato di vaselina per proteggere la pelle.
2. Dopo la cura post-operatoria della pelle, rimuovere il mouse host dal cono di naso.
3. Posizionare il mouse in una gabbia di recupero solitario senza biancheria da letto. Fornire supporto termico all'animale recupero attraverso un rilievo di riscaldamento gel isotermici assoggettati a metà della gabbia recupero.
   Nota: Una metà non è riscaldata e quindi quell'animale può allontanarsi il rilievo di riscaldamento se necessario.
4. Dopo il mouse host completamente ha recuperato dall'anestesia, restituire l'animale alla sua gabbia originale. Posto sul retro degli animali nella struttura animale fino a quando non vengono eseguiti esperimenti di follow-up. Monitorare quotidianamente il mouse host fino a quando è pronto per il follow-up – esempio: alle 3 o 14 giorni post-MIME. Dopo MIME, gli animali sono monitorati da personale di laboratorio nonché di personale veterinario – principalmente si tratta di valutare se gli animali sono luminose, vigile e reattivo; e anche valutare se gli animali mostrano evidenti segni di dolore o hanno difficoltà a muoversi, alimentazione, bere e toelettatura.

6. Raccolta di tessuto

1. muscolo host raccolta
   1. eutanasia i topi di host di dislocazione cervicale ed il thoracotomy eseguita in anestesia generale, amministrato da un vaporizzatore da tavolo isoflurano guidato da ossigeno medicale ( isoflurano inalato; 2-5% di effetto). lo sperimentatore ha anche IACUC approvazione ai muscoli TA raccolto in anestesia generale prima dell'eutanasia.
   2. per accedere i muscoli di host TA, utilizzare un paio di forbici chirurgiche per aprire la pelle sopra la superficie anteriore della gamba. Individuare il muscolo TA alla gamba anteriore, tagliare il tendine distale, riflettono il muscolo e tagliare gli allegati di muscolo prossimale (Vedi sezione 2.1).
   3. Raccogliere TA (controllo) destro e sinistro (sperimentale) muscoli.
2. Snap congelamento muscoli raccolti
   1. pesare i muscoli raccolti mettendo su carta di pesare e bilancia.
   2. Immergere brevemente i muscoli in olio minerale per crioprotezione. Asciugare l'olio in eccesso.
   Muscoli
   3. posto sul foglio di alluminio e snap congelare i muscoli da rapidamente immergendole in azoto liquido riempito in un Dewar. Trasferire i campioni per cryovials etichettati e conservare i campioni in un congelatore-80 ° C per gli studi successivi.

7. Gli esami istologici

1. Cryosectioning tessuto muscolare per raccogliere le sezioni trasversali seriale
   1. trasferire i campioni dal congelatore-80 ° C per un criostato inserendoli in un Dewar contenente azoto liquido.
   2. Nel criostato, gestire un campione alla volta. Con una lama di rasoio fredda (lama memorizzata nel criostato), tagliare il campione due volte alla metà pancia del muscolo TA per produrre un segmento del muscolo che è circa 1-2 mm di spessore. Mantenere questo segmento per rendere le sezioni del criostato e tornare le rimanenti parti del muscolo al suo cryovial.
   3. Con la temperatura di taglio ottimale (OCT) composto di congelamento, fissare il segmento spesso del tessuto su un disco di esemplare del criostato. Posizionare il disco sul portacampioni.
   4. Grezzo-faccia il campione di taglio 20 µm sezioni. Raccogliere 20 µm alcune sezioni sulle lastre di vetro per le sezioni criostato.
   5. Se la qualità delle 20 sezioni µm è soddisfacente, modificare lo spessore di taglio a 5 µm e raccogliere alcune sezioni per valutare la qualità. Se le sezioni di µm 5 sono soddisfacenti in termini di qualità, raccogliere le sezioni di serie. Raccogliere le sezioni 2-3 per ogni diapositiva e raccogliere abbastanza sezioni per 3 scivoli.
   6. Raccogliere le sezioni da sperimentale (sinistra) e i muscoli di TA di controllo (a destra) di ogni animale.
2. Espressione di GFP studiando
   Nota: designare un insieme dei vetrini preparati (sezione 7.1) per lo studio di espressione di GFP nelle fibre muscolari.
   1. Applicare ~ 50 µ l di terreno di anti-dissolvenza sulle sezioni e applicare un vetrino coprioggetti. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente.
   2. Uso del microscopio luce e fluorescente (Vedi Tabella materiali), studiare le sezioni con un 10x obiettivo e un filtro appropriato per la visualizzazione di GFP.
      1. Raccogliere immagini digitali (~ 15) di sovrapposizione di campi visivi per coprire l'intera sezione trasversale del muscolo TA. Raccogliere le immagini di contrasto di fase per ciascuno dei campi visivi passando da fluorescenza alla modalità di contrasto di fase sul microscopio.
   3. Aprire le immagini con un software di imaging adatto che possa essere affiancate per singole immagini per produrre una singola immagine composita; per esempio, uso il " photomerge " opzione dal Menu File nel software di imaging elencati nella Tabella materiali.
   4. Aprire le immagini di fluorescenza di GFP con un software di analisi di immagine adatta (ad es., ImageJ). Cerchio di fibre muscolari individuali utilizzando il " strumento ROI " e registrare l'intensità di fluorescenza significa per ogni fibra.
      1. Calcolare l'intensità massima GFP (fluorescenza) considerando la media dell'intensità di fluorescenza significa 10 fibre che mostrano l'alta espressione di GFP e hanno morfologia normale. Calcolare l'intensità massima di GFP % per ogni fibra dividendo l'intensità di Florescence significa per ogni fibra per la massima intensità di GFP e moltiplicando per 100. Catalogare i risultati dell'analisi per ogni muscolo TA GFP come mostrato in Figura 3E.
3. Lo studio della fibra di muscolo integrità e myonuclear posizione di etichettatura immunofluorescente di desmina e 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), rispettivamente.
   Nota: Indicare una serie di vetrini preparati, come sopra, per studiare l'etichettatura desmin nelle fibre muscolari.
   1. Fix sezioni con paraformaldeide al 2% in PBS per 10 min. lavare le sezioni tre volte con PBS.
      Attenzione: Indossare appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE) maneggiare quando si maneggia la paraformaldeide.
   2. Sezioni di blocco con albumina di siero bovino 3%, diluito in PBS contenente 0,01% Triton-X100 per 30 min. Questa soluzione bloccante è denominata di seguito il DILUENTE primario.
   3. Diluire l'immunoglobulina anti-desmina coniglio G (IgG) nel diluente primario (1: 200).
   4. Dopo il blocco è completo, si applicano gli anticorpi primari diluiti sulle sezioni e incubare per una notte in frigorifero a ~ 4 ° C. lavare le sezioni di una volta (5 min) con PBS contenente 0,1% Triton X-100. Questa soluzione è denominata di seguito il primo tampone di lavaggio.
   5. Lavare le sezioni 3 volte (5 min a lavaggio) con PBS.
   6. Preparare l'anticorpo secondario diluendo goat anti-rabbit IgG (coniugata con colorante fluorescente rosso) in PBS contenente 0,01% Triton X-100.
   7. Applicare l'anticorpo secondario diluito sulle sezioni e incubare a temperatura ambiente (~ 23 ° C) per 60 min.
   8. Lavare le sezioni di una volta (5 min) con il primo tampone di lavaggio. Lavare le sezioni 3 volte (5 min a lavaggio) con PBS.
   9. Applica DAPI per 3 min lavare le sezioni 3 volte (1 min a lavaggio) con PBS. Applicare ~ 50 µ l del mezzo anti-dissolvenza sulle sezioni e coprioggetto in vetro. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente.
   10. Uso del microscopio luce e fluorescente (Vedi Tabella materiali), studio il colorante fluorescente di sezioni di serie con un 10x obiettivo e un filtro appropriato per la visualizzazione rosso.
   11. Raccogliere le immagini digitali (~ 15) dei campi visivi sovrapposti per coprire l'intera sezione trasversale del muscolo TA. Raccogliere le immagini di fluorescenza di DAPI etichettatura per ciascuno dei campi visivi passando per l'impostazione di filtro appropriato.
   12. Open e analizzare le immagini utilizzando un software di imaging adatto come descritto nei passaggi 7.2.3 - 7.2.4.
       Nota: Studiare immagini per identificare, quali fibre muscolari sono danneggiati (desmin negativi), che le fibre muscolari hanno centrale nucleazione (desmin positivo fibre che hanno nuclei DAPI-labeled situati internamente piuttosto che marginalmente) e, quali aree della sezione infiammazione e/o fibrosi (aree che presentano molti nuclei DAPI-labeled raggruppati insieme, ma sono privi di fibre muscolari).

Risultati

Alle 3 giorni post-MIME, il donatore EDL che viene impiantata da MIME è contenuto all'interno del compartimento muscolare TA di host (Figura 2A–C). Come previsto, le sezioni trasversali del muscolo TA dai topi di donatore, studiò con ottica di fluorescenza, non mostrano fluorescenza verde perché non esprimono GFP (Figura 2D). In contrasto, le sezioni trasversali del muscolo TA da topi di host che non sono impiantati con tessuto del donatore, mostrano fluorescenza verde uniforme nelle fibre muscolari TA, le fibre esprimono GFP (Figura 2E). Nelle sezioni trasversali dei muscoli impiantati da MIME con tessuto muscolare donatore, c'è una linea di demarcazione tra l'host fibre muscolari (GFP +) e il donatore fibre muscolari (GFP-). Le immagini di contrasto di fase dei campi visivi illustrati nella Figura 2D–F sono presentate in Figura 2E'–F' e suggeriscono che ci sono in effetti le fibre muscolari sono presenti nelle regioni dove non c'è nessun GFP segnale.

Ai 14 giorni post-MIME e BaCl₂ iniezione, attraverso lo Studio seriale Croce sezioni del muscolo TA che vengono lasciati senza etichetta o sono etichettati con anticorpi anti-desmina (Figura 3), apprendiamo che il segnale GFP è espressa da tutte le fibre di muscolo nella muscolare non trattata dai topi di host, ma non nel muscolo MIME-trattati (desmin rosso etichettatura rileva praticabile fibre muscolari). Nel muscolo host TA trattato con MIME e BaCl₂ iniezione, la miogenesi donatore-cellula-derivati è evidente dalla presenza di numerose fibre muscolari desmin(+) che non mostrano nessun segnale rilevabile di GFP (Figura 3–D, 3 C' –D'). Chimeriche fibre muscolari derivanti dalla probabile fusione delle cellule miogeniche host e donatore può essere rilevate da livello basso a livelli moderati di fluorescenza di GFP esibito da queste fibre. Numerose fibre chimerici appaiono in tutta l'intero diametro del muscolo TA suggerendo che il donatore SCs sono in grado di migrazione diverse centinaia di micron entro il epimysium del muscolo host. Quantificazione di GFP + fibre è mostrata in Figura 3E. La figura 4 Mostra immagini di alto ingrandimento di sezioni trasversali seriale di un intero MIME + BaCl₂ trattati TA muscolo.

Figura 1 . A pochi passi coinvolti nel minimamente invasiva muscolo Embedding (MIME).
MIME è eseguito in anestesia generale. Si tratta di immissione ~ 10 mg del muscolo di donatore (topo donatore EDL) in soluzione di Ringer e legando le suture Guida alle sue estremità (A). Un ago calibro 18 viene passato attraverso l'asse longitudinale del muscolo host (B) e il tessuto del donatore viene disegnato attraverso la pista dell'ago (C). Il tessuto del donatore è rimasto incorporato nel muscolo host (D), le suture di guida sono tagliate e i fori di spillo sono sigillati con adesivo del tessuto (E). Le ferite di ago sigillati sono indicate con le frecce (F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 . Studi del muscolo TA 3 giorni dopo MIME.
Muscolo di host raccolti 3 giorni dopo MIME; Nota segni di punture su host TA (frecce; A-B). Ulteriormente i dati confermano che il mouse incorporato donatore EDL è ensconced all'interno del vano di muscolo TA (B-C). Immagini di fluorescenza del muscolo TA sezioni trasversali mostrano alcuna fluorescenza verde nel muscolo di selvaggio-tipo TA (D), brillante fluorescenza verde nel muscolo TA NSG-GFP (E)e una distinzione tra host e donatore del muscolo nel muscolo NSG-GFP TA ai 3 giorni Post-MIME (F). Le immagini di contrasto di fase dei campi visivi in D-F sono mostrate in D'-F', rispettivamente. La linea rossa in pannelli F e F' Mostra la linea di demarcazione fra il tessuto dell'ospite e del donatore. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 . Gli studi del muscolo TA 14 giorni dopo MIME.
I dati raccolti 14 giorni post-MIME sono presentati. Il segnale rosso è da etichettatura immunofluorescente del desmin (un segnale positivo per il desmin denota che miofibre sono vitali), il segnale blu è da DAPI (nuclei di macchie), e il segnale verde è da GFP. In muscolo di controllo TA (arto posteriore destra) raccolto dal mouse host, come previsto, quasi tutte le fibre muscolari sono positivi per il desmin, suggerendo che queste fibre muscolari sono vitali (A; segnale rosso). Inoltre, basato su colorazione DAPI, è evidente che mionuclei di quasi tutte le miofibre si trovano perifericamente, come ci si aspetterebbe in muscolo sano (A; segnale blu). Le sezioni di serie del muscolo TA di controllo mostrano che, quasi tutte le fibre muscolari sono verde brillante, che implica che siano positive per GFP. In MIME + BaCl₂ -trattati muscolo TA (arto posteriore sinistro), miogenesi donatore-cellulo-mediata è evidente dalla presenza di numerose fibre muscolari desmin(+) che non mostrano rilevabile fluorescenza di GFP (C-D, C'-D'). Fibre muscolari desmin(+) con bassa a moderata fluorescenza GFP (fibre muscolari chimeriche) sono presenti in tutto il diametro dell'intero muscolo TA, suggerendo che, MIME fornisce donatore SCs che possono migrare all'interno del epimysium del muscolo TA e promuovere miogenesi donatore-cellula-derivati. A'-D' sono ad alto ingrandimento immagini delle regioni all'interno le caselle blu in A-D. Quantificazione di fibre GFP(+) e centralmente nucleate fibre sono mostrati in E. Scala bar = 100 µm (A-D) e 50 µm (A'-D'). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4 . Prova di un danno diffuso e rigenerazione 14 giorni dopo l'iniezione di₂ MIME e BaCl.
Alto ingrandimento, seriale sezioni trasversali di un muscolo intero del TA MIME + BaCl₂ trattati sono presentate. I dati mostrano che molte fibre muscolari, che sono moderatamente o fortemente GFP + centralmente individuato i nuclei (A-B; rosso segnale nella A è da desmin, blu segnale nell'A è da DAPI e segnale verde in B è da GFP). Questi dati suggeriscono che la degenerazione e rigenerazione dopo BaCl₂ iniezione non influisce espressione di GFP. In questo contesto, la presenza di fibre muscolari centralmente nucleate in MIME + BaCl₂ trattati TA muscolo, con espressione di GFP poco-a-no, suggerisce che queste fibre sono il risultato probabile di miogenesi (o rigenerazione) con contributo significativo da GFP - cellule miogeniche. Queste osservazioni possono essere ulteriormente verificate in immagini ad alto ingrandimento dei campi selezionati (C-F; C e D ed E e F, rispettivamente, sono sovrapposte le regioni da seriale sezioni trasversali; codifica a colori dei bordi dell'immagine indicano la posizione di quelle regioni nella A e B). Scala bar = 100 µm (A-B) e 50 µm (C-F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la tecnica sperimentale romanzo noto come MIME, sviluppata nel nostro laboratorio, per impiantare il tessuto muscolare donatore nel tessuto muscolare ospite. Si tratta di un adattamento di un muscolo aperto l'innesto di tecnica che ha già dimostrato di essere efficace nella promozione della miogenesi donatore-cellula-mediata in un host muscolo^9,10,17.

L'obiettivo di MIME è non per abilitare attecchimento del donatore tessuto del muscolo stesso nel muscolo host (attualmente non sappiamo se in questo caso), ma piuttosto di fornire una fonte di donatore SCs che possono contribuire alla miogenesi nel muscolo host sotto condizioni che stimolano m uscle rigenerazione. La nostra speranza è che dopo MIME è stato ottimizzato e testato in studi di base e preclinici, potrebbe fornire spunti preziosi per guidare le terapie cliniche finalizzate ad aumentare la rigenerazione muscolare in muscoli scheletrici che hanno subito la perdita muscolare myogenic.

Ci sono numerose domande che devono ancora essere risolte per quanto riguarda come MIME potrebbe essere tradotta in una terapia clinica, ad esempio: come sarebbe controllare la qualità del tessuto del donatore? Come sarebbe controllare il rigetto immunitario del donatore di tessuti e cellule? È il tessuto di donatore cancellato dopo fornire alle cellule per miogenesi e lascia dietro una cicatrice fibrotica? Il tipo di fibra del muscolo di donatore e/o host influisce la miogenesi donatore-cellula-mediata? Quali muscoli praticamente possono beneficiare di MIME? Attualmente stiamo ampliando i nostri studi per valutare se MIME è sicuro ed efficace, per identificare i trattamenti aggiuntive che possono aumentare la miogenesi donatore-derivati e rispondere a molte delle domande, sopra elencate.

Dopo aver completato il nostro test di trapianto allogeneic del mouse-a-mouse con MIME, il nostro prossimo passo è quello di eseguire umani-a-mouse MIME con tessuto cadaverico umano per valutare il potenziale myogenic del tessuto muscolare cadaverico. Ci aspettiamo che questi esperimenti porterà ad una nuova linea di ricerca di base e traslazionale, che coinvolge il tessuto del muscolo da donatori, che sono registrati a iniziative come il programma del lascito di corpo per l'educazione e il programma del dono della vita per la donazione di organi .

Rappresentativo dei dati presentati in questo manoscritto suggeriscono che a 14 giorni dopo MIME, ci sono parecchi myofibers vitali che mancano di GFP o hanno bassi livelli di GFP. La nostra interpretazione di questi dati è che le cellule satellite di GFP-donatore ha contribuito alla miogenesi nel muscolo host. Abbiamo effettuato questo esperimento in preparazione per l'impianto di tessuto cadaverico umano in un muscolo di mouse host. Per dimostrare inequivocabilmente che le cellule del donatore satellitare contribuiscono alla miogenesi nel muscolo host seguendo MIME, sarebbe utile per l'impianto del tessuto donatore che esprime un reporter fluorescente, che può essere facilmente distinto dal GFP (ad es., rossa proteina fluorescente esprimendo impiantato nel muscolo di GFP + host del tessuto donatore).

Questa tecnica è limitata principalmente dalla natura di SCs presenti nel tessuto del donatore. Se il SCs nel tessuto del donatore è vitale, che la tecnica è che può agevolare la miogenesi donatore-cellulo-mediata, mentre se non sono vitali, non può verificarsi la miogenesi. Tuttavia, poiché SCs sono molto resistenti e sono vitali per circa 2 settimane post-mortem, è molto probabile che per gli scopi sperimentali, il tessuto di donatore che viene impiantato in pochi minuti dopo il raccolto faciliterà donatore-cellula-mediata miogenesi¹³ . Inoltre, come accennato sopra, è possibile che dal tessuto del muscolo intero (che contiene SCs, matura le fibre muscolari, così come muscolo-residente fibroblasti) è incorporato nel muscolo host, potrebbe verificarsi la fibrosi. Tuttavia, questa ipotesi deve essere esaminato empiricamente. La letteratura sui danni muscolari derivanti da contrazioni pregiudizievole, cryoinjury e sperimentale myotoxins, suggerisce che le cellule immuni (principalmente macrofagi) sono in grado di efficacemente sgombero detriti cellulari da fibre danneggiate e rimodellamento del matrice extracellulare¹⁸. Pertanto, è possibile che dopo l'iniezione di MIME e BaCl₂ , finché le cellule immuni ospite hanno accesso alla degenerazione fibre muscolari donatore potrebbe cancellare detriti, lasciando dietro di sé solo il donatore SCs. Infine, nella misura della miogenesi donatore-derivati è dipenda dalla quantità di tessuto muscolare di donatore che è incorporato nel muscolo host. In ordine per il vano di muscolo di host essere completamente ripopolato da donatore-cellula-derivati miofibre, sarebbe necessario un metodo come irradiazione X o gamma di ablazione muscolo host SCs e anche richiedono procedure ripetute di MIME.

È stato dimostrato che esporre chirurgicamente un muscolo di host e la sutura di un pezzo di tessuto erogatore sul muscolo del host può agevolare la miogenesi donatore-cellula-mediata^9,10,17. Questo approccio chirurgico aperto è stato utilizzato in passato per monitorare la progressione della miogenesi e generare modelli murini di malattie del muscolo umano. L'aspetto innovativo della tecnica del MIME è che è come minimo dilagante e non coinvolge chirurgicamente esponendo il muscolo di host. Questo riduce il rischio di infezione iatrogenica e il grado di disagio nell'animale ospite, rendendolo quindi più fattibile per eseguire ripetutamente MIME sul muscolo stesso host, se necessario.

Possiamo anticipare che la tecnica MIME potrebbe essere un affinamento adatto per il metodo chirurgico aperto è attualmente seguito per impiantare il tessuto muscolare donatore in un mouse di host. Questo potrebbe accelerare la generazione di modelli murini umanizzati, incorporando muscolo biopsiato umano nel muscolo del mouse host. Inoltre, basata sui nostri dati preliminari da innesto del mouse-a-mouse, anticipiamo che MIME sarà efficace nel raggiungere la miogenesi donatore-cellula-mediata dal tessuto donatore cadaverico umano come donatore SCs sono vitali. Infine, con ulteriori test e validazione, speriamo che la tecnica MIME aiuterà a sviluppare nuove terapie per facilitare la miogenesi donatore-cellula-mediata in esseri umani con le malattie muscolari.

Il successo della tecnica MIME dipende criticamente proprio incorporamento del tessuto donatore all'interno del compartimento Fascia (epimysium) del muscolo del host. Solo se il tessuto del donatore viene inserito all'interno del compartimento muscolare host, sarà in grado di fornire SCs al muscolo di host in modo preciso. Se il tessuto del donatore viene inserito di fuori del muscolo di host, non è chiaro quale sarebbe il suo destino. Nel nostro modello sperimentale per MIME, usiamo il muscolo TA come il muscolo di host, dal momento che è prominente e superficialmente collocato nella parte anterolaterale della gamba. Le dimensioni, l'orientamento e la posizione anatomica del muscolo TA, lo rende facile confermare che il tessuto del donatore sia posizionato correttamente all'interno del muscolo di host TA dopo MIME. In questa carta, abbiamo fornito la prova sperimentale che il tessuto del donatore realimentazione incorporati all'interno di host muscolo TA a 3 giorni post-MIME e che non c'è donatore-cellula-mediata miogenesi nel muscolo host alle 14 giorni post-MIME.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
NSG-GFP mice	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)	Stock #021937	Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)	Stock #000664	Control donor mice
Tabletop isoflurane vaporizer	VetEquip (Livermore, CA)	Item #901801	Inhaled anesthesia system
Magic depilatory crea	Softsheen Carson (New York, NY)	N/A	Razorless hair removal cream
4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures	Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD)	SUT106631	Guiding sutures for donor tissue
VetBond veterinary tissue adhesive	3M (Maplewood, MN)	Catalog #1469Sb	Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure
Barium chloride	Ricca Chemical Company (Arlington, TX)	Product #R0854000-500A 854-16	Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration
Deltaphase isothermal gel heating pad	Braintree Scientific (Braintree, MA)	Item #39DP	Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia
HM525NX cryostat	ThermoFisher (Waltham, MA)	Catalog #HM525NX	Cryostat to make frozen sections of muscle
Vectashield Antifade Medium	Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA)	Catalog Number: H-1000	Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples
Rabbit anti Desmin Antibody	Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA)	RB9014P	Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling
Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody	ThermoFisher (Waltham, MA)	Catalog#: A-21069	Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Seracare (Milford, MA)	Catalog #5930-0006 or 71-03-01	Reagent for fluorescent labeling of nuclei
Axio Scope.A1 microscope	Carl Zeiss (Peabody, MA)	Product #Axio Scope.A1	Light and fluorescence microscope
Photoshop CS4	Adobe Systems (San Jose, CA)	Photoshop CS4	Imaging Software for perform image tiling
Image J	National Institutes of Health (Bethesda, MD)	Image J for Windows 64-bit Operating System	Imaging Software for quantitative fluorescence analysis