鶏の羽根や化粧品への応用からケラチンを加水分解物の準備

要約

プロトコルの目的はアルカリ酵素加水分解による羽毛ケラチン加水分解物を準備して化粧品軟膏ベースにケラチンを加水分解物が皮膚バリア機能を向上させる追加するかどうかをテストするのには (ハイドレーションを高めると経皮水分喪失を減少)。検査は、男性と女性のボランティア。

要約

ケラチン加水分解物 (KHs) ヘア化粧品の確立された標準的なコンポーネントであります。KH の保湿効果を理解することは、スキンケア化粧品で有利です。議定書の目標は: (1) アルカリ酵素加水分解による KH に鶏の羽根を処理し、透析による浄化、皮膚の水和が増大し、減少によって皮膚バリア機能を向上させる軟膏ベース (OB) に瀬を追加をテストするには (2)経皮水分喪失 (TEWL)。アルカリ酵素加水分解中に羽が高温アルカリ環境ではし、タンパク質分解酵素で加水分解、温和な条件下で培養しました。KH の溶液を透析、真空乾燥、微粉末に粉砕します。水中油型エマルション (O/W) 2 を含むから構成される化粧品処方、4、および 6 の重量 % (OB の重量に基づいて) KH の用意しています。10 人の男性に KH の保湿のプロパティをテストが行われ、1、2、3、4、24、および 48 h. 試験製剤の間隔で 10 人の女性に脱脂の掌側の前腕のサイトで広がっています。角質層 (SC) の肌の水分補給は最も世界的に使用される、簡単な方法の一つである皮膚の静電容量を測定することによって評価されます。TEWL は、定義された領域と皮膚から期間ごと運ばれる水の量の測定に基づいています。両方のメソッドは完全に非侵襲的です。KH は、優れた閉塞;OB に KH のさらに、によってそれをもたらすアプリケーション後 TEWL を 30% 削減。SC; に表皮の下の層から水をバインドと、KH は、保湿剤としても機能します。OB で最適な KH 足し算を男性と 22% で水和の 19% の上昇に女性の上昇が発生します。

概要

食肉処理場、食品工業および日焼け業界年間固体ケラチン副産物-ウール、羽、毛、ひづめの音、爪、角、等の膨大な量を生成します。最新の統計データによると、ライブの総重量鶏、七面鳥、アヒル、および米国の他の虐殺された家禽は¹年あたり 625 億ポンドEU では年間約 287 億ポンドです。羽の家禽の合計重量の 8.5% までことを考えると、単独で米国は毎年廃棄物の羽²の約 53 億ポンドを生成します。

ケラチンは、強くとレンダリングの処理が困難なジスルフィド架橋だから耐薬品性を示すタンパク質です。水溶性の製品を取得するには、架橋結合を切断し、おそらく³ペプチド結合の加水分解を実施する必要があります。二硫化物橋の胸の谷間は、次のパターン^4,5によるとチオール アニオンの反応を続行可能性があります。

S_、^- + -S_bS_c-↔ – S_b^- + -S_、S の_c^-

非常に高い ph で、ジスルフィド結合の加水分解も表示され、パターン⁶に従い

-SOH + オハイオ州^- →-S^- -^- SS

(PH 約 8) 温和な条件下でも sulfitolysis は、次のパターンに従って起こる。

-SS- + HSO₃^- →-SH + SSO-₃^-

ケラチンを分解する最も経済的な方法は微生物の内訳は、加工や高分解効率 (約 90%)^7,8の間に穏やかな反応条件によって特徴付けられる。Keratinases は、土壌とケラチン廃棄物⁹から分離されたいくつかの細菌によって生成されます。微生物 keratinases は堅く、強く架橋ケラチン構造¹⁰を加水分解し、準備結果 KH はタンパク質が豊富で水溶性、検出された必須アミノ酸の損失なしで¹¹。

このようなタンパク質は水に溶け、与えられたシステムが透明で、ペプチドの再集計は避けるために、化粧品の準備 (例えば乳液、ローション、ゲル) で蛋白質を組み込むために要件を確保します。疎水性相互作用。したがって、加水分解コラーゲン、エラスチン、ケラチンなどのタンパク質の加水分解物に適用する一般的な勧めします。化粧品エマルジョンに加水分解液を追加するときは、手順を実行して、加水分解は最初水に溶解したことを確認します。いくつかの場合、望ましい蛋白質 (または、加水分解物)、アルコールまたは¹²の他の有機溶剤に可溶です。

KH は、シャンプー、コンディショナー、ローションと髪の毛と同様、マスカラー、マニキュア、目メイク エージェントに栄養血清で通常紹介されています。通常宣言 KH 効果髪を平滑化、保護膜の形成が含まれてまたは爪の構造、高まり可塑性と製品の整合性を調節し、泡¹³の形成を助長、処理層の外観^,14. それが KH 低減表面張力、化粧品で補充が乳化剤クリームを安定させるために追加量の削減を促進するそれ故にも示されています。KH は肌、目、髪、洗浄剤 (界面活性剤) によって引き起こされる炎症の影響を制限し、洗浄剤 (例えば脱水肌、硬度および減らされた柵機能の組織上の任意の潜在的な副作用を減らす肌のために)。加水の高いバッファリング機能は、化粧品の pH を安定させるために悪用も長さの短いペプチドがある大きい緩衝効果^15,16。KHs は、髪と爪化粧品だけでなく、皮膚のケアのための製品で利用されている、標準コンポーネントとして定着した、KH の保湿の効果に関する研究は現代文学で表示されません。

アルカリ酵素技術、KH にケラチン副産物を処理するためには、化粧品添加剤^17,18,19,20数の影響上のプロセスでは、アクティブなテスト^,21,22. 2 段階アルカリ酵素加水分解微生物プロテアーゼを用いた鶏の羽根の利点が穏やかな反応条件下で高効率を実現、kh 社の品質は非常に強い酸で加水分解とは対照的に高またはアルカリ。最初の段階で羽に部分的にケラチン構造を混乱させるし、うねり; 羽アルカリ環境で高温孵化します。pH を調整した後羽の 2 番目の段階で温和な条件下でのタンパク質分解酵素で加水分解します。透析の瀬では、蛋白質の高いコンテンツを所有しています。

ここで説明したメソッドの目的はアルカリ酵素加水分解 KH に家禽の羽の処理、乳化化粧品に適用される KH の保湿のプロパティの効果をテストします。体内機器の非侵襲的方法、保湿特性を調べた。SC の皮膚水分補給とバリア機能を測定するための最も頻繁な方法には (コンダクタンスや容量) の皮膚の電気的特性の測定が含まれます。赤外マルチ スペクトル想像法 (NIM)、核磁気共鳴分光法、光干渉断層計、または過渡的熱伝達²³近く SC 水和反応を調査するための異なる方法があります。SC の TEWL に相関する SC のバリア機能と換気チャンバー法、非換気チャンバー オープン商工会議所法²⁴測定されます。

配合で、モデルのプロパティは、3 種類のプローブのマルチ プローブ アダプター MPA 5 を使用して決定されます。最初の 1 つ、corneometer CM 825、対策皮膚水和皮膚の表面の電気容量の変化を評価することによって測定コンデンサーは corneometric 単位で皮膚表面の静電容量の変化を示しています。Corneometer は、皮膚水和²⁵の相対評価だけを与えます。TEWL の 2 番目のプローブ、tewameter TM 300 が直接使用されるない皮膚から (Fick の拡散の法律に基づいて開いた区域楽器) で蒸発する水の密度勾配を測定するセンサー (温度・湿度) の 2 つのペアで定義されているエリア、時間帯 (g/m²/h) ごと運ばれる水の量を示します。このメソッドは、皮膚バリア機能²⁶のもわずかな中断を検出できます。皮膚の pH は障壁の一つの指標と SC²⁷の抗菌機能です。皮膚マントルの酸性度は、MPA 5 駅に接続された (3) 皮膚 PH 905 プローブで測定しました。この特別に設計されたプローブから成っている平たいガラス電極による皮膚への接触を電圧計に接続されています。システムは、プローブの上部に測定した半固形状の非常に薄い層を取り巻く水素陽イオンの活動のための潜在的な変化を測定します。電圧の変化は pH²⁸として表示されます。

3 つのセクションに分かれて実験を提案する: 化粧品の準備 (2) の (塩と低分子画分を除去する)、透析による 2 段階アルカリ酵素加水分解し精製羽鶏から KH の準備 (1)2、4、および 6% を含む製剤 TEWL、水和を皮膚や肌の pH、KH と KH のプロパティを測定することによってテストする (3)。実施した平均年齢 27.2 歳で 10 人の女性と平均年齢 26.2 歳の 10 人。ボランティアとテスト自体の選択方法を行った被験者²⁹; を利用した生物医学研究の国際的倫理的原則に従いすべての人は、研究の包含前にインフォームド コンセントを与えた。開始、テスト前にボランティアは、それらの健康状態に関するアンケートを完了するように求めていた。ボランティアの前に 24 時間の間に、テスト期間中にテスト サイトと周辺地域にどんな化粧品を適用しないようにすることを約束さらに、彼らはのみ水を実行して簡単な夜洗浄を許されました。

プロトコル

ボランティアは、従業員や私たちの大学の学生の間で採用されました。選択する方法によると行った「医の国際倫理指針関与人間被験者。懇談会 (2002) ジュネーブ医科学国際組織。」KH はヘアケア製品(シャンプー、コンディショナー等)で使用される一般的な化粧品の成分とそれ故に制度上の審査委員会からの承認は必要ではありません。

1. KH にプロセス鶏羽

1. 養鶏場の鶏の羽を収集します。
2. 十分な過剰の新鮮な (コールド) を実行している水と鶏の羽根から血液の残骸や不溶性不純物を洗い流します。平らなプレートに羽を置き、50 ° C で一晩乾燥
   注: プロトコルはここで一時停止することができます。
3. また最終的な細かさ 1.0 mm. に 50 g 乾燥羽 (ミディアム ハード、ソフトのサンプル材料、繊維材料に適した) による切削を挽く、研磨羽の最終的な細かさが高い、しかし、3.0 mm にすることができます。
   注: プロトコルはここで一時停止することができます。
4. 羽を脱脂します。
   注: 家禽の羽を脱脂の最も効果的かつ経済法は、脂肪分解酵素を使用しています。
   1. 温度制御ステンレス鋼 27 L ボイラー容器、水 40 ± 2 ° C の重量比 1: 75 まで予熱で羽をミックスします。脂肪分解酵素を追加 (活動 100 KLU/g) ゆっくりと 1.5-2.0% (で重量を量った乾燥羽に関連) の量の 5 分のオーバーヘッド攪拌で内容をかき混ぜます。
   2. 9.0 ± 0.2 1% 水酸化ナトリウムまたは 1% H₃PO₄ソリューションを追加することにより、脂肪分解酵素の活性の最大値に対応する値に混合物の pH を調整します。オーバーヘッドの攪拌器と 5 分の混合物をかき混ぜるし、チェックして再実験室ベンチ mV/pH メーターを使用して ph を調整します。
   3. 軽く 40 ± 24 h のオーバーヘッド攪拌機で混合物をかき混ぜる 0.5 の ° c.また、40 ± 0.5 ° C で混合物を孵化、孵化の最初の 6 時間の間に 1 時間間隔で内容をかき混ぜます。
   4. (100 μ m サイズ) 目の細かいふるいを通して混合物をフィルターし、新鮮な (コールド) を実行している水の流れと脱脂の羽を洗ってください。一晩乾燥室で 50 ° C で平板に羽を乾かしてください。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。
5. 鶏羽毛加水分解の最初の段階を実行します。羽 0.3 %koh 水溶液を混ぜて、重量比 1:50 に、60 ± 0.5 ° C 24 時間オーバーヘッド攪拌で軽くかき混ぜます。混合物の pH は、インキュベーションの終わりに約 11.0 培養開始時約 12.5 から減る。加水分解の最初の段階を終えた後に %1 を追加することによって 10% H₃PO₄ (この場合は、9.0 ± 0.2 のレベル) にタンパク質分解酵素の活性の最大値に対応するレベルの混合物の pH を調整水酸化ナトリウム。
6. 鶏羽毛加水分解の第 2 段階を実行します。5.0% (秤量の加水分解の最初の段階の初めに羽の量の乾物に関連) の投与量でのタンパク質分解酵素の混合物に追加します。優しく 60 ± 0.5 ° C、8 h でオーバーヘッド攪拌でかき混ぜる沸点 (100 ° C) (同じステンレス 27 L ボイラー コンテナー) の混合物を加熱し、酵素を不活化する 10 分煮る。
7. わずかな真空圧力; でブフナーの低密度のフィルター ペーパーを通してフィルタ リングによって不溶残から KH (1.6 の手順で準備) のソリューションを分離します。また、遠心分離機を使用します。
   注: プロトコルを一時停止できるここ数日間 5 ± kh 社のソリューションが格納されている場合 1 ° C
8. プラスチック製のバケツ (直径 x 26 cm 高さ 26 センチ) で小さなペプチドと塩を削除する 12 K MWCO 膜を用いた KH を dialyze します。透析チューブに KH 溶液 400 mL を注ぎ、室温; 80 h の蒸留水 4 L に対して dialyze18、36、および 60 h 後蒸留水を変更します。
9. 1,000 cm²プレートの面積、真空乾燥 40 ± 0.5 ° C で薄膜に一晩、微粉末に粉砕、乾燥器で密閉容器に保管する 500 mL の比 (例えばシリコーン) 付着防止プレートに KH の透析解決にキャストします。
   注: プロトコルを一時停止できるここ数ヶ月間瀬粉は乾燥した場所に格納されている場合。

2. kh さん化粧品製剤を準備します。

注: テスト用 OB だった商業親水性 O/W クリーム ベース、アクア、パラフィン、パラフィン液相、セテアリル アルコール、ラウレス 4、水酸化ナトリウム、カルボマー、メチルパラベン、プロピルパラベン ・で構成します。

1. 2、4、および 6% を含む製剤を準備 (軟膏の基本重量) に従い KH。ポリエチレン容器 (直径 x 10 cm 高さ 7 センチ) に瀬粉の量の重量を量るし、定式化の総重量を保証する金額で OB に等しい 50 g 追加表 1のレシピを参照してください。

香粧品配合	軟膏ベース [g] の重量			ケラチン加水分解物 【 g の重量			総重量 [g]
軟膏ベース	50			0			50
軟膏ベース + 2% KH	49			1
軟膏ベース + 4% KH	48			2
軟膏ベース + 6% KH	47			3

表 1: 重量の量化粧品処方を準備する軟膏ベースとケラチン加水分解物。

2. 134.16 x g で 10 分間の 3 刃研究室ミキサーで混合物を均質化し、機械的頭上式撹拌機を使用してミックスします。5 ± 1 ° C で準備された製剤を維持し、2 h 使用する前に室温にそれらを暖めます。
   注: kh さん OB の混合物を均質化は、非デジタルの攪拌機と同様に実行できます。非デジタル攪拌にも (rpm) でおおよその速度と体重計があります。穏やかな攪拌がこのステップの最高を仕事します。
   注: プロトコルを一時停止できるここまで 5 ヶ月製剤が 5 ± で格納されている場合 1 ° C

3. 肌の水分補給を測定、TEWL、pH、KH のプロパティのテストします。

注: は、23 ± 2 ° C でエアコン ルームと 56 ± 3% の相対湿度ですべての測定を実行します。

1. 場所 5 のフィルター ペーパーのストリップ (2 × 4 cm サイズ) 生理のソリューションに (0.90 %nacl) とソリューションで約 1 分間のまま。
2. 右前腕と左の前腕の内側に 3 つの内側に 2 つのストリップを適用、4 h の絆創膏で固定します。この手順は、皮膚を脱脂してサイトのスキンの個々 の特性を排除することです。4 h 後ストリップを削除し永続的なペンを持つデンマークの領域、図 1を参照してください。

図 1: 左と右の手足の前腕に試験製剤の位置の方法。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

3. 0.1 mL 注射器を使用して脱脂前腕サイトの各スポットでテスト済みの製剤を適用し、マークされた表面全体に 。左の前腕にしない (それはコントロール) 最初のサイトに何かを適用、2 番目のサイトに OB と OB + 2 を適用第 3 %kh。適用 OB + 4 %kh と OB + 6% 右腕に KH。
4. 各サイトと (1、2、3、4、24、および 48 h) 各間隔で各サンプルを測定し、肌の水分補給、肌 TEWL、TEWL 計プローブと 15 の測定値と皮膚 pH の皮膚 pH 計プローブを読んで 1 皮膚水和計プローブ 5 測定値を取る。テスト期間中にテスト現場や周辺地域にどんな化粧品を適用するボランティアを許可しません。簡単な夜洗浄水を実行してもかまいません。
   注: プロトコルはここで一時停止することができます。
5. 記述統計、表計算ソフトを使用しての基本数値特性による結果の測定値を処理します。5 の水和は、各サンプルの測定を測定値から最低および最高の測定値を無視し、のみ 3 測定のための算術平均と標準偏差を計算します。各サンプルの測定 15 TEWL 測定から最初の 5 を無視してのみ 10 測定のための算術平均と標準偏差を計算します。

結果

ここに示す手順にしたがって調製された KH (図 2参照) は高蛋白質含有量が付いている水に容易に溶ける色で黄色 (無機固体を表す < 2.0%); KH の 1.0% の解決の pH は 5.3 との要件を満たす化粧品グレードの加水分解物。50 g の原料から KH の収量は約 30% であります。KH の分子量分布は SDS-PAGE によって決定され、図 3に示します。

ディスカッション

アルカリ酵素加水分解の利点は、kh 社の今後の用途に合わせて変更できることです。たとえば、製品の軽く茶色の色が障害ではなく、ヘアケア化粧品のアプリケーションで加水分解高温適用できます KH の歩留まりの向上に 。さらに、技術のプロシージャの両方の段階の間に長い処理時間に大きく影響プロセス全体効率-KH の収量が 85% に上昇します。

水和測定結果は、測...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material or chemicals
LIPEX 100T	Novozymes	LJP30020	Lipex - enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 100 KLU/g
Savinase Ultra 16L	Novozymes	PXN40001	Savinase - enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 16 KNPU-S/g
Potassium hydroxide, KOH	Sigma-Aldrich	302510289	Potassium hydroxide, KOH, 97,0 %, Mr 56,11
Phosphoric acid solution, H3PO4	Sigma-Aldrich	W290017	Phosphoric acid solution, H3PO4, 85 wt. % concentration in water, Mr 98,00
Sodium chloride physiological solution	Sigma-Aldrich	52455	Tablets of BioUltra NaCl physiological solution; 1 tablet in 1000 mL of water yields 0.9 % NaCl
Sodium hydroxide, NaOH	Penta s.r.o.	40216	Sodium hydroxide, NaOH, 97,0 %, Mr 40,00
AmiFarm (Cremor base-A)	Fagron	608425	Hydrophilic oil in water (O/W) cream base; the composition: aqua, paraffin, paraffin liquid, cetearyl alkohol, Laureth 4, sodium hydroxide, carbomer, methylparaben, propylparaben.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
IKA EUROSTAR POWER control-visc stirrers	IKA-labortechnik	Z404020	Digital laboratory stirrer, for tasks up to the high viscosity range, 230V, 1/cs
IKA Propeller stirrer, 3-bladed	IKA-labortechnik	R 1381	Propeller stirrer, 3-bladed, stirrer Ø: 45 mm, shaft Ø: 8 mm, shaft length: 350 mm
Dialysis tubing closures	Sigma-Aldrich	Z371017-10EA	Dialysis tubing closures, red, size 110 mm
Dialysis tubing cellulose membrane	Sigma-Aldrich	D9402-100FT	Dialysis tubing cellulose membrane, average flat width 76 mm (3.0 in.)
DOMO Pot with stailess, LCD	DOMO Elektronic	DO42325PC	Preserving boiler stainless steel, 2000 W, 27-L container (diameter 37 cm, height 30 cm), temperature control 30-100 ° C, operation LCD display
Hettich zentrifugen Universal 32	Gemini bv	2770 GS1R	Mid bench centrifuge, speed 18000 rpm
LT 3 shaking device	Fischer Scientific	6470.0002	Orbital shaking device
KERN 440-47N	Kern	440-47N	Laboratory balance
KERN 770	Kern	770 -N	Laboratory analytical balance
VENTICELL 222 - Komfort	BMT, MMM Group	C 131749	Drying oven, temperature control 30-100 ° C, air circulation control
Vacucell 55 - EVO	BMT, MMM Group	B 050328	Vacuum drying oven, temperature control 30-100 ° C
PULVERISETTE 19	Fritsch	19.1030.00	Universal cutting mill, rotor with V-cutting edges and fixed knives
Multi Probe Adapter System MPA 5	Courage & Kazaka Electronic	10225237	MPA 5 Station - equipment for measurement hydratation, TEWL and pH
Skin pH-meter PH 905 probe	Courage & Kazaka Electronic		Probe to specifically measure the pH on the skin surface or the scalp
Corneometer CM 825 probe	Courage & Kazaka Electronic		Probe to determine the hydration level of the skin surface (Stratum corneum).
Tewameter TM 300	Courage & Kazaka Electronic		Probe for the assessment of the transepidermal water loss (TEWL)
Heidolph RZR 2020	Heidolph	13-225-007-03-1	Overhead stirrer, mechanical speed setting and stepless transmission; speed range 40-2000 rpm
Heidolph mechanical stirrer BR 10	Heidolph	Z336688-1EA	Blade impeller crossed stirrer
Fagor FS 12	Fagor	BTT-138	Laboratory refrigerator with freezer space
WTW bench pH/mV meter	WTW	Z313165	High-performance bench pH and pH/conductivity meters for routine and high precision laboratory measurements in research or quality control laboratories
Container	RPC Superfos		13-L plastic bucket, diameter 26 cm, height 26 cm
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Microsoft Office 2010	Microsoft
C+K software	Courage and Khazaka Electronic GmbH	MPA 5 station operating software