Preparação de hidrolisado de queratina de penas de galinha e sua aplicação em cosméticos

Resumo

O objetivo do protocolo é preparar o hidrolisado de queratina de penas de galinha por hidrólise alcalina-enzimática e testar se adicionando hidrolisado de queratina em uma base de pomada de cosméticos melhora a função de barreira da pele (aumentando a hidratação e diminuindo a perda de água transepidermal). Os testes são realizados em homens e mulheres voluntários.

Resumo

Hidrolisado de queratina (KHs) é componentes padrão estabelecido em cosméticos de cabelo. Entender os efeitos hidratantes do KH é vantajoso para cosméticos de cuidados com a pele. Os objetivos do protocolo são: (1) para processar o penas de galinha em KH por hidrólise alcalina-enzimática e purificá-la pela diálise e (2) para testar se adicionar KH em uma base de pomada (OB) aumenta a hidratação da pele e melhora a função de barreira da pele, diminuindo perda de água transepidermal (TEWL). Durante a hidrólise alcalina enzimáticos penas primeiro são incubadas a uma temperatura mais elevada em um ambiente alcalino e em seguida, sob condições suaves, hidrolisadas com enzima proteolítica. A solução de KH é diálise, vácuo seco e moído a um pó fino. Formulações cosméticas, compreendendo de óleo em emulsão de água (O/W) contendo 2, 4 e 6% do peso de KH (com base no peso do OB) estão preparados. Testar as propriedades hidratantes do KH é efectuado em 10 homens e 10 mulheres em intervalos de 1, 2, 3, 4, 24 e 48 h. testado formulações estão distribuídas em locais de antebraço volar desengordurados. A hidratação do estrato córneo (SC) é avaliada pela medição da capacidade da pele, que é um dos métodos usados e simples mais todo o mundo. TEWL baseia-se na medição da quantidade de água transportada por uma área definida e o período de tempo da pele. Ambos os métodos são totalmente não-invasiva. KH faz para uma excelente oclusiva; dependendo a adição de KH no OB, ela traz uma redução de 30% em TEWL após a aplicação. KH também funciona como um umectante, como liga-se água de camadas inferiores da epiderme para a SC; com a adição de KH ideal no OB, se para 19% aumento da hidratação em homens e 22% ascensão nas mulheres ocorre.

Introdução

A indústria de curtumes, indústria alimentar e matadouros anualmente produzem imensas quantidades de subprodutos sólidos queratina – lã, penas, cerdas, cascos, garras, chifres e afins. De acordo com dados estatísticos mais recentes, o peso total de galinhas, perus, patos e outras aves abatidas nos EUA é 62,5 bilhões de libras por ano¹; na União Europeia é aproximadamente 28,7 bilhões libras por ano. Considerando que as penas fazem até 8,5% do peso total das aves domésticas, os EUA sozinho produz anualmente aproximadamente 5,3 bilhões quilos de resíduos penas².

Queratina é uma proteína que exibem alta resistência química, porque é fortemente reticulado com pontes dissulfeto que processam seu processamento difícil. Obtenção de produtos solúveis requer a clivagem de ligações cruzadas e possivelmente realizando a hidrólise das ligações peptídicas³. Clivagem das pontes dissulfeto pode proceder por meio de uma reação do ânion tiol de acordo com o seguinte padrão de^4,5:

S_um^– + – S_bS_c– ↔ – S_b^– + – S_aS_c^–

Com um nível muito elevado de pH, hidrólise das pontes dissulfeto também aparece, em conformidade com o padrão⁶

-SS^– + → de OH^– –^– S + -SOH

Sob condições suaves (pH aproximadamente 8), até mesmo sulfitolysis se realiza de acordo com o seguinte padrão:

– SS – + HSO₃^– → – SH + SSO –₃^–

A forma mais econômica de degradar queratina é degradação microbiana, que se caracteriza por condições de reação suave durante processamento e alta repartição eficiência (ca. 90%)^7,8. Keratinases são produzidas por algumas bactérias isoladas de solo e queratina resíduos⁹. Keratinases microbianas da hidrolise de estruturas rígidas e fortemente reticulado queratina¹⁰ e o KH resultante preparado é rico em proteínas solúveis, sem perda de aminoácidos essenciais detectado nele¹¹.

A fim de incorporar uma proteína em preparações cosméticas (por exemplo, emulsões, loções e géis), os requisitos assegurem que tais proteínas são solúveis em água, os sistemas determinados são transparentes e que re-agregação dos peptides é evitada devido a interações hidrofóbicas. Portanto, uma prática comum é aplicar hidrolisados de proteínas, como colágeno hidrolisado, elastina e queratina. Ao adicionar hidrolisados em emulsões cosméticas, sejam tomadas medidas para assegurar que o hidrolisado primeiro é dissolvido em água. Em alguns casos, é desejável que a proteína (ou hidrolisado) é solúvel em álcool ou outros solventes orgânicos¹².

KH é normalmente caracterizado em xampus, condicionadores, loções e soros nutritivos para o cabelo, bem como mascaras, unha polonês e agentes de maquiagem do olho. Os efeitos KH declarados geralmente incluem formando uma película protetora, alisando o cabelo ou unha estrutura, elevada plasticidade e aparência da formação tratada, regulando a consistência dos produtos e incentivando a formação de espuma^{13 , 14}. também tem sido demonstrado que o KH reduz a tensão superficial, portanto, suplementação em cosméticos pode facilitar a redução na quantidade de emulsificante adicionado para estabilizar os cremes. KH limitar os efeitos da irritação provocada por detergentes (surfactantes) para a pele, olhos e cabelos, reduzindo assim os efeitos colaterais potenciais de detergente sobre o tecido (por exemplo, a desidratação da pele, dureza e função de diminuição da barreira de a pele). A alta capacidade de armazenamento em buffer de hidrolisados também é explorada para estabilizar o pH dos produtos cosméticos; peptídeos de menor comprimento têm um maior buffer efeito^15,16. KHs se estabeleceram como componentes padrão no cabelo e cosméticos de unhas bem como sendo utilizado em produtos para cuidados com a pele, estudos sobre os efeitos hidratantes do KH não aparecem na literatura contemporânea.

Alcalino-enzimático tecnologia foi desenvolvida para o processamento de subprodutos de queratina em KH, e teste ativo está em processo sobre os efeitos de uma série de aditivos cosméticos^{17,18,19,20 , 21 , 22}. a vantagem de dois estágios de hidrólise alcalina-enzimática usando proteases microbianas para penas de galinha atinge alta eficiência sob condições de reação suave e a qualidade do KH é muito elevada em contraste com a hidrólise empregada em ácidos fortes ou alcalinos. Na primeira fase, as penas são incubadas a uma temperatura mais elevada em um ambiente alcalino, que parcialmente interrompe a estrutura de queratina e incha as penas; Depois de ajustar o pH, as penas são hidrolisadas com uma enzima proteolítica em condições suaves na segunda fase. O KH dializado possui um alto teor de proteínas.

Efeitos do método descrito aqui são penas de aves de capoeira de processamento em um KH através de hidrólise alcalina-enzimática e testar o efeito das propriedades hidratantes de KH aplicada à cosmética emulsão O/W. As propriedades hidratantes são investigadas por métodos não-invasivos instrumental na vivo. Os métodos mais frequentes para medir a função de hidratação e barreira de pele de SC incluem medição de propriedades elétricas da pele (condutância ou capacitância). Diferentes métodos para investigar hidratação SC incluem perto método imaginando multiespectral infravermelho (NIM), espectroscopia de ressonância magnética nuclear, tomografia de coerência óptica ou transferência térmica transiente²³. Função de barreira de SC se correlaciona com a TEWL de SC e é medido pelo método de câmara ventilada, método de câmara sem ventilação e câmara aberta método²⁴.

Propriedades das formulações modelo são determinadas usando o sonda Multi adaptador 5 MPA com três tipos de sondas. A primeira coisa, corneometer CM 825, medidas da pele hidratação avaliando alterações na capacidade elétrica da superfície da pele; o capacitor de medição mostra alterações na capacidade da superfície da pele em unidades de corneometric. O corneometer dá apenas uma avaliação relativa da pele hidratação²⁵. Para TEWL, a segunda sonda, tewameter TM 300, é usada para medir o gradiente de densidade de evaporação de água (em um instrumento de câmara aberta com base na lei de Fick difusão) da pele indiretamente por dois pares de sensores (temperatura e umidade relativa) indicando a quantidade de água transportada por uma área definida e o período de tempo (g/m2/h). Este método pode detectar até mesmo a menor perturbação do de função de barreira da pele²⁶. O pH da pele é um indicador da barreira e função antimicrobiana do SC²⁷. A acidez do manto da pele foi medida por uma sonda de pele PH 905 (terceira) conectada à estação 5 MPA. Esta sonda especialmente projetada consiste de um eletrodo de vidro achatadas para contacto com a pele cheia, ligado a um voltímetro. O sistema de medidas possíveis alterações devido à atividade de cátions hidrogênio em torno da camada muito fina de formas semi-sólidas medido no topo da sonda. As alterações na tensão são exibidas como pH²⁸.

Apresentamos experiências divididas em três seções: (1) preparação do KH de galinha penas por duas etapas hidrólise alcalina-enzimática e sua purificação pela diálise (remoção de sais e frações low-molecular), (2) preparação de cosméticos formulações contendo 2, 4 e 6% KH e (3) testar as propriedades de KH medindo pele, TEWL e a hidratação da pele pH. Testes foi realizado em 10 mulheres com idade média de 27,2 anos e em 10 homens com idade média de 26,2 anos. O método de seleção dos voluntários e os testes em si foram conduzidos em conformidade com os princípios éticos internacionais de investigação biomédica utilizando cobaias humanas²⁹; todas as pessoas que deram seu consentimento antes da inclusão no estudo. Antes de testar iniciou, os voluntários foram convidados a preencher um questionário sobre seu estado de saúde. Os voluntários comprometidos com a Evite aplicar qualquer produto cosmético para os sites de teste e regiões circundantes, durante as 24 horas antes e durante o período de teste; Além disso, foram permitidos somente breve noite lavagens com água corrente.

Protocolo

Voluntários foram recrutados entre os funcionários e estudantes da nossa Universidade. O método de seleção foi conduzido de acordo com "as diretrizes éticas internacionais para biomédica pesquisa envolvente cobaias humanas. Conselho para organizações internacionais de ciências médicas, Genebra (2002)." KH é um ingrediente cosmético comum usado em produtos para cabelos (xampus, condicionadores, etc.) e, portanto, não é necessária a aprovação do Conselho de revisão institucional.

1. processo de penas de galinha em KH

1. Colete penas de galinha de uma granja.
2. Lave quaisquer impurezas insolúveis e restos de sangue das penas de galinha com um excesso suficiente de água fresca em execução (frio). Coloque as penas em uma placa plana e seca durante a noite a 50 ° C.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
3. Moer 50 penas g secas em um moinho de corte (apropriado para materiais macios de dureza média da amostra e materiais fibrosos) em uma finura final de 1,0 mm. em alternativa, a finura final de penas moídas pode ser mais alto, mas não mais de 3,0 mm.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
4. Desengordurar as penas
   Nota: O método mais eficaz e económico de desengorduramento de penas de aves de capoeira é usando uma enzima lipolítica comercial.
   1. Em um recipiente de 27-L caldeira de aço inoxidável com controle de temperatura, misture as penas com água pré-aquecida até 40 ± 2 ° C em um 1:75 de relação de peso. Adicionar uma enzima lipolítica (atividade 100 KLU/g) em uma dose de 1,5-2,0% (relacionadas com pesados-em penas secas) e suavemente agitar o conteúdo com um agitador sobrecarga por 5 min.
   2. Ajuste o pH da mistura de 9,0 ± 0,2, o valor correspondente para a atividade máxima da enzima lipolítica adicionando NaOH ou 1% H₃PO₄ solução a 1%. Agitar a mistura por 5 min com um palito, sobrecarga e em seguida, verifique e re-ajustar o nível de pH usando um medidor de pH/mV de bancada de laboratório.
   3. Suavemente agitar a mistura com um agitador sobrecarga por 24 h a 40 ± 0,5 ° C. Alternativamente, incubar a mistura a 40 ± 0,5 ° C e durante as primeiras 6 horas de incubação, mexa o conteúdo em intervalos de 1 h.
   4. Filtrar a mistura por uma peneira fina (tamanho de 100 µm) e lavar as penas desengorduradas com um fluxo de água doce (frio) em execução. Seca as penas em uma placa plana a 50 ° C em uma câmara de secagem durante a noite.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
5. Realize a primeira fase da hidrólise de penas de galinha. Misture as penas com solução de água KOH de 0,3% em um peso proporção 01:50 e mexa delicadamente com um agitador superior a 60 ± 0,5 ° C por 24 h. O pH da mistura diminui de aproximadamente 12,5 no início da incubação de aproximadamente 11,0 no final da incubação. Depois de terminar a primeira fase de hidrólise, ajustar o pH da mistura para o nível correspondente à atividade máxima da enzima proteolítica com 10% H₃PO₄ (neste caso, a um nível de 9,0 ± 0,2) pela adição de 1% de NaOH.
6. Realize a segunda fase da hidrólise de penas de galinha. Adicione à mistura, a enzima proteolítica em uma dose de 5,0% (relacionados à matéria seca, da quantidade de penas pesadas-no início da primeira fase da hidrólise). Suavemente agitar com um agitador superior a 60 ± 0,5 ° C para 8 h aquecer a mistura (no mesmo recipiente 27-L caldeira aço inoxidável) para um ponto de ebulição (100 ° C) e deixe ferver por 10 minutos para inativar a enzima.
7. A solução de KH (preparado na etapa 1.6) separar o remanescente não dissolvido por filtragem através de papel de filtro de baixa densidade em um funil de Buchner com ligeira pressão-vácuo; Como alternativa, use uma centrífuga.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui por vários dias se uma solução de KH é armazenada a 5 ± 1 ° C.
8. No balde de plástico (26 cm de diâmetro x 26 cm de altura) Dialize o KH utilizando membrana MWCO 12K para remover sais e pequenos peptídeos. Despeje 400 mL da solução de KH na tubulação da diálise e Dialize ele contra 4 L de água destilada para 80 h à temperatura ambiente; Mude a água destilada após 18, 36 e 60 h.
9. Converter uma solução dializada de KH em um prato de antiadesivo (por exemplo, silicone) na proporção de 500ml para 1.000 cm² placa área, vácuo seco em uma película fina a 40 ± 0,5 ° C durante a noite, moer para formar um pó fino e mantê-lo em um recipiente fechado num exsicador.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui por vários meses se o pó KH é armazenado num local seco.

2. preparar formulações cosméticas com KH

Nota: Usado para testar o OB era uma base comercial de O/W creme hidrófila e composto de aqua, parafina, parafina líquido, cetearyl álcool, Laureth 4, hidróxido de sódio, carbomer, metilparabeno e propilparabeno.

1. Preparar formulações contendo 2, 4 e 6% KH (de acordo com o peso de base da pomada). Pesar a quantidade de pó KH dentro de um vaso de polietileno (7 cm de diâmetro x 10 cm de altura) e adicionar o OB pelo montante que garante que o peso total da formulação é igual a 50 g; Veja a receita no quadro 1.

Formulação de cosmética	Peso de pomada base [g]			Peso do hidrolisado de queratina [g]			Peso total [g]
Pomada de base	50			0			50
Pomada de base + 2% KH	49			1
Pomada de base + 4% KH	48			2
Pomada de base + 6% KH	47			3

Tabela 1: Peso-em quantidades de hidrolisado de base e queratina pomada para preparar formulações cosméticas.

2. Homogeneizar a mistura com um liquidificador de 3 lâminas de laboratório por 10 min a 134.16 x g e misture utilizando um agitador de sobrecarga mecânico. Manter as formulações preparadas a 5 ± 1 ° C e aquecê-los em temperatura ambiente por 2 h antes da utilização.
   Nota: Homogeneizando a mistura de OB com KH pode ser feito com um palito, não-digital também. Num agitador não-digital, existem escalas com a velocidade aproximada (em rpm) também. Agitação suave vai funcionar melhor para esta etapa.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui por até 5 meses se as formulações são armazenadas em 5 ± 1 ° C.

3. testar as propriedades de KH por medição de hidratação da pele, TEWL e pH

Nota: Realizar todas as medições em um quarto climatizado a 23 ± 2 ° C e a umidade relativa de 56 ± 3%.

1. Lugar 5 tiras de papel de filtro (tamanho 2 x 4 cm) na solução fisiológica (0,90% NaCl) e deixá-los por aproximadamente 1 minuto na solução.
2. Aplicar duas tiras para o lado interno do antebraço direito e três para o lado interno do antebraço esquerdo e corrigi-los para 4h com esparadrapos. Esta etapa é para desengordurar a pele e eliminar as características individuais da pele no local. Após 4 h, remover as tiras e demark as áreas com uma caneta permanente, veja a Figura 1.

Figura 1: método para localização de formulações de teste no antebraço dos membros superiores direito e esquerdos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Aplicar 0,1 mL das formulações testadas em cada local dos sites desengordurados antebraço utilizando seringas e espalhe-o sobre toda a superfície marcada. No antebraço esquerdo, não aplicar nada para o primeiro site (é o controle), aplicar o OB para o segundo local e o OB + 2% KH para o terceiro. Aplicar o OB + 4% KH e OB + 6% KH no braço direito.
4. Medir cada amostra em cada local e cada intervalo (1, 2, 3, 4, 24 e 48 h) e tirar 5 leituras com a sonda de medidor de hidratação da pele para a hidratação da pele, 15 leituras com a sonda do medidor TEWL para pele TEWL e 1 leitura com a sonda de medidor de pH da pele para o pH da pele. Não permitir que voluntários aplicar qualquer produto cosmético para os sites de teste e áreas adjacentes durante o período de teste; Eles são permitidos breve noite lavagens com água corrente.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
5. Processe as leituras resultantes por características de base numéricas das estatísticas descritivas, usando software de planilha eletrônica. Das 5 hidratação leituras medidas para cada amostra, ignorar as menores e as leituras mais altas e calcular apenas 3 leituras para a média aritmética e desvio-padrão. Das 15 TEWL leituras medidas para cada amostra, ignorar os 5 primeiros e calcular apenas 10 leituras para média aritmética e desvio-padrão.

Resultados

O KH preparado de acordo com o procedimento aqui apresentado (ver Figura 2) é amarelo na cor, facilmente solúvel em água com teor elevado de proteínas (sólidos inorgânicos representam < 2.0%); o pH da solução 1,0% de KH é 5.3 e preenche os requisitos para hidrolisados de grau cosmético. O rendimento do KH de 50 g de matéria-prima é aproximadamente 30%. A distribuição de peso molecular de KH foi determinada por SDS-PAGE e é mostrada na

Discussão

A vantagem de hidrólise alcalina-enzimática é que ele pode ser modificado de acordo com as aplicações futuras do KH. Por exemplo, em aplicações de cosméticos capilares onde uma cor levemente acastanhada de um produto não é um obstáculo, uma temperatura mais elevada na hidrólise pode ser aplicada levando a um maior rendimento de KH. Além disso, o tempo de processamento durante as duas fases do processo tecnológico significativamente afeta o processo global de eficiência – rendimento de KH sobe para 85%.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material or chemicals
LIPEX 100T	Novozymes	LJP30020	Lipex - enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 100 KLU/g
Savinase Ultra 16L	Novozymes	PXN40001	Savinase - enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 16 KNPU-S/g
Potassium hydroxide, KOH	Sigma-Aldrich	302510289	Potassium hydroxide, KOH, 97,0 %, Mr 56,11
Phosphoric acid solution, H3PO4	Sigma-Aldrich	W290017	Phosphoric acid solution, H3PO4, 85 wt. % concentration in water, Mr 98,00
Sodium chloride physiological solution	Sigma-Aldrich	52455	Tablets of BioUltra NaCl physiological solution; 1 tablet in 1000 mL of water yields 0.9 % NaCl
Sodium hydroxide, NaOH	Penta s.r.o.	40216	Sodium hydroxide, NaOH, 97,0 %, Mr 40,00
AmiFarm (Cremor base-A)	Fagron	608425	Hydrophilic oil in water (O/W) cream base; the composition: aqua, paraffin, paraffin liquid, cetearyl alkohol, Laureth 4, sodium hydroxide, carbomer, methylparaben, propylparaben.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
IKA EUROSTAR POWER control-visc stirrers	IKA-labortechnik	Z404020	Digital laboratory stirrer, for tasks up to the high viscosity range, 230V, 1/cs
IKA Propeller stirrer, 3-bladed	IKA-labortechnik	R 1381	Propeller stirrer, 3-bladed, stirrer Ø: 45 mm, shaft Ø: 8 mm, shaft length: 350 mm
Dialysis tubing closures	Sigma-Aldrich	Z371017-10EA	Dialysis tubing closures, red, size 110 mm
Dialysis tubing cellulose membrane	Sigma-Aldrich	D9402-100FT	Dialysis tubing cellulose membrane, average flat width 76 mm (3.0 in.)
DOMO Pot with stailess, LCD	DOMO Elektronic	DO42325PC	Preserving boiler stainless steel, 2000 W, 27-L container (diameter 37 cm, height 30 cm), temperature control 30-100 ° C, operation LCD display
Hettich zentrifugen Universal 32	Gemini bv	2770 GS1R	Mid bench centrifuge, speed 18000 rpm
LT 3 shaking device	Fischer Scientific	6470.0002	Orbital shaking device
KERN 440-47N	Kern	440-47N	Laboratory balance
KERN 770	Kern	770 -N	Laboratory analytical balance
VENTICELL 222 - Komfort	BMT, MMM Group	C 131749	Drying oven, temperature control 30-100 ° C, air circulation control
Vacucell 55 - EVO	BMT, MMM Group	B 050328	Vacuum drying oven, temperature control 30-100 ° C
PULVERISETTE 19	Fritsch	19.1030.00	Universal cutting mill, rotor with V-cutting edges and fixed knives
Multi Probe Adapter System MPA 5	Courage & Kazaka Electronic	10225237	MPA 5 Station - equipment for measurement hydratation, TEWL and pH
Skin pH-meter PH 905 probe	Courage & Kazaka Electronic		Probe to specifically measure the pH on the skin surface or the scalp
Corneometer CM 825 probe	Courage & Kazaka Electronic		Probe to determine the hydration level of the skin surface (Stratum corneum).
Tewameter TM 300	Courage & Kazaka Electronic		Probe for the assessment of the transepidermal water loss (TEWL)
Heidolph RZR 2020	Heidolph	13-225-007-03-1	Overhead stirrer, mechanical speed setting and stepless transmission; speed range 40-2000 rpm
Heidolph mechanical stirrer BR 10	Heidolph	Z336688-1EA	Blade impeller crossed stirrer
Fagor FS 12	Fagor	BTT-138	Laboratory refrigerator with freezer space
WTW bench pH/mV meter	WTW	Z313165	High-performance bench pH and pH/conductivity meters for routine and high precision laboratory measurements in research or quality control laboratories
Container	RPC Superfos		13-L plastic bucket, diameter 26 cm, height 26 cm
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Microsoft Office 2010	Microsoft
C+K software	Courage and Khazaka Electronic GmbH	MPA 5 station operating software