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要約

ここでは、パーキンソン病に関与するαシヌクレインの疾患特異的立体構造変異体および複数のタンパク質の同定を可能にする皮膚生検セクションにおける自由浮遊間接免疫蛍光アッセイのプロトコルを提示する。末梢神経系。

要約

現在までに、ほとんどの神経変性疾患については、死後の病理学的確定診断のみが利用可能である。パーキンソン病(PD)の場合、診断は、ドーパミン作動性ニューロンのほとんどが既に失われている場合、疾患コースで後に現れる運動関与の臨床徴候にのみ依存しています。したがって、病気の初めに、またはそれを発症するリスクがある患者を識別できるバイオマーカーの強い必要性があります。ここ数年、皮膚生検は、小さな繊維神経障害などの末梢神経疾患の優れた研究および診断ツールであることが証明されています。興味深いことに、小さな繊維神経障害およびαシヌクレイン(αSyn)神経沈着物は、PD患者における皮膚生検によって示されている。確かに、皮膚生検は、病理学になりやすい末梢神経組織の分析を可能にする、簡単にアクセス可能で、最小限に侵襲的で痛みのない手順であるという大きな利点を有する。さらに、同じ患者のフォローアップの過程で皮膚生検を繰り返す可能性は、疾患進行との縦方向の相関関係を研究することを可能にする。我々は、PD患者の皮膚神経線維におけるαSyn凝集体の存在を調査するために、標準化された信頼性の高いプロトコルを設定した。このプロトコルは、いくつかの短い固定ステップ、クライオトーム断面、次に2つの特異的抗体を用いた自由浮遊免疫蛍光二重染色を伴う:抗タンパク質遺伝子産物9.5(PGP9.5)を用いて、皮膚神経線維と検出のための抗5G4をマークする。αSyn凝集体。それはまた、皮膚神経に関心のある他のタンパク質を標的にするために適用することができる汎用性、敏感で簡単にプロトコルを実行することができます。αSyn凝集体をマークする能力は、PDの死後前の病理学的診断を確立するためのツールとしての皮膚生検の使用に向けたもう一つの一歩である。

概要

皮膚生検は神経障害1の分野における診断および研究ツールとして非常に重要である。実際、表皮と真皮には、豊富な体性感覚神経線維(骨髄および未骨髄)、受容性の自由な神経終末、感覚受容体および汗腺、血管、皮脂腺および筋肉の難解な陰核の自律神経の内線が含まれている。2.

20世紀半ばに、PGP9.5抗体の免疫組織化学のセットアップは、ヒト表皮哺乳類皮膚3の広範な内部性の証拠を可能にした。PGP9.5は、中枢および末梢神経系(PNS)の軸に沿って均等に分布するカルボキシル末端ヒドロラーゼである。この抗体の利用可能性は、皮膚におけるPNSの形態および解剖学を明らかにするだけでなく、それに関連する疾患の研究を実施した3,4を可能にした。皮膚生検は、新しい臨床実体の定義に貢献しました: 小さな繊維神経障害.いくつかの国際グループは、皮膚生検分析による小繊維神経障害5の表記/徴候との関連を示し、神経モルホメトリーおよび標準化されたプロトコルを提供した。臨床実践6、7、8で使用される規範的な参照値。

最近、多量の証拠は、中枢神経系におけるタンパク質蓄積の誤った折りたたみを特徴とする神経変性疾患が、多系統病理9であることを示している。実際、PDは、実はニグラのドーパミン作動性ニューロンにおけるαSyn蓄積によって特徴付けられており、αSynおよびその病理学的形態、リン酸化αSyn(P-αSyn)は、末梢組織においても検出され得ることを実証されている。胃腸粘膜10、唾液腺11、汗腺およびピロ運動筋を取り巻く皮膚自律性線維12、13、14、αSynの病原性形態に対する免疫反応性を示すBraakの仮説によれば、αSyn病理は、脳15に蓄積する前に、PNSで十分に前に始まる可能性があることを興味深く仮説化する。また、p-αSynの存在は、プロドロマルPD16、17と考えられるレム行動障害を有する患者の皮膚神経において実証されており、したがって皮膚病理αSynは有望な早期末梢と考えることができる。シヌクレノパシーの病理学的マーカー。

PDにおける小さな繊維神経障害の関連は以前に実証されており、表皮内神経線維密度が疾患進行18,19を反映していることが見出されている。したがって、皮膚生検は、PDで神経変性を研究し、疾患の死後前の病理学的診断を確立するための有用なツールである。確かに、皮膚生検は、病理学になりやすい神経組織の分析を可能にする、簡単にアクセス可能で最小限に侵襲的な手順であることの大きな利点を有する。最後に、同じ患者のフォローアップの過程で皮膚生検を繰り返す可能性は、疾患の進行との縦方向の相関を研究することを可能にする。

本研究室では、PGP9.5と立体構造特異的モノクローナル5G4抗体を用いた二重免疫染色を利用し、小凝集体20、21を含む疾患特異的形態のαSynを認識し、有望な高い診断効率を持つ皮膚神経におけるαSyn凝集体の存在19.立体構造疾患における皮膚生検の免疫蛍光分析は、タンパク質凝集体の検出と生体内の神経変性の測定の両方を組み合わせることにより、バイオマーカーの有望な供給源として際立っています。以下、皮膚生検を処理し、αSyn凝集体を検出するための自由浮遊免疫蛍光染色を行う上で、簡単で汎用性の高いプロトコルを示す。さらに、このプロトコルは、皮膚PNSで発現される目的の他のタンパク質を標的化するために適合させることができる。

以下の研究プロトコルは、皮膚生検19によるPDのPNSにおける凝集αSyn分析の診断有用性を評価するために用いられた。PDの包含基準は、英国の脳バンク診断基準に従った明確な臨床診断、少なくとも3年の疾患期間、家族歴なし、および歴史上の主要な認知障害または主要な自律神経症状なしであった。除外基準は、神経障害の原因が知られていた(糖化ヘモグロビン、クレアチニン、ビタミンB12、TSH、血清免疫固定、HIV、HCV、梅毒、およびボレリオシス)。各被験者は、3つの解剖学的部位(C8皮膚レベルの首、膝の上の大腿10cm、横マレオラスの上の脚10cm)で3mm径の皮膚生検を受け、臨床的により影響を受けた。一般に、以下のプロトコルは、皮膚生検を処理し、自由浮遊免疫蛍光染色および分析を行うことについてである。したがって、皮膚組織に関心のある他のタンパク質の検出に適応し、使用することができます。

プロトコル

このプロトコルは、州倫理委員会によって承認されており、すべての登録された被験者は、研究に書面によるインフォームドコンセントを与えました。

1. 皮膚生検コレクション

  1. 資格のある医師が適切な臨床設定で皮膚生検を行います。
  2. 皮膚生検を行い、アルコール綿棒でそれをきれいにする領域を選択します。
  3. 1ccのリドカイン2%で麻酔液を調調します。
  4. 針を平行にして、局所麻酔を皮下に注入する。
  5. 麻酔の効果を確認した後、3ミリメートルの使い捨てパンチを取り、皮下脂肪に達するまで、表皮と真皮を介して下に回転する回転と繊細な下向き圧力を適用します。
  6. パンチを引き出せ
  7. 使い捨て鉗子を使用して、皮膚プラグをそっと引き上げます。
  8. 脂肪組織のレベルで標本の基部を切り取るためにはさみを使用してください。
  9. 試料を10mLの周期リジン-パラホルムアルデヒド(PLP)固定溶液を含むチューブに入れます。
  10. 領域を消毒し、接着剤包帯でそれをカバーします。

2. 組織固定と貯蔵

  1. 新しい PLP 固定ソリューションを作成します (表 1を参照)。
  2. 皮膚生検の採取直後に、10mLのPLP固定溶液を含むチューブに浸し、4°Cで一晩(O/N)インキュベートします。
  3. 翌日、ヒュームフードの下で、PLP固定液を静かに同じチューブ内で取り出し、0.1Mソレンセン溶液の5mLで5分間生検を3回洗浄する(表1)。
  4. ソレンセンの溶液を廃棄し、4°Cで5 mLのクライオ保護溶液O/Nで生検をインキュベートします。
  5. クライオトームで切断が1週間以内に行われる場合は、4°Cで生検を保存します。切り取りが3ヶ月以内に行われる場合は-20 °Cで生検を保存します。生検をクライオモルド(ステップ3.2-3.4)に埋め込み、-80°Cに保存し、長期間保存します。

3. クライオトームで切ったティッシュ

  1. クライオトームを-20°Cに設定します。
  2. クライオオールドを取り、クライオ埋め込み媒体でそれを埋めます。バブルの作成は避けてください。
  3. ピンセットを使用して、クライオモルドの底に平行な縦軸(表皮- 真皮)を持つクライオ埋め込み媒体に生検を浸漬します。
  4. 液体窒素でサンプルを凍結し、生検を正しい方向に含むクライオ埋め込み培地の固体立方体を得ます。
  5. サンプルをクライオスタットに入れ、生検が順応できるように30分間待ちます。
  6. クライオスタットのサンプルを修正し、50 μm のセクションを切断します。
  7. 少しブラシの助けを借りて、各井戸に不凍液の200 μLを含む96ウェルプレートにクライオセクションを転送します。井戸ごとに1つのセクション。
  8. -20 °C.で保存します。
    注:生検全体を分析しない場合は、部分的にだけ切り取る。この場合、セクションは-20 °Cで保存し、生検の残りの部分を-80 °Cで保存し、長期間保存する必要があります。

4. 免疫蛍光染色

  1. 96ウェルプレートを100μLの洗浄液で充填します。
  2. 分析するセクションを貯蔵プレートから洗浄液を含む新しいセクションに移します。各ウェルあたり1セクション(解剖学的部位あたり4セクション、患者あたり:通常、患者あたり合計12切)。
  3. 室温(RT)で10分間洗浄液のセクションを残します。同じ溶液を含む別の井戸にセクションを移し、洗浄を繰り返します。
  4. ブロッキング溶液の100 μLを含む新しいウェルにセクションを移動し、少なくとも90分間、RTで最大4時間インキュベートします。
  5. 一次抗体抗体をPGP9.5(ウサギポリクローナル、1:1000)および抗5G4(マウスモノクローナル、1:400)を作動溶液中に希釈する。
  6. 一次抗体の作動溶液の100 μLを含む新しいウェルに切片を移し、RTでO/Nをインキュベートします。
  7. ステップ4.3として、RTで少なくとも10分間セクションを2回洗浄し、100 μLの洗浄液を使用します。
  8. 二次抗体(異なる蛍色素と共結合)ヤギの抗ウサギを希釈してPGP9.5(1:700)とヤギの抗マウスを検出し、作業溶液中の5G4(1:700)を検出します。
  9. RTで90分間、二次抗体の作動溶液の100μLを含む新しいウェルに切片を移します。この点から、96ウェルプレートをアルミホイルで覆い、二次抗体/iesと共役の蛍光蛍光解の漂白を避ける。
  10. ステップ4.3として、洗浄液の100 μLで、少なくとも10分間、セクションを2回洗浄します。
  11. 100 μL の DAPI (PBS 1x で希釈された 1:5,000) を含む新しいウェルにセクションを RT で 5 分間転送します。
  12. ステップ4.3として、洗浄液の100 μLで、少なくとも10分間、セクションを2回洗浄します。
  13. 折りたたみを避けるため、スライド上のセクションを正しい位置に取り付けます。
  14. スライドとカバースリップで取り付け媒体を数滴追加します。
  15. 共焦点/蛍光顕微鏡を使用する前に、O/Nをスライドさせてください。
  16. スライドは、光の露出を避けて4°Cの適切なボックスに保管してください。正確に保存されている場合、信号は約6ヶ月間表示されます。
    注:新しく切断されたスライスを含む96ウェルプレートから洗浄液を含む96ウェルプレートへのセクションの転移(ステップ4.1)は、生検を拾うのに役立つ小さなブラシを使用して行われる。最初の井戸にセクションの転送後、スライスは、別の溶液でインキュベートする必要があるたびに、ブラシの助けを借りてよくそれを移動します。

5. 免疫蛍光イメージング

  1. 反転蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡(20X、40倍以上の倍率)の下のセクションを表示し、最良の結果を出すには、Zスタック計画で2μm刻みの連続フレームを使用します。
  2. 顕微鏡接続カメラで画像を取得
  3. 適切なイメージングソフトウェア(ImageJ)を使用して、信号の空間分布と強度の観点から、セクション内の正の信号を分析します。これを行うには、以下の手順を実行します。
    1. ImageJ ソフトウェアでファイルを開きます。
    2. 各カラーチャンネルを分析するために、画像>カラー>スプリットチャンネルをクリックします。
    3. [イメージ > スタック > Zプロジェクト] をクリックして、複数のセクション取得のマージを取得します。
    4. [イメージ > カラー > マージチャネル] をクリックして、同じ取得の異なるカラー チャネルのマージを取得します。
不凍液
(最大6ヶ月間4°Cで保存)		30% グリセロール
30% エチレングリコール
30% dH2O
10% 2x リン酸バッファー
ブロッキング ソリューション
(現時点で準備)		4% 正常ヤギ血清
1% トリトン X-100
洗浄液中
クライオプロテスタント
(最大6ヶ月間4°Cで保存)		20% グリセロール
80% ソレンセンのソリューション
リン酸水素二ナトリウム溶液
(最大6ヶ月のRT店舗)		dH2O中の0.45Mリン酸二ナトリウム(Na2HPO4)
滅菌ボトルのフィルター
リジン溶液
(最大3週間4°Cで保存)		0.3M L-リジン単塩水溶液の50%
0.1Mソレンセンの溶液pH7.6の50%
pH 7.4,無菌ボトルにフィルター
パラホルムアルデヒド(PFA) 8%
(ヒュームフードの下で準備し、最大1ヶ月間4°Cで保存)		dH2Oの2.6M PFA(ギ酸形成を避けるために60°Cを超えなさらない)
滅菌ボトルにフィルター
リン酸バッファー 2x
(最大6ヶ月間4°Cで保存)		6% リン酸ナトリウム(NaH2PO4)溶液
dH2O 中のリン酸二ナトリウム (Na2HPO4) 溶液 45%
PLP固定ソリューション
(現時点では、ヒュームフードの下で準備)		25% パラホルムアルデヒド 8%
0.01M ナトリウム(メタ)周期
75% リジンソリューション<
二水素リン酸ナトリウム一水和物
(最大6ヶ月のRT店舗)		dH2O中の0.52M二水素リン酸一水和物(NaH2PO4*H2O)
滅菌ボトルにフィルターを入れます。
ソレンセンのソリューション
(最大1ヶ月間4°Cで店舗)		2.5% リン酸ナトリウム溶液
18.7% リン酸二ナトリウム溶液
pH7.6、dH2O
洗浄液
(現時点で準備)		0.25M トリズマ基地
0.26M ナクル
pH7.6、dH2O
作業ソリューション
(現時点で準備)		50% ブロッキングソリューション
50% 洗浄液

表 1:必要なソリューション。プロトコルに必要なソリューションの一覧と、プロトコルの準備方法の簡単な説明。

結果

記載の手順(図1)に続いて、PD患者の自律神経構造を内面的にする真皮神経筋胞において、5G4抗体で標識されたαSyn凝集体を検出した。アルファシヌクレイン沈着物の形態は、真皮神経の軸索に沿って点線信号として現れる(図2)。実際、3つの解剖学的部位(頸部、大腿および遠位脚)で19人のPD患者と17のコントロールでこのプロトコルを利用すると、5G4...

ディスカッション

PDの診断のための皮膚生検のための自由浮遊免疫蛍光アッセイについて説明する:それは抗PGP9.5抗体、パナキソンマーカー、および抗5G4、凝集形態を認識する立体構造特異的抗体との二重免疫染色を利用するαSynの。

PDおよびおそらく他のタンパク質立体障害における診断目的のための皮膚生検の大きな利点は、:1)軽度に侵襲的な技術によって疾患になりやすい神経組織へ?...

開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

我々は、パーキンソン・シュバイツとABREOC(エンテ・オスペダリエロ・カントナーレ科学研究諮問委員会)に対し、この研究の財政的支援に感謝する。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
5G4 (anti human αSyneclein 5G4)Analytik Jena Roboscreen847-0102004001Mouse monoclonal 
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG Invitrogen19714182 mg/mL
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG Invitrogen19228492 mg/mL
Disodium hydrogen phosphate solutionMerk Millipore106586
Ethylene GlycolSigma-Aldrich324558
GlycerolSigma-AldrichG7757
L-Lysine monohydrochlorideSigma-AldrichL5626
ParaformaldehydeAldrich Chemistry441244
PGP9.5Abcamab15503Rabbit polyclonal
Sodium ChlorideSigma S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate MonohydrateMerck Millipore106346
Sodium (meta)periodate Sigma-AldrichS1878
Trizma BaseSigma T1503
Tryton X-100Sigma-AldrichX100
Vectashield Vector LaboratoriesH-1000Mounting medium

参考文献

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