Serbest yüzen Immünofluorescence tahlil ile kutanöz periferik sinir lifleri Alfa Synuclein toplamları hedefleme

Özet

Burada, biz Parkinson hastalığı ve multipl proteinleri dahil Alfa Raisin hastalığın spesifik konformasyon türevleri tanımlanması için izin cilt biyopsisi bölümlerde serbest yüzen dolaylı immünofluorescence tahlil için bir protokol sunuyoruz Periferik sinir sistemi.

Özet

Bugüne kadar, çoğu nörodejeneratif hastalıklar için sadece bir post-mortem histopatolojik kesin tanı mevcuttur. Parkinson hastalığı (PD) için, tanı hala sadece hastalık kursunda daha sonra görünür motor tutulumu klinik belirtileri dayanır, dopaminerjik nöronların çoğu zaten kaybolduğunda. Bu nedenle, hastalığın başlangıcında veya onu geliştirme riskinde hastaları tanımlayabilir bir biyomarker için güçlü bir ihtiyaç vardır. Son birkaç yıl içinde, cilt biyopsisi, küçük lif nöropati gibi periferik sinir hastalıkları için mükemmel bir araştırma ve tanı aracı olduğunu kanıtladı. İlginç bir şekilde, PD hastalarında cilt biyopsisi ile küçük lif nöropati ve Alfa Raisin (αsyn) nöral tortuları gösterildi. Nitekim, cilt biyopsisi, patolojiye eğilimli periferik sinir dokusunun analizini sağlayan, kolayca erişilebilen, minimal invazif ve ağrısız bir prosedür olmanın büyük avantajına sahiptir. Dahası, aynı hastanın takip esnasında deri biyopsisi tekrarlanması olasılığı, hastalığın ilerlemesi ile uzunlamasına korelasyon incelenmesi sağlar. PD hastasının cilt sinir lifleri içinde αSyn toplamaların varlığını araştırmak için standardize edilmiş güvenilir bir protokol kuracağız. Bu protokol, birkaç kısa sabitleme adımlarını, bir cryotome bölümlendirmesini ve daha sonra iki spesifik antikorla serbest yüzen immünofluorescence çift lekeleme içerir: Anti protein gen ürün 9,5 (PGP 9.5) tespit için kutanöz sinir lifleri ve anti 5G4 işaretlemek için αSyn toplamları. Bu da cilt sinirleri ilgi diğer proteinlerin hedefleme için uygulanabilir bir çok yönlü, hassas ve kolay bir protokoldür. ΑSyn toplamalarını işaretleme yeteneği, PD 'nin önceden mortem histopatolojik tanısı oluşturmak için bir araç olarak cilt biyopsisi kullanımı için bir adım daha ileri bir adımdır.

Giriş

Cilt biyopsisi nörolojik bozukluklar alanında teşhis ve araştırma aracı olarak büyük önem kazanmıştır¹. Nitekim, epidermis ve dermis bol somatik duyusal sinir lifleri (myelinated ve myelinated), nociceptif serbest sinir sonlar, duyusal reseptörleri ve ter bezleri, damarların, yağ bezleri ve kas arrektor leiomiyomlardır ^{otonoma innervasyonu içerir 2}' ye kadar.

Orta-20^inci yüzyılda, PGP 9.5 antikor immünhistokimya için kurulum insan epidermis memelinin deri³geniş bir innervasyon kanıtı izin verdi. PGP 9.5, hem merkezi hem de periferik sinir sisteminin (PNS) akons boyunca eşit olarak dağıtılan bir karboksil-Terminal hidrolaz 'dir. Bu antikor mevcudiyeti sadece cilt PNS Morfoloji ve anatomisini açıklığa kavuşturmak için izin değil, aynı zamanda bu ile ilişkili hastalıkların çalışma uygulanan^3,4. Cilt biyopsisi yeni bir klinik obje tanımlamak için katkıda bulunmuştur: küçük lif nöropati. Çeşitli uluslararası gruplar intraepidermal sinir lifleri ve belirtiler/küçük lif nöropati belirtileri kaybı arasındaki ilişkiyi göstermiştir⁵ cilt biyopsisi analizi ile ve sinir morfometri için standart protokoller sağlanan yanı sıra klinik uygulamada kullanılmak üzere normatif referans değerleri^6,7,8.

Son zamanlarda büyük miktarda kanıt, nörodejeneratif hastalıkların, merkezi sinir sistemindeki yanlış katlanan protein birikimleri ile karakterize olduğunu göstermiştir, Multi-sistem patolojileri⁹. Gerçekten de, PD, kanıtlanmışdopaminerjik nöron içinde αsyn birikimi ile karakterize, ancak αsyn ve patolojik formu, fosforile αsyn (P-αsyn), periferik dokularda da tespit edilebilir olduğunu göstermiştir. Gastro-intestinal mukoza¹⁰, tükürük bezleri¹¹, ter bezleri ve pilomotor kasları çevreleyen cilt otonjik lifleri^12,13,14, αsyn patojen formları için immünoreactivity göster, Braak hipotezi ile ilgili olarak, αSyn patolojisinin beyinde birikiminden önce, PNS 'de önceden de başlayabilir. Dahası, p-αsyn varlığı, prodromal PD olarak kabul edilen REM davranış bozuklukları olan hastaların cilt sinirinde gösterildi^16,17 böylece deri patolojik αsyn umut verici bir erken periferik olarak kabul edilebilir synucleinopati histopatolojik Marker.

PD 'de küçük lif nöropati Birliği daha önce gösterildi ve intraepidermal sinir liflerinin yoğunluğu hastalığın ilerlemesini yansıtan bulunmuştur^18,19. Bu nedenle, cilt biyopsisi PD 'de nörodejenerasyonun incelenmesi ve hastalığın ön mortem histopatolojik tanısı oluşturmak için yararlı bir araçtır. Nitekim, cilt biyopsisi, patolojiye eğilimli sinir dokusunun analizine izin vererek kolayca erişilebilen ve minimal invaziv bir prosedür olmaktan büyük bir avantaj sağlar. Son olarak, aynı hastaların takip esnasında deri biyopsisi tekrarlanması olasılığı, hastalığın ilerlemesi ile uzunlamasına korelasyon incelenmesi sağlar.

Laboratuvarımızda, PGP 9.5 ve konformasyon özel monoklonal 5g4 antikor ile çift immüno-boyama sömürüyor, bu αsyn küçük agrega dahil hastalık spesifik formları tanır^20,21, biz göstermek başardık umut verici yüksek tanı verimliliği ile cilt sinirleri αSyn toplamları varlığı¹⁹. Konformasyonel hastalıklarda cilt biyopsisi immünofluorescence Analizi hem protein agregaları tespiti hem de nörodejenerasyonun ölçüleri arasında kombine edilerek, umut verici bir biyomarkerlerin kaynağı olarak öne çıkmaktadır. Bundan sonra, cilt biyopsisi ile ilgili kolay ve çok yönlü bir protokol gösteriyoruz ve αSyn toplamalarını tespit etmek için serbest yüzen immünofluoresesans lekesini gerçekleştirme. Dahası, bu protokol cilt PNS ifade ilgi diğer protein hedefleme için adapte edilebilir.

Aşağıdaki çalışma protokolü, pH 'nin PNS 'inde toplanan αSyn analizinin tanı yardımcı programını cilt biyopsisi¹⁹ile değerlendirmek için kullanılmıştır. PD için dahil etme kriterleri: INGILTERE beyin Bankası teşhis kriterlerine göre kesin bir klinik tanı, hastalık süresi en az 3 yıl, hiçbir aile öyküsü, ve önemli bir bilişsel bozukluk ya da tarihin önemli dysautonomic belirtileri. Dışlama kriterleri nöropati nedenleri bilinen (glycated hemoglobin, kreatinin, B12 vitamini, TSH, serum immünofixation, HıV, HCV, frengi, ve borreliosis). Her konu üç anatomik bölgelerde 3 mm çapında cilt biyopsileri (C8 dermatomal seviyede boyun, diz üstünde uyluk 10 cm, lateral Malleolus üzeri bacak 10 cm) ve klinik olarak daha etkilenmiştir. Genel olarak, aşağıdaki protokol cilt biyopsisi işleme ve serbest yüzen immünofluorescence boyama ve analiz gerçekleştirme hakkında. Bu nedenle adapte edilebilir ve cilt dokusu ilgi diğer proteinlerin tespiti için kullanılır.

Protokol

Protokol, Cantonal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır ve tüm kayıtlı konular araştırmaya yazılı onay verdi.

1. cilt biyopsisi koleksiyonu

1. Nitelikli bir doktorun, deri biyopsisi uygun bir klinik ortamda gerçekleştirmesini sağlar.
2. Cilt biyopsisi yapmak ve bir alkol çubuk ile temizlemek için alanı seçin.
3. Anestezik solüsyonu 1 cc lidokain% 2 ile hazırlayın.
4. Alana paralel iğne ile lokal anestezi subkutan enjekte edilir.
5. Anestezi etkisini kontrol ettikten sonra, 3 mm tek kullanımlık yumruk alın ve subkutan yağ ulaşılana kadar, epidermis ve dermis aşağı döndürmek için rotasyonel ve hassas aşağı basınç uygulayın.
6. Yumruk çek.
7. Cilt fişini hafifçe çekmek için tek kullanımlık forseps kullanın.
8. Numunenin tabanı yağ dokusu seviyesinde kesmek için makas kullanın.
9. Numuneyi 10 mL periodate-Lysine-paraformaldehyde (PLP) Fiks çözeltisi içeren bir tüpün içine yerleştirin.
10. Alanı dezenfekte edin ve yapışkan bir bandaj ile koruyun.

2. doku Fikreme ve depolama

1. Yeni PLP fiksatif solüsyonu yapın (bkz. Tablo 1).
2. Cilt biyopsisi koleksiyonundan hemen sonra, 10 mL PLP fiksatif solüsyonu içeren bir tüpte onu battırın ve 4 °C ' de gecede (O/N) kulkarın.
3. Sonra, duman kaputu altında, hafifçe ve aynı tüpte PLP fiksatif çıkarın, 5 mL 0,1 M Sorensen çözeltisi ile 5 dakika biyopsi yıkayın (Tablo 1).
4. Sorensen 'in çözümünü atın ve biyopsisi 4 °C ' de 5 mL Cryo-protektant çözeltisi olan O/N ile kuluçla.
5. Bir cryotome ile kesme 1 hafta içinde gerçekleştirildiğinde biopsini 4 °C ' de saklayın; biyopsi 3 ay içinde gerçekleştirildiğinde-20 °C ' de saklayın; biyopsi bir cryomold embed (adımlar 3.2-3.4) ve daha uzun bir süre için korumak için-80 °C ' de saklayın.

3. bir Cryotome ile doku kesme

1. Cryotome 'yi-20 °C ' de ayarlayın.
2. Bir cryomold alın ve Cryo-gömme ortamı ile doldurun. Kabarcıklar yaratmaktan kaçının.
3. Cımbız kullanmak, biyopsisi, ağarın altına paralel olarak uzunlamasına eksen (epidermis-DermIS) ile Cryo-katıştırma ortamına daldırın.
4. Bu numuneyi, biyopsiyi doğru yönde içeren Kriyo katıştırma ortamının katı bir küpünü elde etmek için sıvı nitrojen ile dondurabilirsiniz.
5. Numuneyi kriyostat 'a koyun ve biyopsinin acclimatize edilmesine izin vermek için 30 dakika bekleyin.
6. Örnek kriyostat ve kesme 50 μm bölümler üzerinde düzeltin.
7. Küçük bir fırça yardımıyla, her kuyunda 200 μL antifriz çözeltisi içeren 96 iyi bir plakanın içinde Cryo-bölümlerini aktarın. İyi başına bir bölüm.
8. -20 °C ' de saklayın.
   Not: Eğer analiz tüm biyopsi analiz edilmiyor, sadece kısmen kesti. Bu durumda, bölümler-20 °C ' de ve biyopsinin kalan kısmı-80 °C ' de daha uzun süre muhafaza edilmelidir.

4. immünofluorescence boyama

1. 100 μL yıkama çözeltisi ile 96 iyi bir plaka doldurun.
2. Depolama plakasından analiz edilecek bölümleri, çamaşır çözeltisi içeren yeni birine aktarın. Her kuyu için 1 kısım (anatomik site başına 4 bölüm, hasta başına: hasta başına genellikle toplam 12 bölüm).
3. Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika yıkama çözeltisi bölümünde bırakın. Aynı çözümü içeren başka bir kuyu içine bölümü aktarmak ve yıkama tekrarlayın.
4. Bölümleri 100 μL engelleme çözümünü içeren yeni kuyulara taşıyın ve en az 90 dakika ve RT 'de en fazla 4 saat boyunca inküye yapın.
5. Primer antikorlar Anti-PGP 9.5 (tavşan polyclonal, 1:1000) ve anti-5G4 (fare monoklonal, 1:400) çalışma çözeltisi seyreltilmeli.
6. Bölümleri primer antikorların çalışma çözeltisi 100 μL içeren yeni kuyulara aktarın ve RT 'de O/N 'yi inkük.
7. Adım 4,3 olarak, 100 μL yıkama çözeltisi ile 2 kez RT 'de en az 10 dakika boyunca bölümleri yıkayın.
8. İkincil antikorları seyreltin (farklı fluorophores ile konjuyum) keçi Anti-tavşan algılamak için PGP 9.5 (1:700) ve bir keçi Anti-Mouse tespit etmek 5G4 (1:700) çalışma çözümü.
9. RT 'de 90 dk için ikincil antikorların çalışma çözeltisi 100 μL içeren yeni kuyuların içine bölümleri aktarın. Bu noktadan itibaren, alüminyum folyo ile 96 iyi plaka kapağı ikincil antikor/ies ile conjuated fluorophore ağartma önlemek için.
10. Adım 4,3 olarak, en az 10 dakika için 2 kez, 100 μL yıkama çözeltisi ile bölümleri yıkayın.
11. Bölümleri RT 'de 5 dakika boyunca DAPı 100 μL (PBS 1x 'de seyreltilmiş 1:5000) içeren yeni kuyulara aktarın.
12. Adım 4,3 olarak, en az 10 dakika için 2 kez, 100 μL yıkama çözeltisi ile bölümleri yıkayın.
13. Bir slayttaki bölümleri yanlış katlamadan kaçınarak doğru konumda bağlayın.
14. Slayt üzerinde montaj ortamının birkaç damla ekleyin ve bir coverslip ile kapak.
15. Konfokal/floresan mikroskobu kullanmadan önce slaytlar kuru O/N edelim.
16. Slaytları 4 °C ' de uygun bir kutuda saklayın. Doğru şekilde depolanırsa, sinyal yaklaşık 6 ay boyunca görünür olacaktır.
    Not: Yeni kesilmiş dilimleri içeren 96 iyi plakalı bir bölümün transferi, çamaşır çözeltisini içeren 96 iyi plakaya (adım 4,1) biyopsi almaya yardımcı olan küçük bir fırça kullanılarak gerçekleştirilir. İlk kuyu içine bölümün transferinden sonra, dilim farklı bir çözüm ile inkübe gereken her zaman, iyi fırça yardımıyla iyi taşıyın.

5. immünofluorescence görüntüleme

1. Ters Floresan Mikroskobu veya Konfokal mikroskop (20X, 40X veya daha yüksek büyütme) altındaki bölümleri görüntüleyin, en iyi sonuçlar için Z yığını planında 2 μm artışlarla ardışık çerçeveler kullanın.
2. Mikroskop bağlı kamera ile görüntü edinme
3. Sinyalin uzamsal dağılımı ve yoğunluğu açısından bölümlerdeki pozitif sinyalleri çözümlemek için yeterli görüntüleme yazılımı (örn. ımagej) kullanın. Bunu yapmak için aşağıda belirtilen adımları gerçekleştirin.
   1. Imagej yazılımı ile dosyayı açın.
   2. Her renk kanalını çözümlemek için görüntü > renk > bölünmüş kanalları tıklayın.
   3. Birden çok bölüm alımları birleştirme elde etmek için görüntü > yığını ≫ Z proje tıklatın.
   4. Aynı edinme farklı renk kanalları birleştirme elde etmek için kanalları birleştirmek ≫ resim > renk 'i tıklatın.

Antifriz çözeltisi (6 aya kadar 4 °C ' de saklayın)	% 30 gliserol % 30 etilen glikol 30% dH2O % 10 2x fosfat tampon
Engelleme çözümü (Şu anda hazırlayın)	% 4 normal keçi serumu 1% Triton X-100 Yıkama solüsyonu
Cryo-protektant (6 aya kadar 4 °C ' de saklayın)	% 20 gliserol 80% Sorensen 'in çözümü
Disodyum hidrojen fosfat çözeltisi (RT 6 ay kadar mağaza)	0.45 m disodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) dH2O Steril bir şişede filtre
Lizin solüsyonu (3 haftaya kadar 4 °C ' de saklayın)	50% 0.3 M L-Lysine monohidroklorür çözeltisi 50% 0.1 M Sorensen 'in çözeltisi pH 7.6 pH 7,4, steril bir şişede filtre
Paraformaldehyde (PFA) 8% (1 aya kadar 4 °C ' de duman kaputu ve mağaza altında hazırlayın)	2.6 m PFA dH2O (ila 55 °C _do 60 °C ' den fazla değil, formik asit oluşumunu önlemek için) steril bir şişe içinde filtre
Fosfat tampon 2x (6 aya kadar 4 °C ' de saklayın)	% 6 Monosodyum fosfat (NaH2PO4) çözeltisi 45 dH2O 'da% disodyum fosfat (Na2HPO4) çözeltisi
PLP fixatif çözüm (Şu anda hazırlamak, duman kaputu altında)	% 25 paraformaldehit 8% 0.01 m sodyum (meta) periodate 75% lizin solüsyonu <
Sodyum Dihiddrogen fosfat monohidrat (RT 6 ay kadar mağaza)	0.52 m sodyum Dihiddrogen fosfat monohidrat (NaH2PO4 * H2O) dH2O Steril bir şişede filtreleyin.
Sorensen 'in çözümü (1 aya kadar 4 °C ' de saklayın)	2,5% Monosodyum fosfat çözeltisi 18,7% disodyum fosfat çözeltisi pH 7.6, dH2O
Yıkama çözeltisi (Şu anda hazırlayın)	0.25 m Trizma tabanı 0.26 m NaCl pH 7.6, dH2O
Çalışma çözümü (Şu anda hazırlayın)	50% engelleme çözümü 50% yıkama çözeltisi

Tablo 1: Gerekli çözümler. Protokol ve nasıl hazırlanacağınız hakkında kısa bir açıklama için gerekli çözümler listesi.

Sonuçlar

Açıklanan prosedürün ardından (Şekil 1), PD hastalarının otonjik yapılarına sahip dermal sinir fasiklerde, 5G4 antikor Ile etiketlenmiş αsyn toplamları tespit ettik. Alfa-synuclein tortularının morfolojisi dermal sinirlerin akons boyunca noktalı sinyal olarak görünür (Şekil 2). Nitekim, 19 PD hastalarında bu protokol ve üç anatomik sitede (servikal, uyluk ve distal bacak) cilt biyopsilerinde 17 kontrol sömürüyor, 5G4 ' ün% 81 duyarlıl...

Tartışmalar

Biz PD tanısı için cilt biyopsileri için serbest yüzen immünofluorescence tahlil tarif: Bu anti-PGP 9.5 antikor, bir panaxonal Marker ve anti-5G4, toplanan formu tanıyan bir konformasyon spesifik antikor ile çift immünostasyonu istismar , αSyn.

PH 'de tanı amacı ve muhtemelen diğer protein Konformasyonel bozukluklarda cilt biyopsisi için büyük avantajlar şunlardır: 1) hafif invazif bir teknik ile hastalığa eğilimli sinir dokusuna doğrudan erişim ve böylece beklenen daha...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5G4 (anti human αSyneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Mouse monoclonal
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG	Invitrogen	1971418	2 mg/mL
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG	Invitrogen	1922849	2 mg/mL
Disodium hydrogen phosphate solution	Merk Millipore	106586
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
L-Lysine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	L5626
Paraformaldehyde	Aldrich Chemistry	441244
PGP9.5	Abcam	ab15503	Rabbit polyclonal
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate	Merck Millipore	106346
Sodium (meta)periodate	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Mounting medium