Segmentação de agregados Alpha synuclein em fibras nervosas periféricas cutâneas por ensaio de imunofluorescência livre-flutuante

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para um ensaio indireto deflutuação da imunofluorescência em seções da biópsia da pele que permita a identificação de variações específicas da conformação da doença do sinucleína alfa envolvido na doença de Parkinson e nas proteínas múltiplas do sistema nervoso periférico.

Resumo

Até agora, para a maioria de doenças neurodegenerativas somente um diagnóstico definitivo histopatológico post-mortem está disponível. Para a doença de Parkinson (DP), o diagnóstico ainda depende apenas de sinais clínicos de comprometimento motor que aparecem mais tarde no curso da doença, quando a maioria dos neurônios dopaminérgicos já estão perdidos. Assim, há uma forte necessidade de um biomarcador que possa identificar os pacientes no início da doença ou com o risco de desenvolvê-lo. Durante os últimos anos, a biópsia da pele provou ser uma pesquisa excelente e uma ferramenta diagnóstica para doenças periféricas do nervo tais como a neuropatia pequena da fibra. Curiosamente, uma pequena neuropatia de fibra e alfa sinucleína (αsyn) depósitos neurais têm sido mostrados por biópsia de pele em pacientes com DP. Na verdade, a biópsia da pele tem a grande vantagem de ser um procedimento facilmente acessível, minimamente invasivo e indolor que permite a análise do tecido nervoso periférico propenso à patologia. Além disso, a possibilidade de repetição da biópsia cutânea no decorrer do seguimento do mesmo paciente permite estudar a correlação longitudinal com a progressão da doença. Nós definimos um protocolo confiável padronizado para investigar a presença de agregados αSyn em fibras nervosas da pele do paciente com DP. Este protocolo envolve poucas etapas curtas da fixação, um seccionamento do cryotome e então uma imunofluorescência livre-flutuante que mancha dobro com dois anticorpos específicos: anti produto 9,5 do gene da proteína (PGP 9.5) para marcar as fibras de nervo Cutaneous e o anti 5G4 para detectar agregados αSyn. É um protocolo versátil, sensível e fácil de executar que também pode ser aplicado para direcionar outras proteínas de interesse em nervos da pele. A capacidade de marcar agregados αSyn é outro passo em frente para o uso da biópsia cutânea como ferramenta para o estabelecimento de um diagnóstico histopatológico pré-morte de DP.

Introdução

A biópsia cutânea adquiriu grande importância como ferramenta diagnóstica e de pesquisa no campo das desordens neurológicas¹. Na verdade, a epiderme e a derme contêm abundantes fibras nervosas sensoriais somáticas (mielinizadas e não mielinizadas), terminações nervosas livres nociceptivas, receptores sensoriais e inervação autonômica de glândulas sudoríparas, vasos, glândulas sebáceas e músculo arrector arrectores ^{o 2}.

Em meados do século 20 , a instalação de imunoistoquímica do anticorpo PGP 9.5 permitiu a evidência de uma extensa inervação da epiderme humana³. O PGP 9.5 é um hidrolase do carboxyl-terminal distribuído ingualmente ao longo dos axônios do sistema nervoso central e periférico (PNS). A disponibilidade deste anticorpo permitiu não apenas esclarecer a morfologia e a anatomia da PNS na pele, mas também implementar o estudo de doenças associadas a ele^3,4. A biópsia da pele contribuiu a definir uma entidade clínica nova: a neuropatia pequena da fibra. Diversos grupos internacionais demonstraram a associação entre a perda de fibras de nervo intraepidérmicas e os sintomas/sinais da neuropatia pequena da fibra⁵ pela análise da biópsia da pele e forneceram protocolos estandardizados para a morfometria do nervo assim como valores de referência normativos a serem utilizados na prática clínica^6,7,8.

Recentemente, uma grande quantidade de evidências mostrou que as doenças neurodegenerativas, caracterizadas por acumulações de proteínas desdobradas no sistema nervoso central, são patologias multissistema⁹. Na verdade, a DP é caracterizada por acúmulo de αsyn no neurônio dopaminérgico de substância negra nigra, mas tem sido demonstrado que αsyn e sua forma patológica, αsyn fosforilada (P-αsyn), poderiam ser detectadas também nos tecidos periféricos. Mucosa gastro-intestinal¹⁰, glândulas salivares¹¹, fibras autonômicas da pele que cercam as glândulas sudoríparas e os músculos pilomotores^12,13,14, mostram imunoreatividade a formas patogênicas de αsyn, em acordo com a hipótese de Braak que postular intrigantemente que a patologia de αSyn pode começar no PNS bem adiantado, antes de sua acumulação no cérebro¹⁵. Além disso, a presença de p-αsyn foi demonstrada em nervos cutâneos de pacientes com distúrbios do comportamento REM, que são considerados PD^16,17 assim, a pele patológica αsyn pode ser considerada um promissor periférico precoce marcador histopatológico de sinucleinopatia.

A associação da neuropatia pequena da fibra no paládio foi demonstrada previamente e verificou-se que a densidade intraepidérmicas das fibras de nervo reflete a progressão da doença^18,19. Daqui, a biópsia da pele é uma ferramenta útil para estudar a neurodegeneração no paládio e para estabelecer um diagnóstico histopatológico pre-mortem da doença. Na verdade, a biópsia da pele tem uma grande vantagem de ser um procedimento facilmente acessível e minimamente invasivo, permitindo a análise do tecido nervoso propenso à patologia. Finalmente, a possibilidade de repetição da biópsia cutânea no decorrer do seguimento dos mesmos pacientes permite estudar a correlação longitudinal com a progressão da doença.

Em nosso laboratório, explorando um immuno-mancha dobro com PGP 9.5 e o anticorpo 5g4 monoclonal conformation-específico, que reconhece formulários específicos da doença de αsyn que incluem agregados pequenos^20,21, nós pudemos mostrar o presença de agregados de αSyn nos nervos da pele com uma eficiência diagnóstica elevada prometedora¹⁹. A análise da imunofluorescência da biópsia da pele em doenças conformacional destaca-se como uma fonte promissora de biomarcadores, combinando tanto a detecção de agregados proteicos quanto a medida da neurodegeneração in vivo. Daqui por diante, nós ilustramos um protocolo fácil e versátil em segurar a biópsia da pele e em executar a mancha da imunofluorescência da livre-flutuação para detectar agregados do αSyn. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para alvejar toda a outra proteína do interesse expressada no PNS da pele.

O seguinte protocolo de estudo tem sido utilizado para avaliar a utilidade diagnóstica da análise de αSyn agregada na PNS de DP por biópsia cutânea¹⁹. Os critérios de inclusão para DP foram: um diagnóstico clínico definitivo de acordo com os critérios diagnósticos do banco do cérebro do Reino Unido, duração da doença pelo menos 3 anos, sem antecedentes familiares e sem comprometimento cognitivo maior ou sintomas dissautonômicos maiores na história. Os critérios de exclusão foram causas conhecidas de neuropatia (hemoglobina glicada, creatinina, vitamina B12, TSH, Imunofixação sérica, HIV, HCV, sífilis e borreliose). Cada sujeito foi submetido a biópsias cutâneas de 3 mm de diâmetro em três sítios anatômicos (pescoço no nível dermatomal C8, coxa 10 cm acima do joelho, perna 10 cm acima do maléolo lateral) no lado, o que foi clinicamente mais afetado. Geralmente, o seguinte protocolo é sobre a manipulação da biópsia da pele e a realização da coloração e da análise livre-flutuantes da imunofluorescência. Daqui pode ser adaptado e usado para a deteção de outras proteínas do interesse no tecido da pele.

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética cantonal e todos os sujeitos inscritos deram o consentimento informado por escrito ao estudo.

1. coleção da biópsia da pele

1. Deixe um médico qualificado realizar a biópsia da pele em um ajuste clínico apropriado.
2. Escolha a área para realizar a biópsia da pele e limpe-a com um cotonete de álcool.
3. Prepare a solução anestésica com 1 cc de lidocaína 2%.
4. Com a agulha paralela à área, injete a anestesia local subcutaneously.
5. Após verificar o efeito da anestesia, tome o perfurador descartável de 3 milímetros e aplique a pressão descendente rotacional e delicada para girá-la para baixo através da epiderme e da derma, até que a gordura subcutaneous esteja alcangado.
6. Retire o soco.
7. Use Fórceps descartável para puxar suavemente a ficha da pele para cima.
8. Use tesouras para cortar a base da amostra ao nível do tecido adiposo.
9. Coloque a amostra em um tubo contendo 10 mL de solução fixativa de periodato-lisina-paraformaldeído (PLP).
10. Desinfete a área e cubra-a com uma atadura adesiva.

2. fixação e armazenamento do tecido

1. Faça uma solução de fixação PLP fresca (ver tabela 1).
2. Imediatamente após a coleta da biópsia cutânea, mergulhe-a em um tubo contendo 10 mL de solução fixativa de PLP e incubar-o durante a noite (O/N) a 4 ° c.
3. O dia após, a capa da fumaça, remover suavemente o fixador PLP e no mesmo tubo, lavar a biópsia 3 vezes por 5 min com 5 mL de 0,1 M de solução de Sorensen (tabela 1).
4. Descartar a solução de Sorensen e incubar a biópsia com 5 mL de solução de crio-Protectant O/N a 4 ° c.
5. Guarde a biópsia a 4 ° c se o corte com um criótomo for realizado dentro de 1 semana; Guarde a biópsia a-20 ° c se o corte for realizado dentro de 3 meses; incorporar a biópsia em um cryomold (etapas 3.2-3.4) e armazená-lo em-80 ° c para conservá-lo por um período de tempo mais longo.

3. corte do tecido com um Cryotome

1. Ajuste o cryotome em-20 ° c.
2. Tome um cryomold e encha-o acima com o meio Cryo-incorporando. Evite criar bolhas.
3. Usando pinças mergulhe a biópsia no meio de crio-incorporação com o eixo longitudinal (epiderme-derme) paralelo à parte inferior do criomofo.
4. Fixar o congelamento da amostra com nitrogênio líquido para obter um sólido cubo de crio-incorporação de meio contendo a biópsia na orientação certa.
5. Coloque a amostra no criostat e aguarde 30 min para permitir que a biópsia acclimatize.
6. Fixe a amostra no criostat e corte as secções de 50 μm.
7. Com a ajuda de uma pequena escova, transfira as criosecções numa placa de 96 poços contendo 200 μL de solução anticongelante em cada poço. Uma seção por poço.
8. Conservar a-20 ° c.
   Nota: Se a análise de toda a biópsia não for analisada, corte-a apenas parcialmente. Neste caso, as secções devem ser armazenadas a-20 ° c e a parte remanescente da biópsia a-80 ° c para a conservar durante um período de tempo mais prolongado.

4. coloração da imunofluorescência

1. Encha uma placa de 96 poços, com 100 μL de solução de lavagem.
2. Transfira as secções a serem analisadas a partir da placa de armazenamento para a nova que contém a solução de lavagem. 1 seção por cada poço (4 seções por o local anatômico, por o paciente: geralmente um total de 12 seções por o paciente).
3. Deixe a secção na solução de lavagem durante 10 min à temperatura ambiente (RT). Transfira a secção para outro poço que contenha a mesma solução e repita a lavagem.
4. Mova as secções para novos poços contendo 100 μL de solução de bloqueio e incubar durante pelo menos 90 min e para um máximo de 4 h em RT.
5. Diluir os anticorpos primários anti-PGP 9.5 (Rabbit Polyclonal, 1:1000) e anti-5G4 (rato monoclonal, 1:400) na solução de trabalho.
6. Transfira as secções para novos poços contendo 100 μL da solução de trabalho dos anticorpos primários e incubar O/N na RT.
7. Como passo 4,3, lave as secções 2 vezes durante pelo menos 10 min em RT, com 100 μL de solução de lavagem.
8. Diluir os anticorpos secundários (conjugado com diferentes fluoróforos) goat anti-Rabbit para detectar PGP 9.5 (1:700) e um goat anti-mouse para detectar 5G4 (1:700) na solução de trabalho.
9. Transfira as secções para novos poços contendo 100 μL da solução de trabalho dos anticorpos secundários durante 90 min em RT. A partir deste ponto, cubra a placa 96 bem com folha de alumínio para evitar o branqueamento de fluoróforo conjugado com anticorpo secundário/s.
10. Como passo 4,3, lave as secções 2 vezes durante pelo menos 10 min, com 100 μL da solução de lavagem.
11. Transfira as secções para novos poços contendo 100 μL de DAPI (diluído 1:5000 em PBS 1x) durante 5 min em RT.
12. Como passo 4,3, lave as secções 2 vezes durante pelo menos 10 min, com 100 μL da solução de lavagem.
13. Monte as seções em um slide na posição correta evitando o desdobramento.
14. Adicione algumas gotas do meio de montagem no slide e cubra com uma lamínula.
15. Deixe as lâminas secar O/N antes de utilizar o microscópio confocal/fluorescência.
16. Armazene os slides em uma caixa apropriada a 4 ° c evitando a exposição à luz. Se armazenado com precisão, o sinal será visível por cerca de 6 meses.
    Nota: A transferência de uma seção da placa de poço 96 contendo as fatias recém-cortadas para a placa de poço 96 contendo a solução de lavagem (passo 4,1) é realizada usando uma pequena escova que ajuda a pegar a biópsia. Após a transferência da seção para o primeiro poço, cada vez que a fatia precisa ser incubada com uma solução diferente, movê-lo de bem a bem com a ajuda do pincel.

5. imagiologia por imunofluorescência

1. Veja seções um microscópio de fluorescência invertido ou um microscópio confocal (20X, 40x ou ampliação mais elevada, use frames sucessivos de incrementos de 2 μm em um plano da Z-pilha para melhores resultados).
2. Adquira imagens por uma câmera conectada ao microscópio
3. Use um software de imagem adequado (ou seja, ImageJ) para analisar sinais positivos em seções em termos de distribuição espacial e intensidade do sinal. Para fazer isso, execute as etapas mencionadas abaixo.
   1. Abra o arquivo com o software ImageJ.
   2. Clique na imagem > cor > canais divididos a fim de analisar cada canal de cor.
   3. Clique em Image > stack > projeto Z para obter uma mesclagem de várias aquisições de seção.
   4. Clique em imagem > cor > Mesclar canais para obter uma mesclagem de canais de cores diferentes da mesma aquisição.

Solução anticongelante (armazenar a 4 ° c por até 6 meses)	30% glicerol 30% etileno glicol 30% dH2O amortecedor de fosfato de 10% 2x
Solução de bloqueio (Prepare-se no momento)	Soro normal da cabra de 4% 1% Triton X-100 em solução de lavagem
Cryo-Protectant (armazenar a 4 ° c por até 6 meses)	20% glicerol 80% solução de Sorensen
Solução de fosfato de hidrogênio dissódico (loja em RT até 6 meses)	0.45 m hidrogenofosfato dissódico (Na2HPO4) em dH2O Filtrar em um frasco estéril
Solução de lisina (armazenar a 4 ° c por até 3 semanas)	50% de solução de monocloridrato de L-lisina a 0,3 M 50% de 0,1 M de solução de Sorensen pH 7,6 pH 7,4, filtro em frasco estéril
Paraformaldeído (PFA) 8% (Prepare-se a capa das emanações e armazene-o em 4 ° c por até 1 mês)	2.6 m PFA em dH2O (a 55 ° c _ não exceda 60 ° c para evitar a formação de ácido fórmico) filtro em um frasco estéril
Tampão fosfato 2x (armazenar a 4 ° c por até 6 meses)	6% fosfato monossódico (NaH2PO4) solução 45% fosfato dissódico (Na2HPO4) solução em dH2O
Solução fixativa PLP (Prepare no momento, a capa das emanações)	25% paraformaldeído 8% 0.01 m sódio (meta) periodato 75% solução de lisina <
Fosfato de sódio monohidrato de dihidrogênio (loja em RT até 6 meses)	0.52 m sódio dihidrogênio fosfato mono-hidratado (NaH2PO4 * H2O) em dH2O Filtre em uma garrafa estéril.
Solução de Sorensen (armazenar a 4 ° c por até 1 mês)	2,5% solução de fosfato monosódico 18,7% solução de fosfato dissódico pH 7.6, em dH2O
Solução de lavagem (Prepare-se no momento)	base de 0.25 m Trizma 0.26 m NaCl pH 7.6, em dH2O
Solução de trabalho (Prepare-se no momento)	50% solução de bloqueio 50% solução de lavagem

Tabela 1: Soluções necessárias. Lista de soluções necessárias para o protocolo e breve descrição de como prepará-lo.

Resultados

Após o procedimento descrito (Figura 1), foram detectados agregados αsyn, rotulados com anticorpo 5G4, em fascículos do nervo dérmico inervação de estruturas autonômicas de pacientes com DP. A morfologia dos depósitos de alfa-sinucleina aparece como um sinal pontilhado ao longo dos axônios dos nervos dérmicos (Figura 2). De fato, explorando esse protocolo em 19 pacientes com DP e 17 controles em biópsias cutâneas em três sítios anatômicos (cervica...

Discussão

Nós descrevemos um ensaio de flutuação livre da imunofluorescência para biópsias da pele para o diagnóstico do paládio: explora a imunocoloração dobro com o anticorpo de anti-PGP 9.5, um marcador panaxonal, e o anti-5G4, um anticorpo específico da conformação que reconheça a forma agregada de αSyn.

As grandes vantagens da biópsia da pele para a finalidade diagnóstica no paládio e possivelmente em outras desordens conformacional da proteína são: 1) o acesso direto ao tecido n...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5G4 (anti human αSyneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Mouse monoclonal
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG	Invitrogen	1971418	2 mg/mL
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG	Invitrogen	1922849	2 mg/mL
Disodium hydrogen phosphate solution	Merk Millipore	106586
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
L-Lysine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	L5626
Paraformaldehyde	Aldrich Chemistry	441244
PGP9.5	Abcam	ab15503	Rabbit polyclonal
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate	Merck Millipore	106346
Sodium (meta)periodate	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Mounting medium