자유 부동 면역 형광 분석에 의하여 절단 말초 신경 섬유에 있는 알파 Synuclein 응집체를 표적으로 하는

요약

여기에서, 우리는 파킨슨 병및 파킨슨 병에 관여하는 알파 시누클레인의 질병 특정 형태 변이체의 식별을 허용하는 피부 생검 섹션에 자유 부동 간접 면역 형광 분석에 대한 프로토콜을 제시하고 말초 신경계.

초록

현재까지 대부분의 신경 퇴행성 질환의 경우 사후 조직 병리학적 결정적 진단만 가능합니다. 파킨슨 병 (PD)의 경우, 진단은 여전히 도파민성 뉴런의 대부분이 이미 손실 된 질병 과정에서 나중에 나타나는 운동 관련 의 임상 징후에만 의존합니다. 그러므로, 질병의 시작또는 그것을 개발의 위험한 상태에 환자를 확인할 수 있는 biomarker를 위한 강한 필요가 있습니다. 지난 몇 년 동안, 피부 생검은 작은 섬유 신경 병증과 같은 말초 신경 질환에 대한 훌륭한 연구 및 진단 도구로 입증되었습니다. 흥미롭게도, 작은 섬유 신경 병 증 및 알파 synuclein (αSyn) 신경 예금 PD 환자에서 피부 생 검에 의해 표시 되었습니다. 실제로, 피부 생검은 병리학에 수그린 말초 신경 조직의 분석을 허용하는 쉽게 접근할 수 있고, 최소침습및 고통없는 절차인의 큰 이점이 있습니다. 더욱이, 동일한 환자의 후속 조치 과정에서 피부 생검을 반복할 수 있는 가능성은 질병 진행과의 종방향 상관관계를 연구할 수 있게 한다. 우리는 PD 환자의 피부 신경 섬유에서 αSyn 응집체의 존재를 조사하기 위해 표준화 된 신뢰할 수있는 프로토콜을 설정합니다. 이 프로토콜은 몇 가지 짧은 고정 단계, 극저온 절편 및 다음 두 개의 특정 항체와 자유 부동 면역 형광 이중 염색을 포함: 항 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP9.5) 검출을위한 절단 신경 섬유 및 항 5G4를 표시하기 위해 αSyn 집계. 그것은 또한 피부 신경에 관심있는 다른 단백질을 대상으로 적용 할 수있는 다재 다능하고 민감하고 수행하기 쉬운 프로토콜입니다. αSyn 응집체를 표시하는 능력은 PD의 사전 모뎀 조직 병리학 진단을 확립하기위한 도구로 피부 생검의 사용에 또 다른 단계 앞으로.

서문

피부 생검은 신경 장애 분야의 진단 및 연구 도구로서 큰중요성을 획득했습니다 1. 실제로, 표피와 진피는 풍부한 신체 감각 신경 섬유를 포함 (myelinated 및 unmyelinated), nociceptive 무료 신경 엔딩, 감각 수용체 및 땀샘의 자율 적 내심, 혈관, 피지선과 근육 arrector pilorum ².

20세기 중반에, PGP9.5 항체의 면역운동화학에 대한 설정은 인간 표피 포유류 피부의 광범위한 내막의 증거를 허용했다^3. PGP9.5는 중추 및 말초 신경계(PNS)의 축축을 따라 균등하게 분포된 카복실 말단 하이드라제이다. 이 항체의 가용성은 피부에서 PNS의 형태 및 해부학을 명확히 할뿐만 아니라^3,4와관련된 질병에 대한 연구를 구현할 수있었습니다. 피부 생검은 새로운 임상 엔티티를 정의하는 데 기여했습니다: 작은 섬유 신경병. 몇몇 국제적인 단은 피부 생검 분석에 의하여 작은 섬유 신경병의 경피 신경 섬유의 손실 및 현상/표시 사이 협회를 보여주었고 신경 morphometry를 위한 표준화한 프로토콜을 제공했습니다. 임상 실습6,^7,8에사용되는 규범적 기준값.

최근 많은 양의 증거가 중추 신경계에서 잘못 접힌 단백질 축적을 특징으로하는 신경 퇴행성 질환이 다중 시스템 병리학인^것으로나타났습니다 9. 실제로, PD는 체질니그라의도파민성 뉴런에서 αSyn 축적을 특징으로 하지만, αSyn 및 그의 병리학적 형태, 인산화αSyn(P-αSyn)이 말초 조직에서도 검출될 수 있음을 입증되었다. 위장관 점막^10,침샘^11,땀샘 및 필로모터 근육을 둘러싼 피부 자율 섬유^12,13,14,αSyn의 병원성 형태에 대한 면역 반응성, Braak 가설에 따르면 αSyn 병리학이 뇌에 축적되기 전에 PNS에서 잘 시작될 수 있다고 흥미롭게 가정합니다^15. 또한, p-αSyn의 존재는 프로드로멀 PD^{16,17따라서} 피부 병리학αSyn이 유망한 초기 말초로 간주될 수 있는 REM 행동 장애를 가진 환자의 피부 신경에서 입증되었다. 조직병리학적 세포병리학적 마커.

PD에서 작은 섬유 신경병증의 연관성은 이전에 입증되었으며 상피 내 신경 섬유 밀도가 질병 진행을 반영하는 것으로 나타났다^18,19. 따라서, 피부 생검은 PD에 있는 신경 변성을 공부하고 질병의 pre-mortem 조직 병리학 진단을 설치를 위한 유용한 공구입니다. 실제로, 피부 생검은 병리학에 수그린 신경 조직의 분석을 허용하는 쉽게 접근하고 최소침습 절차인의 큰 이점이 있습니다. 마지막으로, 동일한 환자의 후속 과정에서 피부 생검을 반복할 수 있는 가능성은 질병 진행과의 세로 상관 관계를 연구할 수 있게 합니다.

우리의 실험실에서, PGP9.5및 형태 특이적 단일클론 5G4 항체로 이중 면역 염색을 이용하고, 작은 응집체^20,21을포함하는 αSyn의 질병 특이적 형태를 인식하는, 유망한 높은 진단 효율성과 피부 신경에 αSyn 응집체의 존재^19. 형태 질환에서 피부 생검의 면역 형광 분석은 단백질 응집체의 검출과 생체 내 신경 변성의 측정을 모두 결합하여 바이오 마커의 유망한 공급원으로 두드러집니다. 이하, 우리는 αSyn 응집체검출을 위한 피부 생검 및 자유 부동 면역형광 염색을 수행하는 것에 대한 쉽고 다양한 프로토콜을 설명한다. 더욱이, 이 프로토콜은 피부 PNS에서 발현되는 관심 있는 임의의 다른 단백질을 표적화하기 위해 적응될 수 있다.

이하의 연구 프로토콜은 피부 생검^19에의한 PD의 PNS에서 응집된 αSyn 분석의 진단 유틸리티를 평가하는 데 사용되었다. PD를 위한 포함 기준은: UK Brain Bank 진단 기준에 따라 명확한 임상 진단, 질병 기간 적어도 3 년, 아니 가족력, 및 역사에 있는 중요한 인식 손상 또는 중요한 dysautonomic 현상. 배제 기준은 신경병증(당화혈색소, 크레아티닌, 비타민 B12, TSH, 혈청 면역수정, HIV, HCV, 매독 및 보렐리아증)의 원인으로 알려졌다. 각 대상체는 3개의 해부학적 부위(C8 피부 수준에서 목, 무릎 위 허벅지 10cm, 측면 malleolus 위 다리 10cm)에서 3mm 직경의 피부 생검을 시행했으며, 이는 임상적으로 더 영향을 받았습니다. 일반적으로, 이하의 프로토콜은 피부 생검을 처리하고 자유 부동 면역형광 염색 및 분석을 수행하는 것에 관한 것입니다. 따라서 피부 조직에 관심 있는 다른 단백질의 검출을 위해 적응및 사용될 수 있다.

프로토콜

이 프로토콜은 주 윤리 위원회의 승인을 받았으며 등록된 모든 과목은 연구에 대한 서면 동의를 받았습니다.

1. 피부 생검 컬렉션

1. 자격을 갖춘 의사가 적절한 임상 환경에서 피부 생검을 수행하게하십시오.
2. 피부 생검을 수행하고 알코올 면봉으로 청소 할 영역을 선택합니다.
3. 리도카인 1 cc2 %로 마취 제를 준비하십시오.
4. 바늘이 부위와 평행하게 되면 국소 마취를 피하주사하십시오.
5. 마취의 효과를 확인 한 후, 3mm 일회용 펀치를 가지고 피하 지방에 도달 할 때까지, 표피와 진피를 통해 아래로 회전 회전 회전 회전 과 섬세한 하향 압력을 적용합니다.
6. 펀치를 철회하십시오.
7. 일회용 집게를 사용하여 피부 플러그를 부드럽게 당깁니다.
8. 가위를 사용하여 지방 조직의 수준에서 시편의 기저를 잘라냅니다.
9. 시편을 10 mL의 주기-리신-파라포름알데히드(PLP) 고정 용액을 함유하는 튜브에 놓습니다.
10. 부위를 소독하고 접착제 붕으로 덮습니다.

2. 조직 고정 및 저장

1. 새로운 PLP 고정 솔루션을 만듭니다(표 1참조).
2. 피부 생검의 수집 직후, PLP 고정 용액 10 mL을 포함하는 튜브에 담그고 4 °C에서 하룻밤 (O / N)을 배양하십시오.
3. 다음 날, 연기 후드 에서, PLP 고정제를 부드럽게 제거하고 동일한 튜브에서, 생검을 5 분 동안 3 회 5 mL0.1M 소렌슨 용액 (표 1).
4. Sorensen의 용액을 버리고 4 °C에서 5 mL의 저온 보호 용액 O / N으로 생검을 배양하십시오.
5. 생검을 4°C에서 보관하여 저온종으로 절단하면 1주일 이내에 수행되는 경우; 절단이 3 개월 이내에 수행되는 경우 -20 °C에서 생검을 저장; 생검을 cryomold (단계 3.2-3.4)에 포함하고 더 긴 기간 동안 보존하기 위하여 -80 °C에 저장합니다.

3. 극저온으로 티슈 컷

1. 저온 을 -20 °C로 설정합니다.
2. 크라이오폴드를 타고 저온 포함 매체로 채우십시오. 거품을 만들지 마십시오.
3. 핀셋을 사용하여 생검을 저온 삽입 배지에 세로 축(표피-진피)을 사용하여 저온 졸음의 바닥에 평행하게 담급니다.
4. 스냅은 액체 질소로 샘플을 동결하여 올바른 방향으로 생검을 포함하는 저온 포함 배지의 고체 큐브를 얻습니다.
5. 샘플을 저온 극저온에 넣고 생검이 순응할 때까지 30 분 동안 기다립니다.
6. 저온 극저온에 샘플을 수정하고 50 μm 섹션을 잘라.
7. 약간의 브러쉬의 도움으로, 각 우물에 부동액 200 μL을 포함하는 96 웰 플레이트에 저온 절편을 옮니다. 우물 당 하나의 섹션.
8. -20 °C에서 보관하십시오.
   참고: 전체 생검을 분석하지 않으면 부분적으로만 잘라냅니다. 이 경우, 단면도는 -20°C에서 저장되어야 하며, 생검의 나머지 부분은 -80°C에서 장기간 보존해야 한다.

4. 면역 형광 염색

1. 100 μL의 세척 용액으로 96 개의 웰 플레이트를 채웁니다.
2. 저장 플레이트에서 분석할 섹션을 세척 용액을 포함하는 새로운 섹션으로 옮니다. 각 우물 당 1 섹션 (해부학 사이트 당 4 섹션, 환자 당 : 일반적으로 환자 당 총 12 섹션).
3. 실온(RT)에서 10분 동안 세척 용액에 섹션을 둡니다. 동일한 용액을 함유 한 다른 우물로 섹션을 옮기고 세척을 반복하십시오.
4. 100 μL의 블로킹 용액을 포함하는 새로운 우물로 섹션을 옮기고 RT에서 최소 90 분 동안 최대 4 시간 동안 배양하십시오.
5. 일차 항체 항체를 PGP9.5(토끼 폴리클로날, 1:1000) 및 항-5G4(마우스 모노클로날, 1:400)를 작동 용액에서 희석한다.
6. 1차 항체의 작동 용액의 100 μL을 포함하는 새로운 우물로 섹션을 전송하고 RT에서 O/N을 배양합니다.
7. 4.3 단계로, RT에서 10분 동안 10분 동안 100 μL의 세척 용액으로 섹션을 2회 세척하십시오.
8. 이차 항체(상이한 형광과 결합된 공액)를 희석하여 PGP9.5(1:700) 및 염소 항마우스를 검출하여 작동 용액에서 5G4(1:700)를 검출한다.
9. RT에서 90 분 동안 이차 항체의 작동 용액의 100 μL을 포함하는 새로운 우물로 섹션을 전송합니다. 이 시점에서, 이차 항체 / ies와 공조 형광소의 표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 96 웰 플레이트를 덮습니다.
10. 4.3 단계로서, 100 μL의 세척용액으로 적어도 10분 동안 2회 세척한다.
11. RT에서 5분 동안 100 μL의 DAPI(PBS 1x에서 1:5,000 희석)를 포함하는 새로운 우물로 섹션을 옮니다.
12. 4.3 단계로서, 100 μL의 세척용액으로 적어도 10분 동안 2회 세척한다.
13. 슬라이드에 섹션을 올바른 위치에 놓고 잘못 접지하지 않도록 합니다.
14. 슬라이드에 장착 매체 몇 방울을 떨어뜨리고 커버슬립으로 덮습니다.
15. 공초점/형광 현미경을 사용하기 전에 슬라이드를 건조O/N하게 하십시오.
16. 슬라이드를 4°C의 적절한 상자에 보관하여 빛노출을 피하십시오. 정확하게 저장되면, 신호는 약 6 개월 동안 표시됩니다.
    참고: 새로 절단된 슬라이스를 포함하는 96웰 플레이트로부터 세척용액을 함유하는 96웰 플레이트(단계 4.1)로 단면도의 이송은 생검을 포착하는 데 도움이 되는 작은 브러시를 사용하여 수행된다. 첫 번째 우물에 섹션을 전송 한 후, 슬라이스가 다른 용액으로 배양 될 필요가있을 때마다 브러시의 도움으로 잘에서 잘 로 이동합니다.

5. 면역 형광 화상 진찰

1. 반전된 형광 현미경 또는 공초점 현미경(20X, 40x 이상 배율)에서 섹션을 보려면 최상의 결과를 위해 Z 스택 평면에 2 μm 증분의 연속프레임을 사용합니다.
2. 현미경 연결 카메라로 이미지 획득
3. 적절한 이미징 소프트웨어(즉, ImageJ)를 사용하여 신호의 공간 분포 및 강도 측면에서 섹션에서 긍정적인 신호를 분석합니다. 이렇게 하려면 아래에 언급 된 단계를 수행 합니다.
   1. ImageJ 소프트웨어로 파일을 엽니다.
   2. 각 색상 채널을 분석하기 위해 이미지 > 색상 > 분할 채널을 클릭합니다.
   3. 이미지 > 스택 > Z 프로젝트를 클릭하여 여러 섹션 획득의 병합을 가져옵니다.
   4. 이미지 > 색상 > 채널을 병합하여 동일한 수집의 다른 색상 채널의 병합을 가져옵니다.

부동액 (최대 6개월 동안 4°C에서 보관)	글리세롤 30% 에틸렌 글리콜 30% 30% dH2O 10% 2x 인산완충
차단 솔루션 (지금 준비)	4% 일반 염소 세럼 1% 트리톤 X-100 세탁 용액에서
냉동 보호제 (최대 6개월 동안 4°C에서 보관)	글리세롤 20% 80% 소렌슨솔루션
디소듐 수소 인산염 용액 (RT에서 최대 6개월까지 보관)	dH2O에서 0.45M 디소듐 수소 인산염 (Na2HPO4) 멸균 병의 필터
리신 솔루션 (최대 3주 동안 4°C에서 보관)	0.3M L-리신 모노하이드로염화물 용액 50% 0.1M 소렌슨 용액 pH7.6의 50% pH 7.4, 멸균 병의 필터
파라포름알데히드 (PFA) 8% (연기 후드 에서 준비하고 최대 1 개월 동안 4 °C에서 보관하십시오)	dH2O의 2.6M PFA (포름산 형성을 피하기 위해 60 °C를 초과하지 않는 55 °C_) 멸균 병의 필터
인산염 버퍼 2x (최대 6개월 동안 4°C에서 보관)	6% 인산나트륨(NaH2PO4) 용액 dH 2O의 45% 디소듐 인산염(Na2HPO4) 용액
PLP 픽서솔루션 (순간에 준비, 연기 후드 아래)	25% 파라포름알데히드 8% 0.01M 나트륨 (메타) 주유 75% 리신 솔루션<
이수소 인산나트륨 모노하이드레이트 (RT에서 최대 6개월까지 보관)	dH2O에서 0.52M 디수소 인산나트륨 모노하이드레이트(NaH2PO4*H2O) 멸균 병에 걸으세요.
소렌슨의 솔루션 (최대 1개월 동안 4°C에서 보관)	2.5% 모노나트륨 인산염 용액 18.7% 디소듐 인산염 용액 pH7.6, dH2O
세척 용액 (지금 준비)	0.25M 트리즈마 베이스 0.26M 나클 pH7.6, dH2O
작업 솔루션 (지금 준비)	50% 차단 솔루션 50% 세척 용액

표 1: 필수 솔루션입니다. 프로토콜에 필요한 솔루션 목록및 프로토콜을 준비하는 방법에 대한 간략한 설명입니다.

결과

기재된 절차(그림 1)에 따라, PD 환자의 자율 구조를 내음하는 진피 신경 근막에서 5G4 항체로 표지된 αSyn 응집체를 검출하였다. 알파-시누클레인 침전물의 형태는 진피 신경의 축삭을 따라 점선신호로서 나타난다(그림 2). 실제로, 3개의 해부학적인 사이트 (자궁 경부, 허벅지 및 말단 다리)에 있는 19명의 PD 환자 그리고 17의 통제에 있는 이 프로토콜을 이...

토론

우리는 PD의 진단을 위한 피부 생검을 위한 자유 부동 면역형 광형 분석분석서를 기술합니다: 그것은 반대로 PGP9.5 항체를 가진 이중 면역 염색을 이용합니다, panaxonal 마커 및 반대로 5G4, 집합된 양식을 인식하는 형태 특정 항체 αSyn.

PD에 있는 진단 목적을 위한 피부 생검의 큰 이점은 그리고 그밖 단백질 형태 무질서에서: 1) 온화한 침략적인 기술에 의하여 질병에 수그린 신경 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5G4 (anti human αSyneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Mouse monoclonal
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG	Invitrogen	1971418	2 mg/mL
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG	Invitrogen	1922849	2 mg/mL
Disodium hydrogen phosphate solution	Merk Millipore	106586
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
L-Lysine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	L5626
Paraformaldehyde	Aldrich Chemistry	441244
PGP9.5	Abcam	ab15503	Rabbit polyclonal
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate	Merck Millipore	106346
Sodium (meta)periodate	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Mounting medium