Targeting Alpha Synuclein Aggregati in cutaneous periferici nervose fibre nervose da Pro(Enunciante autofluorescenza libera)

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per un test di immunofluorescenza indiretta a fluttuazione libera sulle sezioni di biopsia cutanea che consente l'identificazione di varianti di conformazione specifiche della malattia di sinucleina alfa coinvolte nella malattia di Parkinson e proteine multiple del sistema nervoso periferico.

Abstract

Ad oggi, per la maggior parte delle malattie neurodegenerative è disponibile solo una diagnosi definitiva istopatologica post-mortem. Per il morbo di Parkinson (PD), la diagnosi si basa ancora solo su segni clinici di coinvolgimento motorio che appaiono più tardi nel corso della malattia, quando la maggior parte dei neuroni dopaminergici sono già persi. Quindi, c'è una forte necessità di un biomarcatore in grado di identificare i pazienti all'inizio della malattia o a rischio di svilupparlo. Negli ultimi anni, la biopsia cutanea si è rivelata un eccellente strumento di ricerca e diagnostica per le malattie nervose periferiche come la piccola neuropatia delle fibre. È interessante notare che, una piccola neuropatia della fibra e sinucleina alfa (SynSyn) depositi neurali sono stati mostrati dalla biopsia della pelle in pazienti affetti da PD. Infatti, la biopsia cutanea ha il grande vantaggio di essere una procedura facilmente accessibile, minimamente invasiva e indolore che consente l'analisi del tessuto nervoso periferico incline alla patologia. Inoltre, la possibilità di ripetere la biopsia cutanea nel corso del follow-up dello stesso paziente consente di studiare la correlazione longitudinale con la progressione della malattia. Abbiamo istituito un protocollo affidabile standardizzato per studiare la presenza di aggregati di Syn nelle fibre nervose della pelle del paziente PD. Questo protocollo prevede pochi brevi passaggi di fissazione, una sezionamento criotomeo e poi una doppia colorazione immunofluorescenza a fluttuazione libera con due anticorpi specifici: antiproteina Gene Product 9.5 (PGP9.5) per contrassegnare le fibre nervose cutanee e anti 5G4 per la rilevazione di : syn. Si tratta di un protocollo versatile, sensibile e facile da eseguire che può essere applicato anche per colpire altre proteine di interesse nei nervi della pelle. La capacità di contrassegnare gli aggregati di Syn è un altro passo avanti verso l'uso della biopsia cutanea come strumento per stabilire una diagnosi istologica pre-mortem della PD.

Introduzione

La biopsia cutanea ha acquisito una grande importanza come strumento diagnostico e di ricerca nel campo dei disturbi neurologici¹. Infatti, epidermide e dermide contengono abbondanti fibre nervose sensoriali somatiche (mielinate e non mitielinate), terminazioni nervose libere nocicettive, recettori sensoriali e innervazione autonoma di ghiandole sudoripare, vasi, ghiandole sebacee e muscolo arrectorilorum ².

A metà del XX secolo, l'installazione per l'immunohistochimica dell'anticorpo PGP9.5 ha permesso l'evidenza di un'ampia innervazione della pelle di mammifero dell'epidermide umana³. PGP9.5 è un'idrolasi carboxyl-terminale equamente distribuita insieme agli assoni del sistema nervoso centrale e periferico (PNS). La disponibilità di questo anticorpo ha permesso non solo di chiarire la morfologia e l'anatomia del PNS nella pelle, ma ha anche implementato lo studio delle malattie ad esso associate^3,4. La biopsia cutanea ha contribuito alla definizione di una nuova entità clinica: la piccola neuropatia delle fibre. Diversi gruppi internazionali hanno dimostrato l'associazione tra la perdita di fibre nervose intraepidermiche e sintomi/segni di nevropatia delle piccole fibre⁵ mediante l'analisi della biopsia cutanea e hanno fornito protocolli standardizzati per la morfometria nervosa e valori di riferimento normativi da utilizzare nella pratica clinica^6,7,8.

Recentemente una grande quantità di prove ha dimostrato che le malattie neurodegenerative, caratterizzate da accumuli di proteine piegate in modo improprio nel sistema nervoso centrale, sono patologie multi-sistema⁹. Infatti, la PD è caratterizzata dall'accumulo di sinistre nel neurone dopaminergico di substantia nigra, ma è stato dimostrato che la Sindsyn e la sua forma patologica, il fosforilo, il sinsyn (P-Syn), potrebbe essere rilevata anche nei tessuti periferici. Musco-intestinale^{mucosa 10}, ghiandole salivari¹¹, fibre autonomiche della pelle che circondano le ghiandole sudoripare e muscoli pilomotori^12,13,14, mostrano l'immunoreattività alle forme patogene di secondo l'ipotesi di Braak che intrigantemente postulare che la patologia di Syn può iniziare in PNS con largo anticipo, prima del suo accumulo nel cervello¹⁵. Inoltre, è stata dimostrata la presenza di p--Syn Syn nei nervi della pelle di pazienti con disturbi del comportamento REM che sono considerati prodromal PD^16,17 quindi la pelle patologica -Syn può essere considerata una promettente periferica precoce marcatore istopatologico della sinucleinopatia.

L'associazione di piccola neuropatia in fibra nella PD è stata dimostrata in precedenza ed è stato trovato che la densità delle fibre nervose intraepidermiche riflette la progressione della malattia^18,19. Quindi, la biopsia cutanea è uno strumento utile per studiare la neurodegenerazione nella PD e per stabilire una diagnosi istopatologica pre-mortem della malattia. Infatti, la biopsia cutanea ha un grande vantaggio di essere una procedura facilmente accessibile e minimamente invasiva, consentendo l'analisi del tessuto nervoso incline alla patologia. Infine, la possibilità di ripetere la biopsia cutanea nel corso del follow-up degli stessi pazienti consente di studiare la correlazione longitudinale con la progressione della malattia.

Nel nostro laboratorio, sfruttando una doppia colorazione immuno-intura con PGP9.5 e l'anticorpo monoclonale 5G4 specificodella conformazione, che riconosce le forme specifiche della malattia di la presenza di srl aggrega nei nervi della pelle con una promettente elevata efficienza diagnostica¹⁹. L'analisi dell'immunofluorescenza della biopsia cutanea nelle malattie conformazionali si distingue come una promettente fonte di biomarcatori combinando sia la rilevazione di aggregati proteici che la misura della neurodegenerazione in vivo. Di seguito, illustreremo un protocollo facile e versatile sulla gestione della biopsia cutanea e sull'esecuzione della colorazione dell'immunofluorescenza a fluttuazione libera per rilevare gli aggregati di syn. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per colpire qualsiasi altra proteina di interesse espressa nel PNS della pelle.

Il seguente protocollo di studio è stato utilizzato per valutare l'utilità diagnostica dell'analisi aggregata di Ssyn nel PNS della PD mediante biopsia cutanea¹⁹. I criteri di inclusione per la PD erano: una diagnosi clinica definita secondo i criteri diagnostici della Banca del cervello del Regno Unito, la durata della malattia di almeno 3 anni, nessuna storia familiare, e nessun grave danno cognitivo o principali sintomi disautonomici nella storia. I criteri di esclusione erano noti cause di neuropatia (emoglobina glicata, creatinina, vitamina B12, TSH, immunofissia del siero, HIV, HCV, sifilide e borreliosi). Ogni soggetto è stato sottoposto a biopsie cutanee di 3 mm di diametro in tre siti anatomici (collo a livello dermatomico C8, coscia 10 cm sopra il ginocchio, gamba 10 cm sopra malleolus laterale) sul lato, che era clinicamente più colpito. In generale, il seguente protocollo riguarda la gestione della biopsia cutanea e l'esecuzione della colorazione e dell'analisi dell'immunofluorescenza a fluttuazione libera. Quindi può essere adattato e utilizzato per il rilevamento di altre proteine di interesse nel tessuto cutaneo.

Protocollo

Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico cantonale e tutti i soggetti arruolati hanno dato il consenso informato scritto allo studio.

1. Collezione di biopsia cutanea

1. Consentire a un medico qualificato di eseguire la biopsia cutanea in un ambiente clinico appropriato.
2. Scegli l'area per eseguire la biopsia della pelle e pulirla con un tampone alcolico.
3. Preparare la soluzione anestetica con 1 cc di lidocaine 2%.
4. Con l'ago parallelo alla zona, iniettare l'anestesia locale sottocutaneamente.
5. Dopo aver controllato l'effetto dell'anestesia, prendi il punzone usa e getta da 3 mm e applica la pressione discendente rotazionale e delicata per ruotarlo verso il basso attraverso l'epidermide e il derma, fino a raggiungere il grasso sottocutaneo.
6. Ritirare il punzone.
7. Utilizzare pinze usa e getta per tirare delicatamente la spina della pelle.
8. Utilizzare le forbici per ritagliare la base del campione a livello del tessuto adiposo.
9. Mettere il campione in un tubo contenente 10 mL di parosina-paraformaldeide (PLP) soluzione fixativa.
10. Disinfettare l'area e coprirla con una benda adesiva.

2. Fissaggio e stoccaggio dei tessuti

1. Creare una soluzione fixativa PLP fresca (vedere la tabella 1).
2. Subito dopo la raccolta della biopsia cutanea, immergerla in un tubo contenente 10 mL di soluzione fissativa PLP e incubarla durante la notte (O/N) a 4 gradi centigradi.
3. Il giorno dopo, sotto il cofano fumato, rimuovere delicatamente il plp fissativo e nello stesso tubo, lavare la biopsia 3 volte per 5 min con 5 mL di 0,1 M soluzione di Sorensen (Tabella 1).
4. Scartare la soluzione di Sorensen e incubare la biopsia con 5 mL di soluzione crio-protettrice O/N a 4 gradi centigradi.
5. Conservare la biopsia a 4 gradi centigradi se il taglio con un criotome viene eseguito entro 1 settimana; conservare la biopsia a -20 gradi centigradi se il taglio viene eseguito entro 3 mesi; incorporare la biopsia in un criostampo (passaggi 3.2-3.4) e conservarla a -80 gradi centigradi per conservarla per un periodo di tempo più lungo.

3. Taglio di tessuto con un criotome

1. Impostare il criotome a -20 gradi centigradi.
2. Prendi un criomuffe e riempilo con il mezzo di crio-incorporamento. Evitare di creare bolle.
3. Utilizzando una pinzetta immergere la biopsia nel mezzo crio-incorporante con l'asse longitudinale (epidermide - dermide) parallelo al fondo del criomuffare.
4. Agganciare il campione con azoto liquido per ottenere un cubo solido di mezzo crio-incorporante contenente la biopsia nell'orientamento giusto.
5. Mettere il campione nel criostato e attendere 30 min per consentire alla biopsia di acclimatarsi.
6. Fissare il campione sul criostato e tagliare le sezioni di 50 m.
7. Con l'aiuto di un piccolo pennello, trasferire le criosezioni in una piastra da 96 pozzetti contenente 200 l di soluzione antigelo in ogni pozzo. Una sezione per pozzo.
8. Conservare a -20 gradi centigradi.
   NOT: Se l'analisi dell'intera biopsia non viene analizzata, tagliarla solo parzialmente. In questo caso, le sezioni devono essere conservate a -20 gradi centigradi e la restante parte della biopsia a -80 gradi centigradi per conservarla per un periodo di tempo più lungo.

4. Immunofluorescenza Colorazione

1. Riempire un piatto di 96 pozzetto, con 100 l di soluzione di lavaggio.
2. Trasferire le sezioni da analizzare dalla piastra di stoccaggio a quella nuova contenente la soluzione di lavaggio. 1 sezione per ogni pozzo (4 sezioni per sito anatomico, per paziente: di solito un totale di 12 sezioni per paziente).
3. Lasciare la sezione nella soluzione di lavaggio per 10 min a temperatura ambiente (RT). Trasferire la sezione in un altro pozzo contenente la stessa soluzione e ripetere il lavaggio.
4. Spostare le sezioni in nuovi pozzi contenenti 100 l of Blocking solution e incubare per almeno 90 min e per un massimo di 4 h a RT.
5. Diluire gli anticorpi primari anti-PGP9.5 (Policlonal di coniglio, 1:1000) e anti-5G4 (mouse monoclonale, 1:400) nella soluzione di lavoro.
6. Trasferire le sezioni in nuovi pozzi contenenti 100 l della soluzione di lavoro degli anticorpi primari e incubarle O/N a RT.
7. Come passo 4.3, lavare le sezioni 2 volte per almeno 10 min a RT, con 100 l di soluzione di lavaggio.
8. Diluire gli anticorpi secondari (coniugati con diversi fluorofori) Capra anti-Rabbit per rilevare PGP9.5 (1:700) e un anti-mouse capra per rilevare 5G4 (1:700) nella soluzione di lavoro.
9. Trasferire le sezioni in nuovi pozzi contenenti 100 l della soluzione di lavoro degli anticorpi secondari per 90 min a RT. Da questo punto, coprire la piastra 96 pozzo con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento del fluoroforo coniugato con anticorpi/e secondari.
10. Come passo 4.3, lavare le sezioni 2 volte per almeno 10 min, con 100 l l della soluzione di lavaggio.
11. Trasferire le sezioni in nuovi pozzi contenenti 100 ll di DAPI (diluito 1:5.000 in PBS 1x) per 5 min a RT.
12. Come passo 4.3, lavare le sezioni 2 volte per almeno 10 min, con 100 l l della soluzione di lavaggio.
13. Montare le sezioni su una diapositiva nella posizione corretta evitando il ripiegamento equiminante.
14. Aggiungere alcune gocce del supporto di montaggio sul vetrino e coprire con una coverslip.
15. Lasciare asciugare i vetrini O/N prima di utilizzare il microscopio confocale/fluorescenza.
16. Conservare i vetrini in un'apposita scatola a 4 gradi centigradi evitando l'esposizione alla luce. Se memorizzato con precisione, il segnale sarà visibile per circa 6 mesi.
    NOT: Il trasferimento di una sezione dalla piastra 96 contenente le fette appena tagliate al 96 pozzo contenente la soluzione di lavaggio (passaggio 4.1) viene eseguito utilizzando un piccolo pennello che aiuta a raccogliere la biopsia. Dopo il trasferimento della sezione nel primo pozzo, ogni volta che la fetta deve essere incubata con una soluzione diversa, spostarla da bene a bene con l'aiuto del pennello.

5. Imaging dell'immunofluorescenza

1. Visualizzare le sezioni al microscopio a fluorescenza invertita o al microscopio confocale (ingrandimento 20X, 40x o superiore, utilizzare fotogrammi successivi di incrementi di 2 m su un piano a stack a z per ottenere i migliori risultati).
2. Acquisire immagini da una telecamera collegata al microscopio
3. Utilizzare un software di imaging adeguato (ad esempio ImageJ) per analizzare i segnali positivi in sezioni in termini di distribuzione spaziale e intensità del segnale. A tale scopo, eseguire la procedura descritta di seguito.
   1. Aprire il file con il software ImageJ.
   2. Fare clic su Immagine > colore > canali di divisione per analizzare ogni canale di colore.
   3. Fare clic su Immagine > pila > progetto per ottenere un'unione di acquisizioni di più sezioni.
   4. Fare clic su Immagine > colore > unisci canali per ottenere un'unione di diversi canali di colore della stessa acquisizione.

Soluzione antigelo (conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi)	30% Glicerolo 30% glicole di etilene 30% dH2O 10% 2x buffer fosfato
Soluzione di blocco (preparare al momento)	4% siero di capra normale 1% Triton X-100 in soluzione di lavaggio
Crio-protettore (conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi)	20% Glicerolo 80% la soluzione di Sorensen
Soluzione fosfato di idrogeno disodio (memorizzare a RT fino a 6 mesi)	0,45M Fosfato di idrogeno disodio (Na2HPO4) in dH2O Filtrare in una bottiglia sterile
Soluzione lisina (conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 settimane)	50% della soluzione monoidrocloruro L-Lysine da 0,3 M 50% della soluzione di Sorensen da 0,1 m pH7.6 pH 7.4, filtro in bottiglia sterile
Paraformaldeide (PFA) 8% (preparare sotto il cofano dei fumi e conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese)	2,6M PFA in dH2O (a 55 oC_non superiore a 60 gradi centigradi per evitare la formazione di acido formico) filtro in una bottiglia sterile
Buffer fosfato 2x (conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi)	Soluzione 6% di fosfato monosodio (NaH2PO4) 45% Soluzione di fosfato Disodium (Na2HPO4) in dH2O
Soluzione fixativa PLP (preparare al momento, sotto il cappuccio del fume )	25% paraformaldeide 8% 0,01M Sodio (meta)periodo 75% Soluzione lisina<
Disidrogeno Diidrogeno Fosfato Monoidrato (memorizzare a RT fino a 6 mesi)	0,52M Disidrogeno Fosfato Monoidrato (NaH2PO4-H2O) in dH2O Filtrare in una bottiglia sterile.
La soluzione di Sorensen (memorizzare a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese)	Soluzione fosfatica monosodica del 2,5% 18,7% Soluzione di fosfato disobbediente pH7,6, in dH2O
Soluzione di lavaggio (preparare al momento)	0.25M Base Trizma 0.26M NaCl pH7,6, in dH2O
Soluzione di lavoro (preparare al momento)	50% soluzione di blocco 50% Soluzione di lavaggio

Tabella 1: Soluzioni necessarie. Elenco delle soluzioni necessarie per il protocollo e breve descrizione di come prepararlo.

Risultati

Seguendo la procedura descritta (Figura1), abbiamo rilevato aggregati di Syn, etichettati con anticorpi 5G4, in fascicoli nervosi dermici innervaccando le strutture autonomiche dei pazienti affetti da PD. La morfologia dei depositi alfa-sinucleina appare come un segnale punteggiato lungo gli assoni dei nervi dermici (Figura 2). Infatti, sfruttando questo protocollo in 19 pazienti affetti da PD e 17 controlli nelle biopsie cutanee in tre siti anatomici (collo del...

Discussione

Descriviamo un test di immunofluorescenza fluttuante per le biopsie cutanee per la diagnosi della PD: sfrutta la doppia immunostaining con anticorpi anti-PGP9.5, un marcatore panassonale e anti-5G4, un anticorpo specifico della conformazione che riconosce la forma aggregata di "Syn".

I grandi vantaggi della biopsia cutanea a scopo diagnostico nella PD e possibilmente in altri disturbi conformazionali proteici sono: 1) l'accesso diretto al tessuto nervoso incline alla malattia con una tecnica l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5G4 (anti human αSyneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Mouse monoclonal
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG	Invitrogen	1971418	2 mg/mL
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG	Invitrogen	1922849	2 mg/mL
Disodium hydrogen phosphate solution	Merk Millipore	106586
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
L-Lysine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	L5626
Paraformaldehyde	Aldrich Chemistry	441244
PGP9.5	Abcam	ab15503	Rabbit polyclonal
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate	Merck Millipore	106346
Sodium (meta)periodate	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Mounting medium