Ориентация Альфа Синуклеин Агрегаты в кожных периферных нервных волокон по свободно плавающей иммунофлуоресценции Анализ

Резюме

Здесь мы представляем протокол для свободно плавающей непрямой иммунофлуоресценции анализ на биопсии кожи разделов, что позволяет для выявления болезни конкретных вариантов конформации альфа-синуклеина, участвующих в болезни Паркинсона и несколько белков периферической нервной системы.

Аннотация

На сегодняшний день для большинства нейродегенеративных заболеваний доступна только посмертная гистопатологическая диагностика. Для болезни Паркинсона (PD), диагноз по-прежнему опирается только на клинические признаки двигательной участия, которые появляются позже в течение болезни, когда большинство дофаминергических нейронов уже потеряны. Таким образом, существует острая потребность в биомаркере, который может идентифицировать пациентов в начале заболевания или на риск его развития. За последние несколько лет биопсия кожи оказалась отличным исследовательским и диагностическим инструментом для периферических заболеваний нервов, таких как небольшая клетчатка невропатии. Интересно, что небольшие волокна невропатии и альфа-синуклеин (Зин) нервных отложений были показаны биопсии кожи у пациентов PD. Действительно, биопсия кожи имеет большое преимущество быть легкодоступной, минимально инвазивной и безболезненной процедурой, которая позволяет анализировать периферические нервные ткани, склонные к патологии. Кроме того, возможность повторения биопсии кожи в ходе наблюдения за тем же пациентом позволяет изучать продольную корреляцию с прогрессированием заболевания. Мы создали стандартизированный надежный протокол для исследования наличия агрегатов «Syn» в волокнах нервов кожи пациента PD. Этот протокол включает в себя несколько коротких шагов фиксации, криотомосирование, а затем свободно плавающей иммунофлуоресценции двойное окрашивание с двумя конкретными антителами: анти протеин ген продукт 9.5 (PGP9.5), чтобы отметить кожные нервные волокна и анти 5G4 для обнаружения «Синтез агрегаты. Это универсальный, чувствительный и простой в исполнении протокола, который также может быть применен для ориентации других белков, представляющих интерес для нервов кожи. Способность маркировать агрегаты «Syn» является еще одним шагом вперед к использованию биопсии кожи в качестве инструмента для установления предсмертной гистопатологической диагностики PD.

Введение

Биопсия кожи приобрела большое значение в качестве диагностического иисследовательского инструмента в области неврологических расстройств 1. Действительно, эпидермис и дерма содержат обильные соматические сенсорные нервные волокна (миелинированные и немиелинированные), ноцицептивные свободные нервные окончания, сенсорные рецепторы и вегетативную инвенвацию потовых желез, сосудов, сальных желез и мышечных арфистых пилорумов ².

В середине 20-го века, установка для иммуногистохимии PGP9.5 антитела позволили доказательства обширной иннервации человеческой эпидермис кожи млекопитающих³. PGP9.5 представляет собой карбоксило-терминальную гидролазу, равномерно распределенную по аксонам как центральной, так и периферической нервной системы (PNS). Наличие этого антитела позволило не только прояснить морфологию и анатомию PNS в коже, но и внедрить исследование заболеваний, связанных с ней^3,4. Биопсия кожи способствовала определению новой клинической сущности: мелкой клетчатки невропатии. Несколько международных групп продемонстрировали связь между потерей интраэпидермальных нервных волокон и симптомами/признаками мелкой клетчатки невропатии⁵ анализом биопсии кожи и предоставили стандартизированные протоколы для нервной морфометрии, а также нормативные эталонные значения, которые будутиспользоваться в клинической практике 6,^7,8.

В последнее время большое количество доказательств показало, что нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся неправильно сложенными накоплениями белка в центральной нервной системе, являются многосистемными патологиями⁹. Действительно, PD характеризуется накоплением син в дофаминергическом нейроне substantia nigra,но было продемонстрировано, что «Син и его патологическая форма, фосфорилированный син (P-'Syn), могут быть обнаружены также в периферических тканях. гастро-кишечная слизистая оболочка¹⁰, слюнные железы¹¹, кожа вегетативных волокон, окружающих потовые железы и пиломоторные мышцы^12,13,14, показать иммунореактивность к патогенным формам Syn, в в соответствии с гипотезой Браак, что интригующе постулировать, что патология syn может начаться в PNS заблаговременно, до его накопления в мозге¹⁵. Кроме того, наличие р-Зсин было продемонстрировано в кожных нервах пациентов с расстройствами поведения REM, которые считаются продромальными PD^16,17 таким образом, патологический кожный синтез можно считать перспективным ранним периферическим гистопатологический маркер синуклейнопатии.

Связь мелкого волокна невропатии в PD было продемонстрировано ранее, и было установлено, что интраэпидермальные нервные волокна плотность отражает прогрессирование заболевания^18,19. Таким образом, биопсия кожи является полезным инструментом для изучения нейродегенерации в PD и для установления досмертной гистопатологической диагностики заболевания. Действительно, биопсия кожи имеет большое преимущество в том, что легко доступная и минимально инвазивная процедура, позволяющая анализировать нервную ткань, склонную к патологии. Наконец, возможность повторения биопсии кожи в ходе наблюдения за теми же пациентами позволяет изучать продольную корреляцию с прогрессированием заболевания.

В нашей лаборатории, используя двойное иммуно-окрашивание с PGP9.5 и конформации конкретных моноклональных 5G4 антитела, что признает болезни конкретных форм "Syn в том числе малых агрегатов^20,21, мы смогли показать наличие агрегатов «Syn» в кожных нервах с перспективной высокой диагностической эффективностью^19. Иммунофлуоресценция анализ биопсии кожи при конформационных заболеваниях выделяется как перспективный источник биомаркеров, сочетая как обнаружение белковых агрегатов, так и меру нейродегенерации в vivo. Далее мы иллюстрируем простой и универсальный протокол по обработке биопсии кожи и выполнению свободно плавающего иммунофлуоресцентного окрашивания для обнаружения агрегатов Syn. Кроме того, этот протокол может быть адаптирован для ориентации любого другого белка, интересуемого в коже PNS.

Следующий протокол исследования был использован для оценки диагностической полезности агрегированного анализа Syn в PNS PD по биопсии кожи¹⁹. Критерии включения для PD были: определенный клинический диагноз в соответствии с диагностическими критериями Банка мозга Великобритании, продолжительность заболевания по крайней мере 3 лет, нет семейной истории, и никаких серьезных когнитивных нарушений или основных дистоветномических симптомов в истории. Критериями исключения были известны причины невропатии (гликированный гемоглобин, креатинин, витамин В12, ТТГ, иммунофиксация сыворотки, ВИЧ, ВГС, сифилис и боррелиоз). Каждый предмет прошел 3 мм-диаметр биопсии кожи на трех анатомических участках (шея на дерматомном уровне C8, бедро 10 см выше колена, нога 10 см выше боковой malleolus) на стороне, которая была клинически более пострадавших. В целом, следующий протокол об обработке биопсии кожи и выполнения свободно плавающей иммунофлуоресцентности окрашивания и анализа. Поэтому его можно адаптировать и использовать для обнаружения других белков, представляющих интерес в тканях кожи.

протокол

Протокол был одобрен Кантональным комитетом по этике, и все зачисленные субъекты дали письменное информированное согласие на исследование.

1. Коллекция биопсии кожи

1. Пусть квалифицированный врач выполняет биопсию кожи в соответствующих клинических условиях.
2. Выберите область для выполнения биопсии кожи и очистить его с алкоголем тампон.
3. Приготовьте обезостереженое раствор с 1 кубиком лидокаина 2%.
4. С иглой параллельно области, вводят местную анестезию подкожно.
5. После проверки эффекта анестезии, принять 3 мм одноразовый пунш и применять вращательное и деликатное понижательное давление, чтобы повернуть его вниз через эпидермис и дерму, пока подкожный жир достигается.
6. Сними удар.
7. Используйте одноразовые щипки, чтобы аккуратно вытащить кожу подключите.
8. Используйте ножницы, чтобы вырезать основание образца на уровне жировой ткани.
9. Поместите образец в трубку, содержащую 10 мл фиксаторного раствора периодии-лизина-параформальдегида (ПЛП).
10. Дезинфицировать область и покрыть его клейкой повязкой.

2. Исправление и хранение тканей

1. Сделать свежий PLP фиксаторное решение (см. Таблица 1).
2. Сразу же после сбора биопсии кожи, погрузить его в трубку, содержащую 10 мл plP фиксаторного раствора и инкубировать его на ночь (O / N) при 4 градусах Цельсия.
3. На следующий день после этого, под дымом капот, удалить PLP фиксатор мягко и в той же трубке, мыть биопсии 3 раза в течение 5 мин с 5 мл 0,1 М Растворсен раствор (Таблица 1).
4. Откажитесь от раствора Соренсена и инкубируйте биопсию 5 мл криозащитного раствора O/N при 4 градусах Цельсия.
5. Храните биопсию при 4 градусах Цельсия, если разрез с криотомом выполняется в течение 1 недели; хранить биопсию при -20 градусах Цельсия, если разрез выполняется в течение 3 месяцев; вставлять биопсию в криомольд (шаги 3.2-3.4) и хранить его при -80 градусах По Цельсию, чтобы сохранить ее в течение более длительного периода времени.

3. Ткань вырезать с криотомом

1. Установите криотомо на уровне -20 градусов.
2. Возьмите криомолд и заполните его крио-встраивающей средой. Избегайте создания пузырьков.
3. Использование пинцета погружайте биопсию в крио-встраивающую среду с продольной оси (эпидермис - дерма) параллельно нижней части криомолда.
4. Привязать заморозить образец с жидким азотом для получения твердого куба крио-встраивательных среды, содержащей биопсии в правой ориентации.
5. Положите образец в криостат и подождите 30 минут, чтобы биопсия акклиматизировалась.
6. Зафиксните образец на криостате и вырежьте 50 мкм секций.
7. С помощью небольшой кисти, передача крио-секций в 96 хорошо пластины, содержащие 200 зл. раствор антифриза в каждом колодце. Один раздел на скважину.
8. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если анализировать всю биопсию не анализируется, вырежьте ее лишь частично. В этом случае секции должны храниться при -20 градусах Цельсия, а остальная часть биопсии - при -80 градусов по Цельсию, чтобы сохранить ее в течение более длительного периода времени.

4. Иммунофлуоресценция окрашивание

1. Заполните 96 хорошо пластины, с 100 л стирального раствора.
2. Перенесите секции для анализа с тарелки на новую, содержащую стиральный раствор. 1 секция на каждую скважину (4 секции на анатомический участок, на одного пациента: обычно в общей сложности 12 секций на пациента).
3. Оставьте секцию в стиральном растворе на 10 мин при комнатной температуре (RT). Перенесите секцию в другой колодец, содержащий тот же раствор, и повторите стирку.
4. Переместите секции в новые скважины, содержащие 100 qL блокирующего раствора и инкубировать, по крайней мере 90 мин и не более 4 ч на RT.
5. Разбавить первичные антитела анти-PGP9.5 (Кролик поликлональный, 1:1000) и анти-5G4 (Мышь моноклональной, 1:400) в рабочем растворе.
6. Перенесите секции в новые скважины, содержащие 100 зЛ рабочего раствора первичных антител и инкубировать их O/N на РТ.
7. В качестве шага 4.3, мыть разделы 2 раза, по крайней мере 10 мин на RT, с 100 зл стирки раствора.
8. Разбавить вторичные антитела (конъюгированные с различными флюорофорами) Коза анти-Кролик для обнаружения PGP9.5 (1:700) и Коза анти-мышь для обнаружения 5G4 (1:700) в рабочем решении.
9. Перенесите секции в новые скважины, содержащие 100 зЛ рабочего раствора вторичных антител на 90 мин на РТ. С этого момента, покрыть 96 хорошо пластины с алюминиевой фольгой, чтобы избежать отбеливания фторфора сопряжены со вторичными антитела / ies.
10. В качестве шага 4.3, мыть разделы 2 раза, по крайней мере 10 мин, с 100 зл стирки раствора.
11. Перенесите секции в новые скважины, содержащие 100 зл DAPI (разбавленные 1:5,000 в PBS 1x) в течение 5 минут на RT.
12. В качестве шага 4.3, мыть разделы 2 раза, по крайней мере 10 мин, с 100 зл стирки раствора.
13. Установите секции на слайде в правильном положении, избегая неправильного сворачивания.
14. Добавьте несколько капель монтажной среды на слайд и накройте крышкой.
15. Пусть слайды сухой O / N перед использованием конфокальный / флуоресцентный микроскоп.
16. Храните слайды в соответствующей коробке при 4 градусах По Цельсию, избегая воздействия света. При точном хранении сигнал будет виден в течение 6 месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Передача секции из пластины 96 скважин, содержащей недавно нарезанные ломтики, на пластину 96 скважин, содержащую стиральный раствор (шаг 4.1), осуществляется с помощью небольшой кисти, которая помогает подобрать биопсию. После переноса секции в первый колодец, каждый раз, когда срез должен быть инкубирован другим раствором, перемещайте его из колодца в колодец с помощью кисти.

5. Иммунофлуоресценция

1. Просмотр разделов под перевернутым флуоресцентным микроскопом или конфокальный микроскоп (20X, 40x или выше увеличения, используйте последовательные кадры с шагом в 2 мкм на плане стек для достижения наилучших результатов).
2. Приобретение изображений с помощью подключенной к микроскопу камеры
3. Используйте адекватное программное обеспечение для визуализации (т.е. ImageJ) для анализа положительных сигналов в разделах с точки зрения пространственного распределения и интенсивности сигнала. Для этого выполните шаги, упомянутые ниже.
   1. Откройте файл с помощью программного обеспечения ImageJ.
   2. Нажмите на изображение , цвет
   3. Нажмите Изображение и стек и стек, чтобы получить слияние нескольких приобретений раздела.
   4. Нажмите изображение

Решение антифриза (хранить при 4 градусах по Цельсию до 6 месяцев)	30% Глицерол 30% этиленгликоль 30% dH2O 10% 2x фосфатный буфер
Блокирующее решение (подготовьтесь в данный момент)	4% Нормальная коза сыворотка 1% Тритон X-100 в стиральном растворе
Крио-защита (хранить при 4 градусах по Цельсию до 6 месяцев)	20% Глицерол 80% решение Соренсена
Раствор фосфата водорода динатрия (хранить на RT до 6 месяцев)	0.45M Фосфат водорода динатрия (Na2HPO4) в dH2O Фильтр в стерильной бутылке
Лизинское решение (хранить при 4 градусах по Цельсию в течение 3 недель)	50% раствор моногидрохлорида 0,3 МЛ-лизин 50% от решения 0.1M Соренсена pH7.6 pH 7.4, фильтр в стерильной бутылке
Параформальдегид (PFA) 8% (подготовьте под капотом дыма и храните при 4 градусах По Цельсия до 1 месяца)	2.6M PFA в dH2O (до 55 градусов по Цельсию, чтобы избежать образования фомийной кислоты) фильтр в стерильной бутылке
Фосфат буфер 2x (хранить при 4 градусах по Цельсию до 6 месяцев)	6% Раствор фосфата натрия monosodium (NaH2PO4) 45% Раствор фосфата динатрия (Na2HPO4) в dH2O
Фиксаторное решение PLP (подготовьте на данный момент, под дымом капот )	25% Параформальдегид 8% 0.01M Натрий (мета)период 75% Лизинское решение;
Дигидроген дигидроген Моногидрат (хранить на RT до 6 месяцев)	0.52M натрия диводород фосфат моногидрат (NaH2PO4'H2O) в dH2O Фильтр в стерильной бутылке.
Решение Соренсена (хранить при 4 градусах по Цельсию до 1 месяца)	2.5% Раствор фосфата натрия мононатрия 18.7% Раствор фосфата динатрия pH7.6, в dH2O
Стиральная раствор (подготовьтесь в данный момент)	0.25M база Трицма 0.26M NaCl pH7.6, в dH2O
Рабочее решение (подготовьтесь в данный момент)	50% Блокирующее решение 50% Стиральная раствор

Таблица 1: Необходимые решения. Список необходимых решений для протокола и краткое описание того, как его подготовить.

Результаты

Следуя описанной процедуре(Рисунок 1), мы обнаружили ,Syn агрегаты, помеченные 5G4 антитела, в дермальных нервных фасциклов иннерватирования вегетативных структур PD пациентов. Морфология альфа-синуклеина появляется как пунктирный сигнал вдоль аксонов дермальных нервов

Обсуждение

Мы описываем свободно плавающий иммунофлуоресценционный анализ биопсии кожи для диагностики PD: он использует двойное иммуносохранение с анти-PGP9.5 антитела, panaxonal маркер, и анти-5G4, конформации конкретных антител, который признает агрегированной форме из «Син».

Большие пр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5G4 (anti human αSyneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Mouse monoclonal
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG	Invitrogen	1971418	2 mg/mL
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG	Invitrogen	1922849	2 mg/mL
Disodium hydrogen phosphate solution	Merk Millipore	106586
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
L-Lysine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	L5626
Paraformaldehyde	Aldrich Chemistry	441244
PGP9.5	Abcam	ab15503	Rabbit polyclonal
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate	Merck Millipore	106346
Sodium (meta)periodate	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Mounting medium