マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の定量化

要約

アテローム性動脈硬化症のマウスモデルは、分子レベルで病原性経路を調査するのに有用なツールであるが、病変発症の標準化された定量化を必要とする。このプロトコルは、大動脈根、大動脈アーチ、および高潔な動脈を含む主要な動脈血管の病変サイズを決定するために最適化された方法を記述する。

要約

心血管疾患は、世界の主な死因です。ほとんどの場合、根本的な原因は、部分的に慢性炎症性疾患であるアテローム性動脈硬化症です。実験的アテローム性動脈硬化症研究は、疾患プロセスにおけるコレステロールおよび炎症の役割を解明した。これは、アテローム性動脈硬化症の臨床症状を減少させる薬剤で成功した臨床試験につながっています。この疾患のマウスモデルにおける慎重かつ適切に制御された実験は、疾患の病因をさらに解明する可能性があり、これは完全には理解されていない。標準化された病変分析は、実験の変動性を低減し、再現性を高めるために重要です。大動脈根、大動脈アーチ、およびブラキオセファリック動脈における病変サイズの決定は、実験的アテローム性動脈硬化症における一般的なエンドポイントである。このプロトコルは、単一のマウスにおけるこれらすべての部位におけるアテローム性動脈硬化症の評価のための技術的な説明を提供する。このプロトコルは、遺伝子組み換え動物が特徴付けられている場合によくあるように、材料が限られている場合に特に有用である。

概要

心血管疾患は虚血性心疾患と脳卒中の主な死因で、4人に1人が^死亡1人を占めている。ほとんどの症例は、アテローム性動脈硬化症、大および中型動脈2の慢性炎症の徴候を伴う脂質を含むプラークのゆっくりとした蓄積を特徴とする疾患によって引き起こされる。この疾患は通常、プラークの破裂または浸食が虚血組織損傷につながる動脈血栓症を引き起こすまで、数十年にわたって気付かれていないままである。

正常な動脈は、内皮細胞を有する内膜層とまばらに分布した平滑筋細胞、平滑筋細胞および弾性ラメラを有する培温層、および緩い結合組織3を有する周囲のアドベンティタル層からなる。LDLの親密な保持は、アテローム性動脈硬化症の発症^{を相殺する4.}リポタンパク質の蓄積および修飾は、動脈内の凝集および閉じ込めにつながる5.炎症反応は、捕らえられ、修飾されたリポタンパク質6によって誘発される。内皮細胞は、乱流血流を有する動脈の樹木部でVCAM-1などの接着分子を発現し始め、循環単球および他の白血^球7の募集につながる。浸潤単球は、マクロファージ発泡細胞への変換を伴う脂質を巻き込むマクロファージに分化^する8.

アテローム性動脈硬化症は、1980年代半ば以来、頻度が増加するマウスモデルで研究されています。C57BL/6は、これらの研究のために最も一般的に使用される生まれつきマウス株であり、遺伝子組み換え株9の大部分の遺伝的背景として使用される。この株は1920年代^の10で確立され、そのゲノムは2002¹¹に出版されました。マウスモデルの実験にはいくつかの利点があります:コロニーは高速に再現し、ハウジングはスペース効率が良く、繁殖は実験の変動を減らします。このモデルはまた、標的遺伝子の欠損やトランスジーンの挿入などの遺伝子操作を可能にします。これは、疾患の新しい病態生理学的理解と新しい治療^目標12につながっています。

野生型C57BL/6マウスは、アテローム性動脈硬化症に対して自然に耐性である。彼らはHDLで循環コレステロールのほとんどを有し、および複雑なアテローム硬化性病変は、高脂肪および高コレステロール^食13を供給しても形成されない。したがって、C57BL/6バックグラウンド上のア^{ポー-/-のような}高コレステロール血症マウスは、アテローム性動脈硬化症14,15の実験モデルとして使用される。ApoEの欠如は、残りのリポタンパク質の肝摂取を損ない、脂質代謝をひどく乱れる。^Apoe-/-マウスでは、循環コレステロールは主にVLDL粒子中であり、マウスは通常のチョウ食に複雑なアテローム硬化プラークを発症する。

^Ldlr-/-マウスは、家族性高コレステロール血^症16を有するヒトに見られるアテローム性動脈硬化症の発症を模倣する。^Ldlr-/-マウスは、アテローム性動脈硬化症を発症するために西洋型の食事を必要^とする17.西洋の食事は人間の食物摂取を模倣し、通常0.15%のコレステロールが含まれています。LDL受容体はApoB100およびApoEを認識し、エンドサイトアシスを介してLDL粒子の取り込みを仲介する。LDL受容体は循環からのLDLの肝臓クリアランスの基礎であり、血行細胞におけるLDL受容体発現はこのプロセスに影響を与えない。これにより、高コレステロール血症Ldlr-/-^レシピエントへのLdlr+/+細胞の骨髄移植の可能性とアテローム性動脈硬化症の発症の評価が可能になります。 骨髄キメラは、一般的に実験的アテローム性動脈硬化症における血統細胞の参加を研究するために使用されている。しかし、骨髄移植はアテローム硬化性プラークの大きさと組成に影響を与え、結果の解釈をあいまいにする可能性がある。

ア^ポー-/-およびLdlr-/-^マウスの異なる変異体は、疾患18の特定のプロセスを研究するために開発された。一例は、全長ヒトAPOB100遺伝子19,20を担持するヒトAPOB100-トランスジェニックLdlr-/-(HuBL)マウスである。 これらのマウスは、定期的なチョウダイエットで高コレステロール血症とアテローム性動脈硬化症を発症する。しかし、複雑なアテローム硬化性プラークの開発には少なくとも6ヶ月かかり、より短い実験プロトコルは通常、西洋の^食事21を使用する。血漿コレステロールの大部分がLDL粒子中に循環しており、これはHuBLマウスにア^{ポー-/-およびLdlr-/--マウス}と比較して、よりヒト様の脂質化リポタンパク質プロファイルを与える。HuBLマウスはまた、自己抗^原22としてのヒトapoBの研究を可能にする。

アテローム性動脈硬化症のマウスモデルは、ヒト疾患の共有特徴を有する複雑なアテローム硬化性プラークを発症する。しかし、プラークは、続く心筋梗塞で破裂に対してかなり耐性があります。アテロームローム症は散発的に検出され、23、24、25を評価するために実験的に挑戦的である。プラーク破裂の特別なモデルが開発されているが、実験分野はプラーク安定剤の評価のための信頼性と再現性のモデルを欠いている。

アテローム性動脈硬化症の定量化は、文献内で多くの方法で報告されている。最近の取り組みは、動物実験の実験設計、実行、および報告を標準化しようとしている²⁶.研究者は、彼らの研究室に適応異なる好みや技術を持っています。ほとんどの研究プロジェクトは、プロトコルの変更を必要とする方法でもユニークです。疾患の多因子性のために、最適な制御はプロジェクトによって異なります。局所的な状況や標準化の欠如は、疾患発症の観察された違いを引き起こす可能性があり、研究分野の進歩を妨げている。実験変動の違いはまた、統計的電力計算が局所条件下でのパイロット研究に基づく必要があることを意味します。

アテローム性動脈硬化症の定量化は、血管の木のいくつかの場所で推奨されます。このプロトコルは、他の分析のために胸部大動脈の残りの部分を残すことに加えて、単一のマウスで大動脈根、大動脈アーチ、およびブラキオセファリック動脈から結果を得る方法を説明する。エンフェイス製剤は、大動脈アーチにおける脂質を含むプラークの迅速な定量を可能にする。検体を注意深く表示すれば、上腕動脈の疾患負担も定量化できる。大動脈根の断面に時間がかかるほど、プラーク組成物の詳細な評価に利用できるいくつかのセクションが残ります。

プロトコル

すべての動物実験は、倫理当局の承認を必要とします。

1. 大動脈のマウスの犠牲と微小解剖

1. CO2窒息と記録重量によってマウスを犠牲にする。
2. サンプルの毛皮の汚染を避けるために70%のエタノールでマウスをスプレーします。マウスをサフィンの位置に置きます。ジャグラーノッチから、マヨハサミを使って中線切開を行い、ほとんど恥骨まで伸ばします。
   注意:高い割合のエタノールは非常に可燃性であり、深刻な眼刺激を引き起こす可能性があります。予防措置を講じる。
3. 23Gの針を使用して、胸壁を通して心臓穿刺によってマウスを吐き出します。この手順は、通常、20週齢のマウスから750 μLの血液を得る。典型的には、三カリウムEDTAコーティングチューブで体積の半分を収集し、残りの半分を血清またはリチウムヘパリンコーティングチューブに入れます。チューブをそっと回し、さらに処理するまで室温に保ちます。
4. マヨはさみを使用して、腹腔を開くために中線の頭頂腹膜を切断します。組織鉗子でxiphoidプロセスを保持し、両側に腹膜を横に開き、横隔膜を開き、横隔膜を開き続けます。
   1. マヨはさみを使用して、可能な限り横に肋骨ケージを切断して胸腔を開きます。これは、後で大断を微細分解しながら、楽器のための広い角度を可能にします。
5. 灌流液の排水のための右の耳の切開を作る。頭蓋方向に心臓の頂点を通して27 Gの針を挿入します。少なくとも2分の間に10 mLの冷たいリン酸緩衝生理食べ物(PBS)でマウスをゆっくりと浸透させながら、左心室に針を固定しておきます。
   注:一部のプロトコルはパラホルムアルデヒド灌流を使用しますが、これはリンパ球の免疫組織化学分析など、いくつかの下流アプリケーションを妨げる。したがって、パラホルムアルデヒドを用いる灌流固定は、このプロトコルでは行われなかった。
6. 解剖鉗子を使用して、目的の器官(例えば、リンパ節、脾臓、肝臓、腸、鼠径脂肪パッド、腎臓など)を解剖し、はさみを解剖する。
7. 大動脈のアーチを傷つけることなく、心臓の右側の気管と食道を切り取る。内臓を後腹膜に付着させる横隔膜と構造を切断し、心臓、大様、腎臓をその中に残します。肺と内臓を慎重に折りたたみ、ナプキンで覆い、大動脈下リンパ節および腹部大動脈の後腹膜微小切除を開始する。
8. 6倍の倍率で立体顕微鏡下で微小解剖を開始します。デュモン鉗子で周囲の組織を持ち上げ、ヴァンナスのはさみで緊張の下で切断することにより、大動脈分岐を解剖し始めます。
   1. 腹部大動脈の解剖を頭蓋骨に続ける。大動脈から腹部の枝を切り取り、横隔膜の大動脈を通して大動脈を近位に解放する。
      注:微小断分断は、ステレオ顕微鏡を介して正確な手と目のコーディネーションを必要とし、マスターするにはいくつかの練習が必要です。
9. 胸部大胸を覆う脂肪組織を取り除く。慎重に枝で大動脈のアーチを解放するために胸腺の後部を解剖します。胸腔内で頸動脈を可能な限り遠位に解剖し続ける。特別な場合には、頸部の分岐を含むように頸部解剖を行うことができる。
10. 脱イオン水、RNase除染液、70%エタノール、PBSで連続的なすすびで機器をきれいにしてから、実際に大腸を切断します。鉗子で頂点によって心臓を持ち上げます。心臓の近くに大小管をカットし、PBSとチューブに全体の心臓を置きます。心臓は、大動脈根の処理と凍結を続ける前に、数時間氷の上に保存することができます。
11. 図 1Aに従って大動脈のアーチを切る。4°Cで一晩4%ホルムアルデヒドの1 mLを含むチューブに大動脈アーチを入れます。試料は、ピン留めと分析の前に数年間、この方法で保存することができます。
    注意:ホルムアルデヒドは、癌、アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性があり、飲み込むと有害です。必要に応じて個人用保護具を使用してください。
12. 残りの降下大管を解剖し、RNA安定化溶液に入れたり、その後のRNA分析やその他の用途のために凍結をスナップします。解剖時間を最小限に抑えるために作業フローを最適化することは、過度のRNA劣化を避けるために重要です。
13. 血液採取管(ステップ1.3で収集)を遠心分離機に入れます。室温で15分間、別々のプラズマと血清管を1,500 x gでスピンダウンします。プラズマと血清をマイクロ遠心管に慎重に移し、-80°Cで保存します。EDTAおよびヘパリン化された血漿または血清の両方を集めることは、複数の下流アプリケーションの可能性を残します。
14. 心臓をコルクベッドの上に置き、腹部を上に向けて置きます。頂点を通して針でコルクに心臓を固定します。解剖鉗子で心臓の基盤を握る。
    1. メスを使用して、矢状面で20°の矢状に20°の矢状に傾斜した2つの聴覚との間の線としてカットの方向を持つ心臓の頂点2/3を切り取ります(図1B)。
15. 大動脈根を最適な切断温度(OCT)化合物に埋め込み、周囲を囲むが、組織に浸透しない。心臓の基部をOCT化合物に浸します。大動脈根をOCTで満たし、気泡を取り除くために鉗子で心臓をそっと絞ります。
16. OCTで満たされたクライムオールドの底に標本を移します。大動脈根は、底面に対して垂直にする必要があります。取り付けた心臓をドライアイスに入れて凍らせます。このプロトコルのセクション3に従って凍結切除を追求するまで、-80 °Cでジップロックバッグに標本を保管してください。

図1:その中の心臓と大動脈のアーチ。(A) 肺、気管、食道、胸腺を除去し、20週齢の雌アポー-/-マウスを顕微鏡写真で通常のチョウダイエットに表示するために、スケールバー=2mmを表示する。点線は、大動脈のアーチとその枝をカットする場所を示します。(B) 心臓と大器の概略図。赤の点線は、大動脈根を凍結する前に心臓を切る場所を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. 大動脈アーチとブラキオケファリック動脈の顔解析

1. 大動脈アーチの顔解析用のピン留めベッドを準備します。平らな25mm x 25mmの表面を作るためにパラフィンワックスフィルムのセグメントを8回折ります。黒い電気絶縁テープで包んで、大通りの暗い背景を作ります。ピン留めベッドの裏側にラベルを貼り、鉛筆を使用してマウス識別番号を書きます(通常のペンインクは染色プロセスで消えます)。
2. 大動脈のアーチをピン留めベッドに移し、その上にPBSの滴を置きます。立体顕微鏡下で残りの体脂肪組織から大歯の洗浄を開始します。
   1. 大げさや損傷を与えることなく、周囲のすべての脂肪組織を優しく剥離するには、ヴァンナスのはさみとデュモン鉗子を使用してください。スーダンIVは脂肪組織を明るく染色し、この時点ですべてのそのような組織を除去することが重要です。
      注:必要に応じて、常に追加のPBSを適用して大小間を湿らせておいてください。
3. 大動脈内の大動脈を切り開き、大動脈内のバンナスはさみを導入して、親密な表面を露出させます。遠位方向に上昇アーチの外側の曲率をカットし、上皮動脈を含む枝を開き続けます。下降胸部領域の後部をスペアします。
   1. より小さい曲率を切り開き、大曲を折りたたんで親密な表面を表示します。
      注:このステップは、細かい運動能力を必要とし、習得するためにいくつかの練習を必要とします。
4. ミヌチン昆虫ピンの鈍い端を使用して、ピン留めベッドに開いているアーチをピン留めします。マイクロカストロビエホ針ホルダーを使用してピンを所定の位置に置きます。ピンを所定の位置に置くとき、試料からそっと曲げます。試料を伸ばさずにベッドの上に大器を平らに固定します。4 °CでPBSで満たされたペトリ皿に下向きにピン留めアーチを格納します。
   注:プロトコルはここで一時停止できます。
5. スーダンIVの作業ソリューションを準備します。スーダンIV粉末1g、70%エタノールの100mL、アセトン100mLをダークボトルに混ぜ、10分間静かにかき混ぜます。溶液をフィルタリングする必要はなく、室温で暗く保たれた場合、数ヶ月間使用することができます。染色色が満足できない場合は、新しい溶液を作り、試料を再び染色することができます。
   注意:アセトンは、深刻な目の刺激を引き起こす可能性のある可燃性の液体です。換気の良い場所に保管し、取り扱い時には予防措置を講じてください。
6. ラボベンチに5つのペトリ皿を配置します:1つは70%のエタノールで満たされ、1つはスーダンIV作業溶液で満たされ、2つは80%のエタノールで満たされ、もう1つはPBSで満たされています。
   1. 最初のペトリ皿にピン留めベッドを下向きにして、70%のエタノールで試料を5分間すすいでから始めます。試料をスーダンIV作動液に移し、アーチを7分間染色させる。
   2. 次に、80%エタノールを3分間3分間すすいで、正常な親密な表面を脱染させる。デステイン時間を調整して、結果を最適化できます。最後に、元のペトリ皿に標本を戻す前にPBSですすいでください。
7. デジタルカメラに接続された倍率10倍の立体顕微鏡を使用して顕微鏡を取得します。小さな金属の重量(20 mm x 10 mm x 5 mm)を使用してPBSに沈んだピン留めされたアーチの写真を撮り、ペトリ皿の底にピン留めベッドを保持します。イメージのキャリブレーションのために、大王の横にルーラーを配置します。
8. 画像解析ソフトウェア(例:ImageJ)を使用して、病変面積と全面面を決定します。大動脈のアーチを定義する解剖学的ランドマークが欠如している場合、測定は通常、上昇大動脈の始まりから最初の肋間枝まで行われます(図2A)。ソフトウェアの面積定量機能を使用して、合計インティマル アーチ領域を手動で囲みます。
   注:病変定量は盲目的な方法で行われるべきであり、2番目の研究者が結果を確認することをお勧めします。
   1. ImageJ で、ポリゴン選択ツールを選択し、繰り返しクリックして合計アーチ面積を囲みます。次に、分析メニューでメジャーを選択し、結果ウィンドウに合計アーチ領域を表示します。
   2. 次に、アーチ内のすべてのスーダンIV染色プラークを囲みます。スーダンIVは、脂質、トリグリセリド、リポタンパク質をオレンジ赤色で染色するリソクロムジアゾ色素です。ImageJ で、フリーハンド選択ツールを選択し、Alt キーを押しながらすべてのプラークを囲みます。分析メニューのメジャーをクリックすると、病変のないアーチ領域が結果ウィンドウに表示されます。
   3. 負傷のない領域を合計アーチ領域から差し引き、結果を合計アーチ面積で除算して、相対病変領域を計算します。
9. 鎖骨下動脈と頸動脈を注意深くピン留めし、上皮吸止め動脈における病変定量を可能にする(図2A)。鎖骨下動脈および一般的な頚動脈の病変の定量化は、通常、非常に困難であり、それぞれ意味がない。
   1. ImageJ では、シフト キーを押しながらポリゴン選択ツールを使用して、両側頭動脈の両方の部分を囲みます。分析メニューのメジャーをクリックすると、結果ウィンドウに全ブラキオセファリック動脈領域が表示されます。
   2. 次に、フリーハンド選択ツールを選択し、Alt キーを押しながら、ブラキオケファリック動脈のすべてのプラークを囲みます。分析メニューのメジャーをクリックして、病変のないブラキオセファリック動脈領域を結果ウィンドウに表示します。
   3. 全ブラキオセファリック動脈領域から病変のない領域を差し引き、その結果を全ブラキオエファリック動脈領域で除算して、相対病変領域を計算します。

図2:アテローム硬化性病変定量。(A) 20週齢の雄ヒトAPOB100-トランスジェニックLdlr ^-/-(HuBL)マウスから大動脈アーチを10週間食べさせ、スーダンIVを用いた脂質が豊富なプラークに対して開いて染色した。 総大動脈アーチ表面積は、顕微鏡写真の白色点線で輪郭を描き、スケールバー = 2 mm です。黄色の点線は、ブラキオセファリック動脈の全表面積を概説します。(B)20週齢の雄Ldlr-/-マウスは、顕微鏡写真で可視化された8週間の西洋食を、スケールバー=500μmで大動脈性大動脈内生から400μmで供給した。 黒の点線は、全血管面積と動脈内膜に局在するオイルレッドOで染色されたアテローム硬化性病変の輪郭を描く。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

3. 大動脈根の凍結切除

1. クライオスタット温度を-20 °C に設定し、断面の厚さを 10 μm に設定します。切断を開始する間、試料ホルダーに平行になるように断面の位置合わせを微調整します。
2. 折り目のないセクションを簡単に収集するように、周囲のOCTを過度に取り除きます。心臓の基部が金型に正しく配置されたことを考えると、大動脈根はナイフブレードに垂直に配置される必要があります。
3. 廃棄される通常の顕微鏡スライド上の初期制御セクションを収集します。最初のセクションは、唯一の心筋組織を含む必要があります.その時点で断面を 200 μm 進めてください。セクションを収集し、光顕微鏡で進行状況を確認します。
4. 左心室の流出路に近づくと、顕微鏡下で100μmごとに確認してください。容器壁の初期徴候が観察されるとき、50 μmにペースを遅くする。
   注:最初の大動脈カスプが表示されると、これはセクションを収集するためのポイント 0 になります。カスプがいつ正確に現れるかを見るのは難しいかもしれませんが、同じ領域の病変の比較を行うには正確なローカリゼーションが重要です。
5. 標本をポイントゼロカスプに向かって傾けて、断面平面を他の 2 つのカスプに合わせます。これは、大断の真の断面を得るために重要です。大動脈根の描画を作成し、カスプが現れることを示し、ポイント 0 以降にカットされた 10 μm セクションごとにカウントします。
   1. 2番目のカスプが現れたら、試料をカスプからもう一度傾けて、標本を3番目のカスプに合わせます。カスプ間のレベル差は50 μmを超えてはなりません。
   2. 図 3のスライド計画に従ってセクションを収集します。大動脈根が50μmを超える場合は、190μmからセクションの収集を開始し、さらにスペースを空けてルートを直線的な位置に整列させることができるようにする。ポイントゼロから800 μmのレベルに達するまで断面を続けます。このレベルで目に見えるプラークがまだある場合、コレクションは 1,000 μm に拡張できます。
      注:簡略化されたスライドの編成を補足図 1に示します。最適なスライド計画は、プロジェクト計画に応じて決定する必要があります。
6. 収集後のセクションを修正します。
   1. このプロトコルのセクション4を追求するまで、脱イオン水、乾燥、および室温で10分間4%ホルムアルデヒドでコラーゲンのオイルレッド染色とピクロシリウス赤染色のために収集されたセクションを修正します。スライドがすぐにオイルレッドOで染色し、まだ濡れている場合は、乾燥プロセスをスピードアップするために1分間60%イソプロパノールに入れます。
      注意:イソプロパノールは、深刻な目の刺激を引き起こす可能性があり、眠気やめまいを引き起こす可能性がある可燃性の液体です。換気の良い場所に保管し、取り扱い時には予防措置を講じてください。
   2. 氷冷純粋なアセトンで免疫組織化学または免疫蛍光のために収集したセクションを10分間、室温で30分間乾燥させ、-20°Cの店舗セクションを固定します。

図 3: 大動脈根のシリアルセクションのスライドの編成。上昇大動脈の最初の800 μmにまたがる10 μmの厚さのセクションごとに大動脈根の凍結切除の間に収集されるべきである。さまざまなアプリケーションに適したセクションを取得するには、体系的なスライド組織が必要です。病変組成物の分析には、通常、脂質に対するオイルレッドO染色およびコラーゲン用のピロシリウス赤染色が含まれる。残りのセクションは、免疫組織化学および免疫蛍光染色のためにアセトン固定を収集し、固定する。この図は、Gisterå et al³⁰から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

4. 大動脈根におけるアテローム性動脈硬化症の油赤色染色と定量

1. イソプロパノールの100mLにオイルレッドOの1gを溶解することにより飽和オイルレッドO溶液を調出します。室温で1時間暗いボトルで溶液をかき混ぜます。飽和溶液は、数ヶ月間保持することができます。
   注:溶液に接触した機器の洗浄が困難なため、オイルレッドO染色用の実験装置を指定することをお勧めします。
2. 飽和オイルレッドO溶液の75mLを50mLの脱イオン水と混合して作業溶液を調作する。定性フィルターペーパーを通して10分間室温に立たせてください。
3. スライドをオイルレッドO作動液に20分間水道水に入れ、5分間使用します。
4. 組織の視覚化を支援するために、5分間ぬるま湯でメイヤーのヘマトキシリンで1分間染色します。すべての核は、青色で染色する必要があります, 結果を最適化するために染色時間を調整.
5. 水性取り付け媒体(例えば、カイザーのグリセロールゼラチン)にスライドを取り付ける。ウォームカイザーのグリセロールゼラチンを40°Cにして、使用前に流体にします。取り付け媒体は水ベースであるため、スライドを乾燥させる必要はありません。カバーガラスを追加する際は、気泡の形成を避けるように注意してください。
   注意:カイザーのグリセロールゼラチンにはフェノールが含まれており、遺伝的欠陥を引き起こす可能性があります。必要に応じて個人用保護具を使用してください。
6. 光顕微鏡に接続されたカメラを使用してデジタル顕微鏡を取得します。通常、完全な血管壁と病変境界は、50倍の倍率で明確に視覚化することができます。高解像度の画像を保存します(できれば、タグ付き画像ファイル形式(TIFF))。
7. コンピュータ支援画像解析ソフトウェアシステムを用いて病変サイズの解析を行う。オイルレッドOは、中性脂質を染色し、強い赤色でアテローム硬化性プラークを可視化するリソクロムジアゾ色素であり、病変定量を支援します。
   注:病変定量は盲目的な方法で行われるべきであり、第二の研究者が得られた結果を確認することをお勧めします。
   1. 画像解析ソフトウェアの面積定量機能を使用して、大動脈血管壁の外部弾性積水を囲むことで全血管面積を定義します(図2B)。ImageJ で、ポリゴン選択ツールを選択し、繰り返しクリックして領域を囲みます。次に、分析メニューでメジャーを選択します。船舶の合計面積が結果ウィンドウに表示されます。
   2. 内部弾性層および明面境界によって定義される血管の内皮層におけるアテローム硬化性病変を定量し続ける。通常、弁カスプ上の病変は^測定27から除外される。ImageJ で、フリーハンド選択ツールを選択し、Alt キーを押しながらすべてのプラークを囲みます。分析メニューでメジャーを選択し、結果ウィンドウに病変のない血管領域を表示します。
   3. 全血管面積から病変のない面積を差し引き、その結果を合計容器面積で除算して、相対病変面積を計算します。
      注:平方マイクロメートルで絶対病変領域を得るために使用される倍率に従って画像解析ソフトウェアで結果を校正します。
8. 画像解析ソフトウェアの色しきい値機能を使用して、病変領域全体のオイルレッド O 陽性面積のパーセンテージを計算して、病変のオイル レッド O 染色領域を定義します。
   1. ImageJ では、シフトキーを押しながらフリーハンド選択ツールを使用して、すべての病変領域を囲みます。分析メニューで測定を選択して、結果ウィンドウに病変領域の合計を表示します。
   2. 編集メニューで[外側をクリア]を選択します。イメージの種類をイメージ メニューの 8 ビットに変更します。
   3. 画像メニューの調整サブメニューでしきい値を選択して、オイルレッドO負の領域に赤いしきい値を設定します。[適用] をクリックします。プロセス メニューのバイナリ サブメニューでこのオプションを選択して、イメージをバイナリにします。
      注:通常、オイルレッドO染色はバッチ間で変化する。したがって、色のしきい値は、同じ染色バッチ内でのみ推奨されます。結果は、しきい値がどのように決定され、標準化されたかを説明するとともに表示する必要があります。
   4. 分析メニューでパーティクルの分析を選択して画像を分析し、[OK] をクリックします。オイルレッドO負の病変領域の合計がサマリーウィンドウに表示されるようになりました。相対オイルレッドO正の面積を計算するには、オイルレッドO負の領域を合計病変面積から差し引き、合計病変面積で除算します。

結果

アテローム性動脈硬化症のマウスモデルでは、最も顕著な病変は大動脈根および大動脈アーチで発症する傾向がある。このプロトコルは、大動脈根、大動脈アーチ、および単一のマウスにおける上皮動脈動脈におけるアテローム性動脈硬化の定量を記述する。胸部下降大動脈および腹部大動脈の測定可能な病変は、事前疾患を有する動物にのみ存在する。このプロトコルでは、これらの部分はアテローム硬化性の負担のために分析されるのではなく、mRNAレベルまたは他の分析の後続の分析のために保存される。大動脈根のアテローム硬化性病変の連続部分は、通常、y軸上の病変サイズとx-軸28上の大動脈腔までの距離を持つグラフに表示される。真の断面は、病変サイズ定量に不可欠です。斜めのセクションは病変サイズを過大評価することができ、わずか20°の傾きは15%29によって絶対病変表面を過大評価することができる。しかし、全血管面積の病変分率を計算すると、断面時に起こりうる角度の違いに対する影響が少なくなります(図4A)。グループ間の差異を検出するための適切な統計的方法は、通常、分散の通常の2ウェイ分析(ANOVA)です。ボンフェローニの後テストは、特定のレベルでの違いを検出するために行われます.フィッシャーの最も有意な差は、ANOVAのフォローアップテストとしても使用できます。これは、タイプ II の統計エラーの可能性を減らしますが、複数の比較を考慮しません。さらに、曲線の下の面積またはマウスあたりの平均病変サイズを計算し、ドットプロットでデータを提示して、グループ内の個々の変動をさらに視覚化することができます(図4B)。

オイルレッドOは、中性脂質を染色する脂溶性の明るい赤色ジアゾ色素です。細胞膜の極性脂質は染色されません。オイルレッドO染色は、新鮮な、凍結、またはホルマリン固定サンプルでは行うことができますが、必要なデパラフィン化プロセスで脂質を除去するため、パラフィン埋め込みサンプルでは行われません。病変脂質蓄積の定量化は、全病変領域のオイルレッドO陽性領域を色閾値化することによって行うことができる(図4C)。ヘマトキシリンは、プラークの形態を視覚化するのに役立つ細胞核の青い染色を生成します。右および左冠動脈は、通常、大動脈27から約250μmの大動脈から発散し、これはしばしば最も顕著な病変サイズと一致する。この領域の断面は、多くの場合、代表的な結果として表示されます (図 4D)。

図4:大動脈根のアテローム硬化性病変。(A)28週齢の雄骨髄キメラを8週間食餌食にし、アテローム性動脈硬化症発症に対するSmad7-欠損T細胞の効果を決定するために評価した。 実験的なLdlr^-/-キメラはCd4-Cre⁺Smad7^fl/fl骨髄を受け取り、コントロールはCd4-Cre ⁺Smad7^fl/+骨髄を受け取った。グラフは、全血管表面の病変分分率として表示される大動脈部位からの8つの連続したセクションからのアテローム硬化性病変領域の定量を示しています(Cd4-Cre⁺Smad7^fl/+/Ldlr^-/- n=6, Cd4-Cre⁺Smad7^{fl/fl /Ldlr-/-} n = 9, ボンフェロニのポストテストで2ウェイANOVA, グラフは平均±SEMを示し、中括弧は歪み比較の有意水準を示します。(B) 組み合わせたドットプロットと棒グラフは、大動脈根切片からの平均アテローム硬化性病変領域を示しています (Cd4-Cre⁺Smad7^fl/+/Ldlr^-/- n=6, Cd4-Cre⁺Smad7^{fl/fl /}Ldlr^-/- n = 9, 学生のt-test) (C)病変中のオイルレッドO染色面積の割合 (Cd4-Cre⁺Smad7^fl/+/Ldlr^-/- = 4, Cd4-Cre⁺Smad7^fl/fl/Ldlr^-/- n = 6, 学生のt-test, ns=非有意) (B-C) ドットは個々のマウスを表し、バーは平均 ±SEM. (D) オイルレッド O 染色を示す代表的な顕微鏡写真 (赤色)大動脈内膜300μmの中性脂質の色(50倍倍)、スケールバー= 500 μm *p ≤ 0.05、 ***p ≤ 0.001。この図は、Gisterå et al.³¹から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

オイルレッドOは、エンフェイス調製大歯の染色に使用することができますが、このプロトコルは、スーダンIV、別の便利な脂肪溶解性ジアゾ色素を使用しています。スーダンIVは、脂質、トリグリセリド、リポタンパク質を染色することにより、オレンジ赤色のアテローム硬化性プラークを明確に可視化します。エンフェイス大動脈アーチの代表的な画像の暗い背景を削除すると、視覚的な表示を強化することができます(図5A)。通常、病変サイズは通常グループ内に分布し、グループ間で学生のt-testを用いて統計的テストを行うことができます。個々のマウスと平均の両方を示すドットプロットは、グループ間で比較され、結果を表示するための有益な方法です(図5B-C)。グループ内の変動は通常、血管の木の位置間で異なるので、通常は別々の電力計算が必要です。メソッドの熟練度とプロトコルの標準化によって、不必要な変動を回避できます。統計的に有意な結果を得ることは重要ですが、観察された差の生物学的関連性も常に考慮する必要があります。

図5:大動脈アーチおよび上皮動脈におけるアテローム硬化性病変。(A)代表的なエンは、20週齢のマウスが10週間西洋食を与え、一緒に可視化した20週齢のマウスからスーダンIV(オレンジ色)で染色された脂質を含むプラークを有する大動脈アーチの顕微鏡写真を用いた。スケールバー= 2 mm.ヒトAPOB100-トランスジェニックLdlr-/-(HuBL)マウスを対照として使用し、実験群はLDL反応性T細胞(BT1)を有するTCRトランスジェニックマウスから成り立った。 (B) 大動脈アーチのアテローム硬化性病変 (HuBL n = 10, BT1xHuBL n = 12;学生のt -テスト)。(C)ブラキオセファリック動脈におけるアテローム硬化性病変(HuBL n=8、BT1xHuBL n=9、学生のt-test)。 (B-C)ドットは個々のマウスを表し、バーは平均±SEM.*p ≤ 0.05を示す。この図は、Gisterå et al.³²から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図 1: 大動脈根のシリアルセクションのスライドの代替編成。大動脈根からのセクションのコレクションのための簡素化された体系的なスライド組織。このコレクションにより、脂質および免疫組織化学または免疫蛍光染色のためのオイルレッドO染色が可能になります。コラーゲンのピクロシリウス赤染色専用スライドは省略されています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

心血管疾患は、世界の主なキラーであり、新しい予防測定が必要です².疾患のマウスモデルは、病態生理学および実験的治療の研究のための包括的なプラットフォームを提供する^13.このアプローチには信頼性の高い病変サイズ定量が不可欠です。しかし、定量方法は実験室によって異なります。標準化と最適化は、1980年代の13、27、33、34以来、継続的なプロセスとなっています。大動脈根は、実験的アテローム性動脈硬化症を定量化する最も人気のあるサイトとして出現した。プラークの断面は、グループ間のプラーク体積の比較を可能にする。エンフェイス製剤は、大間のより大きなセグメントにおける病変定量のために好まれる。en face メソッドは、プラークの量を視覚化し、プラーク領域のカバレッジを定量できますが、プラークの厚さは考慮しません。観察された相違の生物学的関連性は、血管の木の異なる位置で一貫した結果によって実証される。異なる場所でアテローム性動脈硬化症の発症を評価することは、可能なサイト固有の効果に対処します。アテローム性動脈硬化症発症に対する移植血行細胞の効果は、高コレステロール血症Ldlr-/-キメラで評価することができる。しかし、全身照射は、部位特異的な効果を伴うアテローム性動脈硬化プロセスに影響を与える。より顕著なアテローム硬化性病変は大動脈根で発症し、一方、病変の減少は大動脈^アーチ35で観察される。

重要なことは、病変サイズだけでなく、実験的アテローム性動脈硬化症の研究で対処する必要があります。病変組成物も重要なパラメータです。いくつかのプラーク特徴は、^ヒト36における疾患の症状と関連している。大動脈根の連続断面は、プラーク組成物の慎重な分析のために利用可能ないくつかのセクションを残します。ヒトにおけるプラーク破裂は、少数の平滑筋細胞を有する薄い線維性キャップ、まばらなコラーゲン含有量および^{プラーク36}における炎症の徴候によって特徴付けられる。プラーク破裂はアテローム性動脈硬化症のマウスモデルではまれな事象であるが、プラーク安定性のマーカーは評価する有益である。翻訳アプローチは、マウスモデルから機械的所見を確認し、ヒト^疾患31の重要な特徴を明らかにすることができる。アテローム硬化性プラークの炎症状態は、VCAM-1、MHCクラスII、マクロファージ、およびリンパ^球30の免疫組織化学染色によって決定され得る。一部のプロトコルは、アテローム硬化性病変サイズおよび組成^物37を測定するために、大動脈アーチまたはブラキオ眼動脈の冠状平面における縦断を使用する。ただし、この代替方法では、分析するセクションが少ないため、アプリケーションが制限されます。

このプロトコルの最初の重要なステップは、大次を効率的に収穫する能力です。顕微鏡下での手と目のコーディネーションは練習を必要とし、微小解剖と大動脈アーチのその後の固定の両方にとって重要です。このプロトコルの次の重要なステップは、大動脈根からのシリアルセクションのコレクションです。マウスごとに 80 個の連続したセクションを収集する必要があり、フォーカスと忍耐の両方が必要です。方法論的な熟練度は、記述されたプロセスを大幅にスピードアップすることができます。それにもかかわらず、アテローム硬化性病変定量は依然として時間のかかる作業である。新しい技術、自動処理、および小動物イメージングは、将来的に実験的アテローム性動脈硬化症の定量化を容易にする可能性があります。アテローム性動脈硬化症の進行は遅く、マウスモデルのほとんどの実験プロトコル^は13を完了するのに4ヶ月以上かかります。したがって、大器はスタディエンドポイントで最適化された方法で収集する必要があります。このプロトコルは、効率的に大動脈を収穫するための包括的なガイドを提供し、提案された処理は、大動脈根、大動脈のアーチ、およびブラキオエファリック動脈の病変定量を含む多目的使用のための大動脈を準備する。うまくいけば、プロトコルは、実験の変動性を低減し、結果の信頼性を高め、アテローム性動脈硬化症に対する新しい治療法の道を開く発見につながることを可能にします。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	VWR Chemicals	20066.296	For fixation of sections for immunohistochemistry.
Black electrical insulation tape (50 mm wide)	Any specialized retailer	-	To create pinning beds for aortic arches.
Centrifuge	Eppendorf	5417C	Benchtop microcentrifuge.
Cork board	Any specialized retailer	-	For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Cryostat	Thermo Scientific	Microm HM 560	For serial cryosectioning of aortic roots.
Deionized water	-	-	For rinsing and preparation of solutions.
Digital camera	Leica Microsystems	DC480	5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections.
Dissecting scissors (10 cm, straight)	World Precision Instruments	14393	For general dissection of organs.
Dumont forceps #5 (11 cm, straight)	World Precision Instruments	500341	For microdissection of aorta.
Ethanol 70% (v/v)	VWR Chemicals	83801.290	Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Ethanol absolute ≥99.8%	VWR Chemicals	20821.310	Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0)	VWR Chemicals	9713.1000	Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
ImageJ	NIH	-	Image analysis software.
Iris forceps (10 cm, curved, serrated)	World Precision Instruments	15915-G	Used as anatomical forceps.
Isopropanol	Merck	1096341011	Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness.
Kaiser's glycerol gelatine	Merck	1092420100	Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects.
Light microscope	Leica Microsystems	DM LB2	For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs.
Mayer's hematoxylin	Histolab	1820	Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation.
Mayo scissors (17 cm, straight)	World Precision Instruments	501751-G	For general dissection.
Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight)	World Precision Instruments	503376	For pinning of aortic arches.
Microcentrifuge tubes	Corning	MCT-175-C	Polypropylene microtubes with snaplock cap.
Microlance 3 needles, 23 gauge	BD	300800	For blood collection.
Microlance 3 needles, 27 gauge	BD	302200	For perfusion of mice.
Microvette 500 µL, K3 EDTA	Sarstedt	20.1341.100	For blood collection.
Microvette 500 µL, Lithium Heparin	Sarstedt	20.1345.100	For blood collection.
Minutien insect pins, 0.10 mm	Fine Science Tools	26002-10	For pinning of aortic arches.
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625	Not classified as a hazardous substance or mixture.
Optimum cutting temperature (OCT) cryomount	Histolab	45830	For embedding tissue.
Parafilm M	Bemis	PM992	Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches.
Petri dishes (100 mm x 20 mm)	Any cell culture supplier	-	Proposed as a storage container for pinned aortas.
Phosphate buffered saline (PBS)	-	-	Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice.
Qualitative filter paper (grade 1001)	Munktell	120006	For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm).
RNAlater RNA stabilization reagent	Qiagen	76106	For stabilization of RNA in tissue samples
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Invitrogen	AM9780	A surface decontamination solution that destroys RNases on contact.
Scalpel handle #3 (13 cm)	World Precision Instruments	500236	For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Standard scalpel blade #10	World Precision Instruments	500239	For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Stereomicroscope	Leica Microsystems	MZ6	For dissection and en face documentation
Sudan IV	Sigma-Aldrich	S4261	Not classified as a hazardous substance or mixture.
Superfrost Plus microscope slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ	To collect aortic root sections.
Tissue forceps (15 cm)	World Precision Instruments	501741-G	For general dissection.
Tissue-Tek cryomolds (10 mm x 10 mm x 5 mm)	Sakura	4565	For embedding aortic roots in OCT.
Vannas scissors (8 cm, straight)	World Precision Instruments	503378	For microdissection of aorta.