周波数領域ベースのカメラシステムを用いたO2の発光寿命イメージング

要約

2D_O2分布を光学センサ箔でマッピングするための新規な周波数領域発光寿命カメラの使用について説明します。カメラシステムと画像解析手順は、水生植物の根圏における_O2微小環境を可視化するためのセンサ箔の調製、キャリブレーション、および適用と共に説明されています。

要約

高空間(<50~100μm)および時間(<10s)分解能で2Dで溶存酸素_(O2)を画像化する方法について説明します。この方法は、周波数領域の発光寿命をイメージングするための特殊なカメラシステムと組み合わせて_O2感受性発光センサ箔(平面オプトード)を採用しています。平面オプトードは_、O2感受性指標色素をポリマーに溶解し、ナイフコーティングを介して定義された厚さで固体支持体上に混合物を広げることによって調製される。溶媒の蒸発後、平面光体は、目的の試料と密接に接触して配置される- ここでは、水生植物リトレラウニフローラの根で実証した。平面光十動内の指標色素の発光寿命における_O2濃度依存性変化は、特殊カメラを用いて透明キャリア箔と水族館壁の裏側を介して画像化される。このカメラは、変調励起信号と発光信号の間の位相角のシフトを介して発光寿命(μs)を測定します。この方法は、信号が励起源の色素濃度または強度に依存せず、本質的に参照されるパラメータである発光減衰時間にのみ依存するので、発光強度イメージング方法よりも優れています。したがって、追加の参照染料やその他の参照手段は必要ありません。植物根圏のマクロ的_O2イメージングにシステムを使用する方法を実証していますが、カメラシステムを顕微鏡に簡単に結合することもできます。

概要

堆積物や土壌中の溶存ガスとイオンの分布とダイナミクスは、微生物呼吸^1、2、または植物根^3、4、5からの放射状酸素損失、および微生物の化学微小環境^{6、7、植物}根圏^5、8、9および動物の巣^{10などの生物地球化学的プロセスに関する重要な情報を提供する。11、12}.このような拡散制限された環境における生物学的および化学的活性は、化学基質または生物地球化学的プロセスの産物の急勾配を作成することができる。特に_、O2の利用可能性は、生物地球化学的プロセスに大きな影響を及ぼし、したがって、システム¹³の生物学および生態学である。したがって、高い空間分解能と時間分解能で_O2濃度を解析することは、水生科学と陸上科学において最も重要である。まず、この重要な検光子を測定するために電気化学および光学マイクロセンサ^14、15を開発した。その後、平面検体を用いた_O2の2次元(2D)撮像を^{導入し、12、16、17、18、19、}土壌及び堆積物中の異種_O2分布の可視化及び定量を可能にした。

平面_O2光体は、適切なポリマー²¹に溶解される_O2感受性指標色素²⁰からなる。インジケータ染料は、特定の光波長で励起され、発光の形で緩和時に赤色シフト光を放出します。O2の存在下では、励起された指標色素は、衝突時に_O2分子にそのエネルギーを伝達することができ、衝突ベースの発光消光²²と呼ばれる。従って、発光強度ならびに発光寿命は_、O2濃度²³の増加に伴って減少する。理想的な場合には、強度と寿命の変化は、所定の濃度で_O2の発光強度または寿命(I_0;ƒ0)または存在(I,ƒ)のいずれかを使用して、スターン・ヴォルマー方程式(方程式1)に従います。シュテルン・ヴォルマー定数(K_sv)は_、O2に対する光大脱の感度の尺度である。K_SVは温度や圧力などの環境変数に依存します。

(1)

このような発光の変化をカメラシステムで平面センサ箔上に記録することで_、O2分布の対応する変化を可視化することができます。当初、単純発光強度ベースの_O2イメージングが¹⁸を用いた。しかし、このような方法論は外部干渉に非常に敏感であり、異種照明、励起源またはカメラの変動、ならびに平面オプトデ内の指標色素の不均一な分布による結果の信頼性を損なう。

これらの制限の一部は、比率イメージング^17、24に平面光剤を用いることによって緩和することができ、O2-sensitive指標色素は_、O2−指標とは異なるスペクトル範囲で放出される無感受性基準色素を有する平面光化のポリマー層に共固定される。2つのスペクトルウィンドウで取得した発光画像に基づいて_、O2感受性発光信号を基準信号で分割し、上記の干渉^5、17に当てにされにくい比率画像を生成する。この方法では、理想的には同じ励起源によって励起できるが、カメラの別のスペクトルウィンドウ(例えば、RGBカメラの別のカラーチャンネル)で異なる波長(有意なスペクトルの重なりなし)で放出される2番目の色素を使用する必要があります。

あるいは_、O2イメージングは、指標濃度²⁵における不均一な照明または不均一性の影響を受けない指標色素の発光寿命における_O2−依存性変化を定量することに基づいていてもよい。第1の発光寿命ベースの_O2イメージングシステムは、ゲート可能な帯電結合デバイス(CCD)カメラシステム²⁶を用いた時間領域測定に基づいており、パルス励起源が使用され、発光画像が指標^8、23、27の励起または発光内で定義された時間間隔にわたって撮影される。このような画像から、発光寿命を決定し、キャリブレーションにおける対応する_O2濃度に相関させることができる。続いて、平面光十目的に押し付けられた所定のサンプルの発光寿命画像を_、O2濃度の対応する2D分布の画像に変換することができる。このシステムは実験室およびsitu^16、28の両方の多くの適用で使用されてきたが、本質的なゲート可能なCCDカメラはもはや市販されなくなった。

最近、周波数領域⁸で画像を取得する別の発光寿命カメラシステムがリリースされました。システムは励起のための連続的に変調された光源に依存する。これは、パルス励起の代わりに正弦波または方形波のいずれかであり、これは時間領域での画像集録に使用される。この変調は、角度によって位相シフトされる_O2指標色素の変調発光をもたらし、定価色素の発光寿命に依存するφ(式2参照)。

(2)

励起と発光振幅の変化(すなわち、いわゆる変調指数または深さ(一定の発光部分で割った振幅))も発光寿命に依存する。そこで、カメラ内の特殊なCMOSイメージセンサを既知の変調周波数に設定することにより^、NSからμs範囲の発光寿命を測定^{することができる。}操作原理に関する一般的なガイドは、次のリンクhttps://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8を使用して見つけることができます。.

以下のプロトコルでは、2D9、31における水生淡水植物リトレラユニフローラの根の周りに_O2濃度の分布を画像化するための新規カメラシステムの使用を実証^する。私たちは、この方法は決してこのアプリケーションに限定されるものではないことを強調したいと思います。酸素感受性オプトードまたはセンサ粒子²⁷は、種々の画像化方法と組み合わせて、医学研究^32、バイオプリンティング^33、感圧塗料^34、35、または光合成システム^2、36、37を研究するために、単にいくつかの他の応用分野を挙げるために使用されている。

プロトコル

1. 平面O₂光大脱の製造

1. 発光_O2指標染料白金(II)-5,10,15,20-テトラキス-(2,3,4,5,6-ペンタフルオルフェニル)-ポルフィリン(PtTFPP)と100mgのポリスチレン(PS)をクロロホルム1gに溶解し、いわゆる「カクテルセンサー」を得る。
   注:カクテルは、さらに使用するまで冷蔵庫と暗闇の中で数時間、閉じたガスタイトなガラスバイアルに保管することができます。
2. 水またはエタノールの助けを借りて、洗浄されたガラス板に清潔でほこりのないポリエチレンテレフタレート(PET)箔(用途に依存するサイズ)を固定します(70%)フィルム (図 1A)
3. 洗浄されたナイフコーティング装置(120μm)をホイルの上に置き、ガラスピペットを使用してデバイスの前面にセンサーカクテルのラインを適用します(図1B)。次に、ナイフコーティング装置をゆっくりと均一にPET箔の上にドラッグし、カクテルを均等に広げます。
   メモ:すべての材料とツールを徹底的に洗浄する必要があり、製造は、ヒュームフード、フローベンチ、またはポイント吸引装置の下など、ほこりのない環境で行う必要があります。最終的なセンサー箔の不均一性を避けるために、クロロホルムが速く蒸発するので、箔へのセンサーカクテルの適用に続くステップは迅速に行われるべきです。
4. 完成した平面_O2感受性光大灯を周囲の空気に1時間乾燥させ、その後50〜60°Cの加熱キャビネットで夜間に乾燥させ、溶媒蒸発後の最終層厚さ~12μmの結果、生成したオプトードを暗闇(例えば紙封筒)に入れて、さらに使用するまで乾燥させる(図1C)。
   注:平面O₂オプトードは、使用前に数ヶ月から数年の間、乾燥した暗闇の中で保存することができます。1-20 μmの範囲の最終的な層の厚さは十分な発光信号および十分な応答時間と良好な結果を提供することが証明された。

2. ライゾサンドイッチチャンバー

1. 2枚のガラス板(24.5 x 14 cm^2、厚さ:4mm)を96%エタノールで清掃します。
2. 1 つの長いエッジを開いたまま、最初のガラス板のエッジ (76 x 26 mm²、厚さ: 1 mm) に沿って顕微鏡スライド (76 x 26 mm 2 、 厚さ : 1 mm) を接着するには、光硬化性のアクリルベースのインスタント接着剤 (材料表を参照) を使用します。必要に応じて、ガラスカッターを使用して顕微鏡スライドを短くします。
   注意:ガラスを切断すると、鋭いエッジを引き起こす可能性があり、注意して取り扱う必要があります。
   注:顕微鏡スライドは、前面と背面の間のスペーサーとして機能し、根の厚さと植物の大きさに応じて、顕微鏡スライドの複数の層を互いに接着することができます。
3. 接着された顕微鏡スライドの間のスペースに収まるように、平面のオプトードを必要な形状とサイズにカットします。コーティングされた側面を上向きに前面ガラス板の内側に置き、押し付けたときに目的のサンプルと接触できるようにします。
4. 光箔の片端をガラス板にテープで貼り付け、ガラス板と光大管の間に数滴の水道水を加えます(図2A)。これらの水滴のホイルをゆっくりと下げて、ガラス表面にそれをまっすぐにします。
5. センサーコーティングの傷を避けながら、柔らかいティッシュを使用して平面のオプトードとガラス板の間に閉じ込められた気泡を慎重に取り除きます。ガラス板を乾かし、光箔の残りの端をガラス板にテープで留めます(図2B)。
   注:水中で適切な接着性を持つテープを選択する必要があります。
6. メッシュサイズ0.5mmを使用して堆積物をふるいにかけます。最初のガラス板に湿った堆積物のスプーンを置きます(図2C)。
   注: メッシュ サイズは、スペーサーの厚さの半分より大きくしないでください。
7. 堆積物を均等に分配し、平らなガラス板を使用して顕微鏡スライドスペーサーと同じ厚さに調整します。顕微鏡スライドの上面を慎重に清掃し、2番目のガラス板がチャンバーを正しくシールするようにします。
8. 顕微鏡スライド表面にシリコングリースを塗布します。気泡の形成を慎重に避けながら、薄い水膜で堆積物をカバーします。
9. リトレラ・ウニフローラの1回の撮影を慎重に洗浄し、上側の開いた側から植物の葉を突き出して、堆積物の上に置きます(図2D)。
10. 2つ目のガラス板を、オプトードを付けた場所に置き、堆積物の上に穏やかな圧力をかけて、植物の根や周囲の堆積物に密着して光を持たせます。
    注:堆積物に閉じ込められた気泡は、ガラス板を傾けながら一緒に取り除くことができます。
11. クランプを使用してガラスプレートを一緒に固定します(図2E)。外側の端をティッシュペーパーで乾かします。根茎サンドイッチの組み立て全体を通して葉を保湿してください(例えば、数滴の水を頻繁に添加することによって)。
12. ビニール電気テープを使用して根茎サンドイッチチャンバーを締めます。モデリング粘土でエッジを密封し、さらにビニール電気テープでテープを貼ります(図2F)。
    注:堆積物に多くの気泡がある場合、またはスペーサー顕微鏡スライドと第2ガラス板の間に堆積物の粒がある場合は、細孔水が漏れる可能性があるのでチャンバーを再構成する必要があります(手順2.4~2.8を繰り返します)。
13. 根茎サンドイッチをカバーするために不透明なプラスチックを使用しますが、植物の葉が突き出るためにホイルにスリットを残します。プラスチック箔で窓を切り、展開することで実験用に開きます。ゴムバンド(図2G)を使用して順応時にウィンドウを閉じ、植物がインキュベートされている間に光の漂白から光を保護します。
    注:藻類の成長は、測定された_O2濃度を妨げる可能性がありますので、濾過水、事前に洗浄された実験装置を使用し、形成時に藻類を除去することによって、それを最小限に抑えることをお勧めします。

3. ライゾサンドイッチチャンバーインキュベーション

1. 水槽(32 x 7 x 28 cm³⁾に根茎サンドイッチチャンバーをわずかに傾けた位置に置き、平面のオプトデに対する根の成長を促します。
2. 植物の葉を完全に水没させるのに十分な水で水タンクを満たします。
3. 時間制御ランプを使用して植物の順応のための14時間の光、10時間の暗いサイクルを確立する。空気石または水ポンプをタンクに入れ、水の通気と混合を確実にします(図2H)。

4. イメージング

1. イメージングの設定
   1. 根茎サンドイッチ室の平面光を覆うプラスチック箔を取り外します。水族館の壁に直立した光を持つガラスの壁でチャンバーを配置します。スペーサーを使用して、水族館の壁に根茎サンドイッチ室を押します。
      注:水族館の壁の全体的な厚さと根茎サンドイッチ室の壁はあまり厚くなりませんが、散乱光の減衰を増加させることによって空間的なクロストークを減らすために、発光イメージングのための水族館の壁のためのガラスの厚さは>1 cmで推奨されます。材料界面での光散乱を最小限に抑えるためには、両方のガラス壁に同じ材料(同じ耐火性インデックス)を使用することが重要です。これは同様にぼやけた画像につながるように^12.
   2. 水族館の前に目的を搭載した周波数領域ベースの発光寿命カメラを配置し(材料表を参照)、目的の領域(平面光葉と直接接触する水生植物リトレラユニフローラの根)を配置します(図3)。
      メモ:カメラの高さを簡単に調整できるように、カメラをラボスタンドに置く場合があります。ラボスタンドの位置をマークし、固定しておく必要があります。さらに、実験中にカメラが誤って動かないように、カメラをラボスタンドにテーピングできます。
   3. カメラの目的でPtTFPPを指標染料としてイメージングするための適切な発光フィルタをねじ込み(材料表を参照)、励起源から推論を除去します。
      メモ:スクリューオンフィルタは理想的ですが、正方形フィルタは適切なアダプタで使用することも、目的に合わせて慎重にテーピングして使用することもできます。
   4. LED 励起ソース(マテリアルの表を参照)をカメラの変調および暗いゲート出力に接続します。
      メモ:前者は光源の変調信号を提供し、後者はイメージセンサの画像読み出し中にライトをオフに切り替えます。LED励起ソースとカメラをコンピュータに接続します。背景ライトは、部屋全体を暗くするか、設定全体の上に密な黒い布を置くことによって、画像の読み出し中に最小化する必要があります。後者の場合、カメラの加熱を避けるために十分な換気を確保することが重要です。
   5. LED励起源のライトガイドを固定し、対象領域をカバーする平面光箔を均等に照らすために配置します。
      注:使用されるLED励起源では、3つの異なるLED(460 nm、528 nm、625 nm)を切り替えることができますが、その強度は制御ソフトウェアを介して調整することができます。
2. 設定とカメラ操作
   注: 前述の実験では、市販のソフトウェア パッケージで生涯イメージング用の専用モジュールと組み合わせて周波数ドメイン ベースの有効期間カメラを使用しました (材料表を参照)。
   1. 使用する前に、選択したソフトウェアでカメラを選択します。
      メモ:ソフトウェアとカメラのドライバは、製造元のガイドラインに従ってイメージングする前にインストールする必要があります。
   2. LED制御ソフトウェア(実験開始前に再びインストール)を開き、スタンバイをオフにして適切なLED(ここでは528 nm)を選択します。必要に応じて LED 強度を設定します(ここでは 30%)。LED が外部 TTL によってトリガーされていることを確認します。これは、LEDのアナログと同期をチェックすることによって行われます。
      注:レーザーパワーが高すぎると、インジケーターまたは基準染料の光白化が加速される可能性があるため、LED強度を個別に調整する必要があります。
   3. カメラに焦点を合わせ、目的の絞りを手動で調整します(本研究ではf = 2.8を使用)。
      注:水族館のガラスではなく、平面のオプトードにカメラを焦点を当てることが重要です。これは、スケールの定規で画像を撮影し、実際のルーラーではなく、オプトード上の定規の影に焦点を当てることによって保証することができます。
   4. ソフトウェアのカメラコントロールパネル内で次のパラメータを設定します: 内部変調ソース。出力波形の正分波;追加の位相サンプリング(はい)。8相サンプル、位相順序反対、タップA + B読み出し。5 kHzの変調周波数。
      注: これらのパラメータは画質に影響し、必要に応じて変更できます。カメラの製造元は、個々のパラメータに関するガイドラインを提供します (カメラの製造元は、ソフトウェアが更新されるたびにガイドラインと更新プログラムをリリースしています)。
   5. 実験の前に参照画像を撮ります。
      注:これは、キャリブレーション標準(既知の寿命(nsまたはμs)を持つ発光色素)をイメージングするか、LEDの反射光を使用して行うことができます。後者の場合、放出ロングパスフィルタを目的から削除する必要があり、既知の有効期間を1nsに設定できます。
   6. 正規化された発光強度イメージのROI統計読み出し(このパネルの下部)が0.68~0.72の範囲になるまで、専用イメージングソフトウェアのキャリブレーションセクションの露光時間を調整します。
      メモ:参照の有効期間(例えば、1 ns)がソフトウェアへの入力として与えられます。
   7. [キャプチャ参照]を押して、基準測定シリーズの取得を開始します。
      注:完了すると、参照データが保存され、サンプルに対して単一または時間経過の測定を行うことができます。
3. O₂光大解のキャリブレーション
   1. (小さな)ガラスの水族館に平らなO₂感受性の光大脱片の部分を置きます。前に説明したように、キャリブレーションチャンバーのガラス壁に平面光を固定します(セクション2.3を参照)。キャリブレーション水族館をカメラの前に置きます。LEDによる照明と、光大管の視野全体を塗りつぶすようにします。
      注:平面のオプトデは、同じ箔から、または実際の実験で使用される箔と同じセンサーカクテルから作られるべきです。
   2. 実験で使用したのと同じ液体媒体で水族館を埋めます。
      メモ:キャリブレーションや実験に異なるメディアを使用すると、測定に影響を与える可能性があります(例えば、センサ応答および/または_O2溶解度を変更することによって)。したがって、キャリブレーションは、実際の実験と同じ媒体と同じ温度で行う必要があります。温度の変動は発光信号に影響を与え、避けるべきです。ただし、温度を安定させることができない場合は、O₂-sensitive オプトード(複数点)を異なる(関連する)温度でキャリブレーションし、その後の値の再計算を行うことで、温度補償を行う必要があります。
   3. ガス混合装置を使用して、既知の_O2濃度の空気_/N2ガス混合物で水を洗い流すことによって、キャリブレーション水族館内の_O2濃度を調整します。十分な時間をエー調することによって、水が使用されるガス混合物と十分に平衡化されていることを確認します(水族館の流量と大きさによって異なります)。
      注:キャリブレーション水族館の_O2レベルを温度補償(光ファイバまたは電気化学_O2センサを使用)で監視することをお勧めします。
   4. キャリブレーション室内の異なる_O2濃度で一連の画像を撮ります。
      注:取得したキャリブレーションデータに適切なカーブフィットを可能にするには、少なくとも5つの異なる_O2濃度を測定する必要があります。0 hPa (アノキシック条件) で測定し、その他の値を特定の指標色素のダイナミックレンジに分散することが重要です。ここでは、ポリスチレンマトリックスに固定化された_O2感受性指標色素としてPtTFPPを用いた。画像は 0、48、102、156、および 207 hPa で撮影されました。207 hPaは、与えられた白色度および圧力で100%空気飽和に対応する。
4. サンプルのイメージング
   1. カメラの前面にサンプルを置き、照明も確認します。
   2. プラントの発光寿命画像を取得する直前に、プラント(および他のすべての光源)への光供給照射をオフにします。強度画像に基づいて集録時間を調整し、信号が過飽和でも弱くもなく、寿命決定においてノイズ(S/N)比に対して良好な信号を得られるようにします。
   3. 様々な光条件(例えば、明るい/暗い)に植物を露出させ、画像のセットを取得します。
   4. 部屋のライトをオンにして構造画像を取得します。
      注:背景ライトをオンにすると、カメラは現実的な寿命画像を測定しません。ただし、強度イメージは、半透明のオプトデを通して見た視野全体を示すようになりました。
   5. 取得した画像の後のスケーリングを可能にするために、視野内の定規などで画像を撮ります。

5. データ分析

1. カメラの製造元が提供するマクロを使用して、専用のイメージング ソフトウェアからフェーズの有効期間と強度のイメージを直接エクスポートします。
2. 自由に利用できる画像解析ソフトウェアを使用して、さらに画像解析を実行します(材料表を参照)。
3. 画像解析ソフトウェアでキャリブレーションの位相寿命画像を開き、計測機能を使用して画像全体の平均を決定します。測定された寿命を既知の_O2濃度に対してプロットし、キャリブレーション機能を決定します(図4A)。
4. すべてのデータからƒ₀/ƒを計算します(ƒ₀は O₂がない場合の測定された位相の有効期間です)。これらの値と既知の_O2濃度をプロットする(図4B)。
5. 動的衝突焼入れ用の簡略化された2部位モデル(式3)38、39(Q]が_O2濃度)を用いて、キャリブレーションプロットからパラメータ_Ksvとfを求める。データ解析ソフトウェアで適合関数を定義し、K_svと f を決定します。

(3)

6. 画像解析ソフトウェアで取得したサンプル画像を開き、決定されたパラメータ_Ksv、fおよび_ε0を使用して、画像化された寿命を_O2濃度に変換する。
   メモ:代替アプローチとして、取得したキャリブレーション位相寿命値(図4A)も直接使用できます。この場合、カーブフィット関数を使用した指数適合がキャリブレーションに使用されます。
7. 画像解析ソフトウェアで次の定規で画像を開き、測定ツールを使用して既知の距離を測定します。[スケールの設定] の下に、この測定値をグローバル スケールとして設定します。

結果

新しいイメージングシステムの応用例として、複雑な生体試料(すなわち、水生植物リトレラユニフローラの根圏)の2DO2イメージングを示す。

まず、平面センサフィルム、いわゆる平面検眼体の製造方法を記載する。図1に見られるように、このような光体は、透明な支持体に広がるポリマーマトリックス中の光学指標の薄層からなる。記載されたプロトコルに従うことによって、均一な厚さの均質なセンサフィルムが、ナイフコーティング装置の隙間によって定義される、得られる。生成されたオプトードにパッチ状のセンサー材料分布(例えば、コーティングの穴、ストライプ、または色素凝集体を示す)がある場合は、プロトコルを繰り返し、すべての材料をアセトンを使用して完全に洗浄する必要があります。

平面オプトードが調製されると、サンプルは平面オプトデの感知層と密接に接触し、ここに示すように、根茎サンドイッチチャンバーに統合された平面オプトデと、周囲の堆積物マトリックス内の植物の根を平面オプトデに密接して配置することができる(図2)。正しく準備された場合、根茎サンドイッチチャンバーは、1つの水族館(インキュベーション)から他の水族館(測定)に容易に移動可能でなければなりません。正しく構築されていない場合、根茎サンドイッチチャンバーは不安定である、堆積物を失うか、気泡を含む可能性があります。このように組み立て直後の根茎サンドイッチチャンバーの目視検査をお勧めします。

与えられたプロトコルは、周波数ドメインベースの発光寿命カメラを使用して、平面光十種と接触するサンプルの周波数ドメインベースの発光寿命イメージングを可能にします。画像取得のモードや科学的相補型金属酸化物半導体(SCMOS)カメラ特性などのこのカメラシステムの詳細は、最近の出版物^8、29に記載されている。

セットアップ自体はかなり単純で、光源(この場合は LED 励起ソース)を制御するカメラと、オプトデを持つサンプル(図3)のみが含まれます。すべての部品が正しく接続されていること、およびサンプルが均一に照らされていることを確認します。測定を事前に形成する間、背景光は避ける必要があります。

サンプルをイメージングする前に、オプトードを校正する必要があります。図4Aに見られるように、測定された発光寿命は、準指数減衰後の_O2濃度の増加に伴って減少する。この関係は、簡略化された2サイトモデル(図4Bおよび方程式3)を用いて記述することもできる。所定の例では_、O2濃度を計算するために必要なパラメータは以下の手順に従いました。ƒ₀ = 56.26 μs、K_sv = 0.032 hPa^-1および f = 0.86。

キャリブレーションを実行することは、システムが正常に動作していることをテストする理想的な方法でもあります。ここで説明したように (または製造元のガイドライン内で) すべてのコンポーネントがインストールされている場合、測定された有効期間は図 4に示すように同じ O₂依存性を示す必要があります。さらに_、O2センシング材料(ポリマーと染料)の同じ組み合わせの場合、測定されたƒ₀はここで測定したのと同じ範囲(±数μs)でなければなりません(主に実験温度の影響を受ける)。同様のキャリブレーション曲線を取得できない場合は、すべてのステップが正しく実行されていることを確認します。オプトードが誤ってサンプルではなくガラス壁に面した敏感な側面で固定されたり、取得した画像が露出過多または露出不足になることがあります。

キャリブレーションパラメータを用いることで、発光寿命(ƒ)を撮像することにより_O2濃度を決定することができる。これは図5A,Bで示され、リトレーラ・ウニフローラの根圏における_O2濃度の分布を暗闇の中で画像化し、12時間500μmol光子^{m-2 s-1}に光を浴びてから撮影した。植物の光合成活性のために、リゾスフィア中の_O2濃度は光暴露後に増加した。生涯画像に加えて、画像ジオメトリを固定したまま、外部照明下で「構造」画像を取得することもできます。このようにして_、O2画像は、構造画像(図5C)、断面または目的の領域と正確に相関させることができる。一例として、単一の根を横切る_O2濃度プロファイルを、それぞれ暗闇と光で取得した画像から抽出した(図5D)。

図1:平面_O2光大脱の製造(A) PET箔をガラス板に固定し、ナイフコーティング装置をホイル上に置く。(B)調製したセンサーカクテルは、ナイフコーティング装置の前の細い線としてPET箔に広がる。(C)ナイフコーティング装置は、センサーカクテルをPET箔上の薄膜として広げるために下方に移動し、溶媒蒸発後に平面光を使用する準備が整いました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:平面_O2検眼の統合を有する根蔵サンドイッチチャンバーアセンブリ。(A) 光大脱は、水膜を用いてガラス板の1つに固定される。(B) 光大脱を電気テープでプレートに接着する。(C)堆積物は、付属のスペーサー(すなわち、顕微鏡スライド)で反対側のプレートに充填される。(D) 植物の根は均等に広がった堆積物の上に置かれる。(E) 根茎サンドイッチ室は閉じられ、クランプで一時的に固定されています。(F)完全に閉じ、組み立てられた根茎サンドイッチ室。(G)インキュベーションランプによる光暴露から光を保護し、藻類の成長を避けるために、組み立てられた根茎サンドイッチ室の上にプラスチックカバーが置かれる。(H) ライゾサンドイッチ室を水族館でインキュベートした。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:透明な水族館と根茎サンドイッチ室壁を介して後ろからオプトードを持つサンプルに焦点を当てた目的で、周波数ドメインベースの発光寿命カメラを含むイメージングセットアップ。LED励起源の導光ガイドは、サンプルを均等に照らすために配置されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:平面_O2光大解のキャリブレーション曲線(A)水で満たされたキャリブレーション室内のそれぞれの_O2濃度で測定された異なるリン光寿命。(B)動的衝突焼入れ用の簡略化された2サイトモデルを用いて適合した較正データのスターン・ヴォルマープロット(式3)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:水生植物リトレラユニフローラの根圏における_O2分布の生涯イメージング(A)O2は、約500μmol光子^{m-2 s-1}で植物を12時間光の下に保った後の分布である。(B)O2は、平面検眼を通して見た植物根の構造像を1時間(C)暗闇の中に保った後の分布である。(D)断面_O2濃度プロファイル(位置は、光(赤)で12時間後、暗闇(黒)で1時間後にパネルAとBの黄色い線で示されます。(コレン、K.、モスハンマー、M.、ショルツ、V.V.、ボリソフ、S.M.、ホルスト、G.、キュール、M.ルミネッセンス化学センサーの生涯イメージング - 時間領域と周波数領域ベースのカメラシステムの比較から適応。分析化学.91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)。著作権 (2019) アメリカ化学会.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルでは、オプトード調製から_O2画像解析までのワークフロー全体がカバーされます。このプロトコルに従うことで、新規な周波数ドメインベースの発光寿命カメラを用いて化学画像を得ることができる。用途に応じて、平面オプトードは、<1μm厚いセンサ層^6、40の顕微鏡カバースリップに至るまで、堅牢な50〜100μmの厚い平面オプトードから顕微鏡カバースリップまで、センサ層の様々なサイズと層厚さで製造することができます。この方法の可能性は、特定の用途で実証されたが、植物根圏^12、28における_O2イメージングに限定されるものではない。

この方法は、純粋な発光強度ベースの化学イメージング方法と比較した場合、いくつかの利点があります。発光寿命イメージングは、不均一な照明、不均一な光線の厚さ、および写真漂白²⁵の影響を受けないか、または少なくとも少ない。また、この方法は、レシオメトリックイメージング^17、37で共通の追加の基準色素の使用を回避する。一般的に使用されるゲートタイムドメインカメラ^8、26などの他の生涯ベースのカメラシステムと比較して、ここで提示される新しいカメラシステムおよびプロトコルは、同等の結果を提供することができる。最近の出版物では、これら2つのシステムの分析特性を比較し、周波数ドメインベースの発光寿命カメラシステムが少なくとも廃止された時間領域ベースの前身⁸に匹敵することがわかった。

ポリマーマトリックス中の指標のみで構成される最も単純な_O2オプトデを提示した。添加剤を使用し得る可能性のある複数の_O2指標²⁰に加えて、すなわち、TiO2またはダイヤモンド粉末²などの散乱剤を含め、光大脱体の透明性を低下させながらセンサ信号を増加させる。また、追加の染料は、エネルギー移動⁴¹を介して信号強度を増強するために使用され得る。

平面オプトデ製造の場合、記載のセンサカクテル組成物を使用する場合は、75~120μmのナイフコーティング装置の隙間を使用して、溶媒蒸発後の最終センサ層厚さ約7.5~12μm(使用ギャップの約10%)を得ることをお勧めします。これは、信号強度の間の良好な妥協点であり、より高い色素の負荷によって、またはより高い輝度の指標と基準染料を選択することによって、および応答時間。層厚の増加は、周囲の媒体を有する感知層の熱力学平衡に達するために必要な期間が¹²増加するにつれて、応答時間の増加をもたらす。

オプトードは、ここで説明するように、十分に強い発光信号を有しつつ、数秒¹⁷秒以内に_O2濃度の変化に反応する。サブ秒応答時間を持つ超薄型センサコーティングは、スピンコーティング⁶で実現できます。サポートまたはナイフコーティング装置が十分に洗浄されていない場合、不均一なセンサー層が生じる可能性があります。また、カクテルが完全に均質でない場合や、塗布装置の前に広がった後にあまりにも速く塗布すると、このような望ましくない結果が観察され得る。したがって、最適なオプトードを準備するためにいくつかの練習が必要な場合があります。

この方法は、特定の海洋動物^42、バイオフィルム⁶および土壌³¹のような検眼に密着して置くことができるサンプルを画像化するために使用することができる。我々は、目的を使用してスタンドアロンのセットアップを提示するが、カメラは容易に高解像度の化学イメージング⁴³のための顕微鏡に結合することができる。

時間領域ベースの発光寿命イメージングはバックグラウンド蛍光²⁶の抑制を可能にしたが、これは新しい周波数領域ベースのカメラシステム⁸を用いた場合の問題である。連続的な画像集録のために、このカメラは選択されたLEDによって励起することができるサンプルの背景蛍光を記録し、カメラの目的の発光フィルターによって定義されるように選択されたスペクトルウィンドウで放出する。これは明らかに寿命が低く、結果的に誤った読み取りになります。O2センサ励起および発光と重なり合う重要な固有蛍光を有するサンプルを扱う場合、カーボンブラック^2、17を含む追加の層をコーティングすることにより、光体の上に余分な光学的分離を適用することが不可欠である。したがって、平面オプトードから放出される発光のみがカメラに到達します。背景発光をチェックするために、光大脱のない画像を撮影することができ、サンプルの固有の発光を排他的に示します。また、TiO2やダイヤモンド粉末^2、44などの散乱剤をセンサカクテルに添加して、指標色素の発光強度を高めることもできる。しかし、これはまた、より速い写真漂白につながる可能性があり、TiO2は、染料⁴¹の光安定性を損なう可能性のある既知の光触媒である。考慮すべきさらなる側面は、背景光です。発光寿命をイメージングする場合、背景光はできるだけ効率的に避ける必要があります。したがって、このイメージング方法では、暗い環境に配置するセットアップが必要であり、画像の取得中に外部光源を一時的にオフにする必要があります。

要約すると、発光寿命イメージングは、多くの異なる用途に適応することができる堅牢な化学イメージング法です。このプロトコル(セクション1-5を参照)は_、O2画像を生成するためのすべての重要なステップをカバーし、現在最も柔軟な周波数領域発光寿命イメージングシステムを使用し、2D O₂イメージング用の廃止されたゲート時間領域カメラを平面オプトードに置き換えることができます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air pump with air stone and water pump	Local aquarium store
Chloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
DC4 silicone compound	Dow Corning GmbH	2793695
Gas mixer	Vögtlin Instruments GmbH	red-y compact meter GCM	This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices
Glass plates and aquaria	Local aquarium or hardware store
ImageJ Software	ImageJ		Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)
Knife-coating device	BYK-GARDNER GMBH byk.com	2021	This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.
LED lamp, Reflector PAR38	Megaman	MM17572
LED LEDHUB	Omicon Laserage, Germany		Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential
LOCTITE AA 3494	Henkel AG & Co. KGaA	NA	Acrylic-based instant adhesive
NIS Elements AR Software	Nikon Inc		Software package used for image acquisition
pco.flim	PCO AG, Germany		Frequency domain based luminescence lifetime camera
platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)	Frontier Scientific	PtT975	O2 indicator
polyethylene terephthalate (PET) foil	Goodfellow	320-992-72	Such foils might also be found from other providers and serve as solid support
Polystyrene (PS)	Sigma Aldrich	9003-53-6	Polymer matrix
Schott RG610 filter	www.uviroptics.com		Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective
Vinyl electrical tape	Scotch, Super 33+	NA
Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor	delivered with the camera		Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount