Frekans-Etki Alanı Tabanlı Kamera Sistemi ile O2'nin Lüminesans Yaşam Boyu Görüntülemesi

Özet

Optik sensör folyoları ile 2D O₂ dağıtımlarının haritalama için yeni, frekans etki alanı parlaklık ömür boyu kamera kullanımını anlatıyoruz. Kamera sistemi ve görüntü analizi prosedürleri, su bitkilerinin rizosferinde O₂ mikro ortamının görselleştirilmesi için sensör folyolarının hazırlanması, kalibrasyonu ve uygulanması ile birlikte açıklanmıştır.

Özet

Çözünmüş oksijeni (O_2),2B'de yüksek uzamsal (< 50-100 μm) ve zamansal (< 10 s) çözünürlükte görüntülemek için bir yöntem tanımlıyoruz. Bu yöntem, frekans etki alanında parlaklık ömrünü görüntülemek için özel bir kamera sistemi ile birlikte O₂ hassas Parlak sensör folyoları (düzlemsel optodlar) kullanır. Düzlemsel optodeler, O_2-hassasgösterge boyasının bir polimer içinde çözülmesi ve karışımın bıçak kaplaması ile tanımlanmış bir kalınlıkta katı bir destek üzerine yayılması ile hazırlanır. Çözücü buharlaşma sonra, düzlemsel optode ilgi örneği ile yakın temas yerleştirilir - burada su bitki Littorella uniflorakökleri ile gösterilmiştir. Düzlemsel optod içindeki gösterge boyanın parlaklık ömründeki O₂ konsantrasyonuna bağlı değişim, şeffaf taşıyıcı folyo ve akvaryum duvarının arka tarafı üzerinden özel bir kamera kullanılarak görüntülenir. Bu kamera, modüle edilmiş bir uyarma sinyali ile emisyon sinyali arasındaki faz açısındaki bir kayma yla parlaklık ömrünü (μs) ölçer. Bu yöntem, sinyal uyarma kaynağının boya konsantrasyonu veya yoğunluğundan bağımsız olduğundan ve sadece doğal olarak başvurulan bir parametre olan lüminesans bozunma süresine dayandığından, lüminesans yoğunluğu görüntüleme yöntemlerinden daha üstündür. Sonuç olarak, ek bir başvuru boyası veya diğer başvuru araçları gerekmez. Biz bitki rizosferlerin makroskopik O₂ görüntüleme için sistemin kullanımını göstermek, ancak kamera sistemi de kolayca bir mikroskop ile birleştiğinde olabilir.

Giriş

Tortular ve topraklarda çözünmüş gazların ve iyonların dağılımı ve dinamiği mikrobiyal solunum^1,2veya bitki köklerinden radyal oksijen kaybı^3,4,5gibi biyojeokimyasal süreçler hakkında önemli bilgiler sağlar ve mikropların kimyasal mikroortamı^6,7, bitki rizosferleri^5,8,9 ve hayvan yuvaları^{10, 11,12}. Bu tür difüzyon sınırlı ortamlarda biyolojik ve kimyasal aktivite kimyasal yüzeyler veya biyojeokimyasal süreçlerin ürünlerinin dik gradyanlar oluşturabilirsiniz. Özellikle, O₂ kullanılabilirliği biyojeokimyasal süreçler ve böylece biyoloji ve bir sistemin ekoloji üzerinde büyük bir etkisi vardır¹³. Bu nedenle, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlükte O₂ konsantrasyonlarının analizi su ve karasal bilimlerde büyük önem taşımaktadır. İlk olarak, elektrokimyasal ve optik mikrosensörler^14,15 bu önemli analit ölçmek için geliştirilmiştir. Daha sonra, 2 boyutlu (2D) düzlemsel optodlar ile O₂ görüntüleme tanıtıldı^{12,16,17,18,19}, hangi görüntüleme ve toprak ve tortularda heterojen O₂ dağılımı nın niceleme sağladı.

Düzlemsel O₂ optodes uygun bir polimer²¹içinde çözünmüş bir O₂-hassas gösterge boya²⁰oluşur. Gösterge boya belirli optik dalga boylarında heyecanlı ve parlaklık şeklinde gevşeme üzerine kırmızı kaydırılmış ışık yayan. O₂varlığında , heyecanlı gösterge boya çarpışma üzerine O₂ molekülüne enerji aktarabilirsiniz, çarpışma tabanlı lüminesans söndürme olarak adlandırılır²². Bu nedenle, parlaklık yoğunluğu yanı sıra parlaklık ömrü artan O_{2 konsantrasyonu} ile azalır²³. İdeal bir durumda yoğunluk ve yaşam süresindeki değişim, belirli bir konsantrasyonda Parlaklık yoğunluğunu veya yaşam sürelerini (I₀; τ₀) veya O_2'nin varlığını (I, τ) kullanarak Stern-Volmer denklemini (denklem 1) takip eder [Q]. Stern-Volmer sabiti (K_sv),optodun O_2'yekarşı duyarlılığıiçin bir ölçüdür; K_SV sıcaklık ve basınç gibi çevresel değişkenlere bağlıdır.

(1)

O₂ dağılımındaki ilgili değişiklikleri görselleştirmek için düzlemsel sensör folyosu üzerinden kamera sistemi ile bu tür değişikliklerin kaydedilmesi kullanılabilir. Başlangıçta basit parlaklık yoğunluğu tabanlı O₂ görüntüleme¹⁸kullanılmıştır. Ancak, bu tür metodoloji, heterojen aydınlatma, uyarma kaynağı veya kameradaki dalgalanmalar ve düzlemsel optod içinde gösterge boyasının düzensiz dağılımı nedeniyle sonuçların güvenilirliğini tehlikeye sokan dış parazitlere karşı çok hassastır.

Bu sınırlamalardan bazıları, O 2 duyarlı gösterge boyasının,O₂-göstergesinden farklıbir spektral aralıkta yayılan duyarsız bir referans boya ile düzlemsel optodun polimer tabakasında birlikte immobilize edildiği ratiometrik görüntüleme¹⁷,²⁴için düzlemsel optodlar kullanılarak hafifletilebilir. İki spektral pencerede edinilen emisyon görüntülerine dayanarak, O₂duyarlı emisyon sinyali referans sinyali ile bölünür ve yukarıda belirtilen parazitlere daha az yatkın bir oran görüntüsü oluşturur^5,17. Bu yöntem, ideal olarak aynı uyarma kaynağı tarafından heyecanlanabilen, ancak kameranın başka bir spektral penceresinde (örneğin, bir RGB kameranın başka bir renk kanalında) farklı bir dalga boyunda (önemli bir spektral çakışma olmaksızın) yayan ikinci bir boyanın kullanılmasını gerektirir.

Alternatif olarak, O₂ görüntüleme gösterge konsantrasyonu^25'tekidüzensiz aydınlatma veya heterojenliklerden etkilenmeyen gösterge boyanın parlaklık ömründeki O_2'yebağımlı değişimin ölçülmeye dayandırılabilir. İlk parlaklık ömür boyu o₂ görüntüleme sistemleri bir kapı şarj lı cihaz (CCD) kamera sistemi²⁶ile zaman etki alanı ölçümleri dayalı, bir darbeli uyarma kaynağı kullanılır ve parlaklık görüntüleri göstergesi 8 uyarma veya emisyon içinde tanımlanmış zaman aralıkları üzerinden alınır^8,23,27. Bu görüntülerden, parlaklık ömrü belirlenebilir ve bir kalibrasyonda ilgili O₂ konsantrasyonu ile ilişkili olabilir. Daha sonra, düzlemsel optoda karşı preslenmiş belirli bir örnek için parlaklık ömrü görüntüleri O₂ konsantrasyonu karşılık gelen 2D dağılımı görüntüleri dönüştürülebilir. Bu sistem laboratuvar ve yerinde^16,28,birçok uygulamada kullanılmıştır, ancak temel kapı-mümkün CCD kamera artık ticari olarak kullanılabilir.

Son zamanlarda, frekans-etki alanı⁸görüntüleri elde eden farklı bir parlaklık ömür boyu kamera sistemi, serbest bırakıldı. Sistem uyarma için sürekli olarak modüle edilmiş bir ışık kaynağına dayanır. Bu ya zaman alanında görüntü edinimi için kullanılan bir darbeli uyarma yerine bir sinüzoidal veya kare dalga olabilir. Bu modülasyon, o₂ gösterge boyasının modüle edilmiş bir parlaklık salınımı ile sonuçlanır, bu da bir açı ile faz-shifted, φ, hangi gösterge boya parlaklık ömrüne bağlıdır (τ) (bkz. denklem 2).

(2)

Uyarma ve emisyon genliği arasındaki değişim (yani, modülasyon indeksi veya derinliği (genlik sabit parlaklık parçasıile bölünür)) arasındaki değişim de parlaklık ömrüne bağlıdır. Yani, bilinen bir modülasyon frekansı ayarlayarak kamera içinde özel CMOS görüntü sensörü ^başkabir yerde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ns içinde parlaklık ömrünü ölçmek mümkün 8^,29,30. Çalışma prensibi hakkında genel bir kılavuz bulunabilir (aşağıdaki bağlantı https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8kullanılarak).

Aşağıdaki protokolde, biz 2D^9,31suda tatlı su bitki Littorella uniflora kökleri etrafında O₂ konsantrasyonu dağılımı görüntüleme için yeni kamera sisteminin kullanımını göstermektedir. Bu yöntemin hiçbir şekilde bu uygulamayla sınırlı olmadığını vurgulamak isteriz. Oksijene duyarlı optodlar veya sensör parçacıkları²⁷ çeşitli görüntüleme yöntemleri ile birlikte tıbbi araştırma^{kullanılmıştır 32}, biyobaskı³³, basınca duyarlı boyalar için^34,35, veya fotosentetik sistemleri incelemek için^2,36,37, sadece uygulamanın birkaç diğer alanları isim.

Protokol

1. Düzlemsel O₂ optod imalatı

1. Çözün 1.5 mg lüminesan O₂ indikatör boya platin(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentaflorfenil)-porfirin (PtTFPP) ve 100 mg polistiren (PS) kloroformin 1 g olarak adlandırılan 'sensör kokteyl' almak için.
   NOT: Kokteyl kapalı, gaz geçirmez cam şişede buzdolabında birkaç saat bekletilebilir ve daha fazla kullanıma kadar karanlıkta.
2. Temiz, tozsuz polietilen tereftalat (PET) folyo (uygulamaya bağlı boyut) bir su veya etanol yardımı (%70) yardımıyla temizlenmiş cam plaka üzerinde tamir film (Şekil 1A).
3. Temizlenmiş bıçak kaplama cihazını (120 μm) folyoya yerleştirin ve sensör kokteylinin bir satırını cam pipet kullanarak cihazın önüne uygulayın(Şekil 1B). Daha sonra, kokteyli eşit olarak yaymak için bıçak kaplama cihazını PET folyoüzerinde yavaşça ve düzgün bir şekilde sürükleyin.
   NOT: Tüm malzeme ve aletler iyice temizlenmeli ve üretim duman kaputu, akış tezgahı veya bir nokta emme cihazının altında tozsuz bir ortamda yapılmalıdır. Son sensör folyosındaki heterojenlikleri önlemek için, kloroform hızlı buharlaştığı ndan, sensör kokteylinin folyoya uygulanmasını takip eden adımlar hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
4. Bitmiş düzlemsel O₂-hassas optode'u ortam havasında 1 saat boyunca kurutun ve daha sonra 50-60 °C'de bir ısıtma kabininde gece boyunca, üretilen optodları karanlıkta (örneğin, kağıt zarfiçinde)daha fazla kullanıma kadar saklayın .
   NOT: Düzlemsel O₂ optodes kuru ve karanlıkta birkaç ay için yıllar önce kullanılabilir. 1-20 μm arasında değişen son tabaka kalınlığı, yeterli parlaklık sinyali ve yeterli yanıt süreleri ile iyi sonuçlar verdiği kanıtlanmıştır.

2. Rhizo-sandviç odası

1. İki cam plakayı (24,5 x 14 cm^2,kalınlık: 4 mm) %96 etanol ile temizleyin.
2. Mikroskop slaytlarını (76 x 26 mm², kalınlık: 1 mm) ilk cam plakanın kenarları boyunca (yani arka oda kenarı) tutkallamak için hafif kürebilen, akrilik esaslı anlık yapıştırıcı (Bkz. Malzeme Tablosunabakınız) kullanın. Gerektiğinde mikroskop slaytları kısaltmak için bir cam kesici kullanın.
   DİkKAT: Camın kesilmesi keskin kenarlara neden olabilir ve dikkatli kullanılmalıdır.
   NOT: Mikroskop slaytları ön ve arka arasında boşluk işlevi görür ve köklerin kalınlığına ve bitki büyüklüğüne bağlı olarak birden fazla mikroskop slayt katmanı üst üste yapıştırılabilir.
3. Yapıştırılmış mikroskop slaytlar arasındaki boşluğa sığacak şekilde düzlemsel optode'u gerekli şekil ve boyuta kesin. Ön cam plakanın içine, kaplamalı tarafı yukarı doğru yerleştirin, üzerine bastırıldığında ilgi örneği ile temas sağlar.
4. Optod folyobir kenarı cam plaka ya da cam plaka ve optode folyo arasında musluk suyu birkaç damla ekleyin(Şekil 2A). Yavaşça cam yüzeyinde kendini düzeltmek için izin bu su damlacıkları üzerinde folyo indirin.
5. Sensör kaplamasının çizilmesini önlerken, düzlemsel optod ile cam plaka arasında sıkışmış hava kabarcıklarını yumuşak bir doku kullanarak dikkatlice çıkarın. Cam plakayı kurutun ve optode folyonun kalan kenarlarını cam plakaya bantlayın(Şekil 2B).
   NOT: Su altında uygun yapışma içeren bir bant seçilmelidir.
6. 0,5 mm. Örgü boyutunda bir kafes boyutu kullanarak tortu elek ilk cam plaka(Şekil 2C)Üzerine ıslak tortu bir kaşık yerleştirin.
   NOT: Kafes boyutu spacer kalınlığının yarısından büyük olmamalıdır.
7. Tortuyu eşit olarak dağıtın ve düz bir cam plaka kullanarak mikroskop slayt boşlukları ile aynı kalınlığa ayarlayın. İkinci cam plakanın hazneyi düzgün bir şekilde mühürlediğinden emin olmak için mikroskop slaytlarının üst yüzeyini dikkatlice temizleyin.
8. Mikroskop slayt yüzeyine silikon gres uygulayın. Dikkatle hava kabarcıkları oluşumunu kaçınarak, ince bir su filmi ile tortu kapağı.
9. Littorella uniflora'nın tek bir çekimini dikkatlice yıkayın ve bitki yapraklarının üst açık taraftan dışarı yapışmasıyla tortuüzerine yerleştirin(Şekil 2D).
10. İkinci cam plakayı, optod ile birlikte tortuüzerine yerleştirin ve optodu bitki kökleri ve çevresindeki tortuile yakın temas halinde getirmek için hafif basınç uygulayın.
    NOT: Tortuda sıkışmış hava kabarcıkları cam plakalar yatırılarak bir araya getirilerek çıkarılabilir.
11. Cam plakaları kelepçelerle birbirine bağlayın (Şekil 2E). Dış kenarları kağıt mendille kurulayın. Yaprakları rizo-sandviçin tüm montajı boyunca nemlendirilmiş tutun (örn. birkaç damla su ekleyerek).
12. Vinil elektrik bandı kullanarak rizo-sandviç odası sıkın. Kenarları modelleme kil ile kapatın ve ayrıca vinil elektrik bandı ile bantlayın(Şekil 2F).
    NOT: Eğer tortuda çok sayıda hava kabarcığı veya boşluk mikroskop slaytları ile ikinci cam plaka arasında tortu taneleri varsa, gözenek suyu dışarı sızabileceğinden oda yeniden biraraya getirilmelidir (tekrar adımları 2.4 - 2.8).
13. Rizo-sandviç kapsayacak şekilde opak bir plastik kullanın, ancak bitki dışarı sopa yaprakları için folyo bir yarık bırakın. Plastik folyo bir pencere kesin, böylece açılmak tarafından deneyler için açılabilir. Bitki kuluçkaya yatarken optodu fotoğraf ağartmaya karşı korumak için kauçuk bantlar(Şekil 2G)kullanarak klimalama süreleri boyunca pencereyi kapatın.
    NOT: Alg büyümesi ölçülen O₂ konsantrasyonlarını potansiyel olarak etkileyebileceğiiçin, filtrelenmiş su, önceden temizlenmiş deneysel ekipman lar kullanarak ve formasyon üzerine yosunları çıkararak bunu en aza indirmeye çalışmanızı öneririz.

3. Rhizo-sandviç odası kuluçka

1. Rhizo-sandwich haznesini bir su tankına (32 x 7 x 28 cm³⁾düzlemsel optode karşı kök büyümesini teşvik etmek için hafif eğimli bir konuma yerleştirin.
2. Su haznesini bitki yapraklarını tamamen batıracak kadar su yla doldurun.
3. Zaman kontrollü bir lamba kullanarak bitkinin iklimlendirme için 14 saat ışık, 10 saat karanlık döngüsü kurun. Havalandırma ve su karıştırma sağlamak için tanka bir hava taşı veya su pompası yerleştirin(Şekil 2H).

4. Görüntüleme

1. Görüntüleme kurulumu
   1. Rhizo-sandviç odasında düzlemsel optode kapsayan plastik folyo çıkarın. Akvaryum duvarına dik optode ile cam duvar ile oda yerleştirin. Akvaryum duvarına rhizo-sandviç odası basın için bir spacer kullanın.
      NOT: Akvaryum duvarının genel kalınlığı artı rizo-sandviç odası duvarı çok kalın olmamalıdır, ancak, parlaklık görüntüleme için aquaria duvarlar için cam kalınlıkları > 1 cm, dağınık ışığın zayıflamasını artırarak mekansal çapraz konuşma azaltmak için tavsiye edilir. Malzeme arabirimindeki ışık saçılımını en aza indirmek için her iki cam duvar (aynı refrakter indeks) için aynı malzemeyi kullanmak önemlidir; bu da bulanık bir görüntü yol açacağı gibi¹².
   2. Akvaryumun ve ilgi alanının (düzlemsel optod ile doğrudan temas halinde olan su bitkilittorella uniflorakökleri) önünde bir amaç ile donatılmış frekans-etki alanı tabanlı parlaklık ömür boyu kamera (Malzemeler Tablosubakınız) yerleştirin (Şekil 3).
      NOT: Kamera, kameranın kolay yükseklik ayarı için bir laboratuar standına yerleştirilebilir. Laboratuvar standının konumu işaretlenmeli ve sabit tutulmalıdır. Ayrıca, kamera deney sırasında kameranın kazara hareket etmesini önlemek için laboratuvar standına bantlanabilir.
   3. Uyarma kaynağından çıkarımları kaldırmak için, gösterge boyası olarak PtTFPP görüntüleme için uygun bir emisyon filtresi (bkz. Malzeme Tablosu)kamera objektifine vidalandı.
      NOT: Vidalı filtreler idealdir, ancak kare filtreler uygun bir adaptörle veya hedefe dikkatlice kaydedilerek de kullanılabilir.
   4. Bir LED uyarma kaynağını (Bkz. Malzeme Tablosu)kameranın modülasyonuna ve karanlık kapı çıkışına bağlayın.
      NOT: Eski ışık kaynağı için modülasyon sinyali sunar, ikinci görüntü sensörü görüntü okuma sırasında ışık kapatır. LED uyarma kaynağını ve kamerayı bilgisayara bağlayın. Tüm odayı karartarak veya tüm kuruluma yoğun, siyah bir bez koyarak görüntü okuma sırasında arka plan ışığı en aza indirilmelidir. İkinci durumda, kameranın ısınmasını önlemek için yeterli havalandırma sağlamak önemlidir.
   5. LED uyarma kaynağındaki ışık kılavuzunu düzeltin ve ilgi alanını kaplayan düzlemsel optode folyoyu eşit şekilde aydınlatmak için yerleştirin.
      NOT: Kullanılan LED uyarma kaynağında 3 farklı LED (460 nm, 528 nm, 625 nm) arasında geçiş yapmak mümkündür ve bunların yoğunluğu kontrol yazılımı ile ayarlanabilir.
2. Ayarlar ve kamera çalışması
   NOT: Açıklanan deneyler için, ticari olarak kullanılabilen bir yazılım paketinde yaşam boyu görüntüleme için özel bir modülle birlikte frekans alan tabanlı bir yaşam boyu kamera kullandık (bkz.
   1. Kullanmadan önce seçilen yazılımdaki kamerayı seçin.
      NOT: Yazılım ve kamera sürücülerinin, üreticilerin yönergelerine uygun görüntülemeden önce yüklenmesi gerekir.
   2. LED kontrol yazılımını açın (denemeyi başlatmadan önce tekrar yüklenir) ve bekleme deyanarak uygun LED'i (burada: 528 nm) seçin. LED yoğunluğunu gerektiği gibi ayarlayın (%burada %30'a). LED'in harici TTL tarafından tetiklediğinden emin olun; bu, LED için analog ve senkronizasyon işaretleyerek yapılır.
      NOT: ÇOK yüksek lazer gücü göstergenin veya referans boyanın hızlandırılmış fotoğraf ağartılmasına yol açabileceğinden, LED yoğunluğunun ayrı ayrı ayarlanması gerekir.
   3. Kamerayı odakla ve hedefin diyafram açıklığını manuel olarak ayarlayın (mevcut çalışmada f = 2.8 kullanın).
      NOT: Kamerayı akvaryum camına değil düzlemsel optode odaklamak önemlidir; bu ölçek için bir cetvel ile bir görüntü alarak ve optode üzerinde cetvel gölgesi üzerinde odaklanarak, gerçek cetvel yerine sağlanabilir.
   4. Yazılımın kamera kontrol paneli içinde aşağıdaki parametreleri ayarlayın: dahili modülasyon kaynağı; çıkış dalga formu için sinüs dalgası; ek faz örneklemesi (Evet); 8 faz örnekleri, faz sırası karşıt, A + B okuma dokunun; 5 kHz modülasyon frekansı.
      NOT: Bu parametreler görüntü kalitesini etkiler ve gerekirse değiştirilebilir. Kameranın üreticisi tek tek parametreler hakkında yönergeler sağlar (Kamera üreticisi yazılım güncellendiğinde yönergeleri ve güncellemeleri yayımlamaktadır).
   5. Denemelerden önce bir referans görüntüsü alın.
      NOT: Bu, bir kalibrasyon standardının (bilinen bir ömür boyu (ns veya μs) ile Parlak boyanın görüntülenmesi yle veya LED'in yansıyan ışığıkullanılarak yapılabilir. İkinci durumda, emisyon uzun geçiş filtresi objektiften kaldırılması gerekir ve bilinen ömür 1 ns ayarlanabilir.
   6. Normalleştirilmiş parlaklık yoğunluğu görüntüsü için YG İstatistikleri okuması (bu panelin alt kısmında) 0,68 - 0,72 aralığında olana kadar özel görüntüleme yazılımının kalibrasyon bölümündeki pozlama süresini ayarlayın.
      NOT: Şimdi referans ömrü (örneğin, 1 ns) yazılıma giriş olarak verilir.
   7. Bir referans ölçüm serisinin edinimini başlatmak için Capture tuşuna basın.
      NOT: Tamamlandığında, referans verileri depolanır ve numuneler üzerinde tek veya zaman atlamalı ölçümler yapılabilir.
3. O₂ optodkalasyonunun kalibrasyonu
   1. Düzlemsel O₂duyarlı optod parçasını (küçük) bir cam akvaryuma yerleştirin. Kalibrasyon odasının cam duvarındaki düzlemsel optodayı daha önce açıklandığı gibi düzeltin (bkz. bölüm 2.3). Kalibrasyon akvaryumu kameranın önüne yerleştirin. LED ile bile aydınlatma sağlamak, hem de optod görüş alanının tamamını doldurur.
      NOT: Düzlemsel optod, aynı folyo parçasından veya gerçek deneyde kullanılan folyoile aynı sensör kokteylinden yapılmalıdır.
   2. Akvaryumu deneylerde kullanılan aynı sıvı ortamla doldurun.
      NOT: Kalibrasyonlar ve deneyler için farklı ortamlar kullanmak ölçümü etkileyebilir (örneğin, sensör yanıtını ve/veya O₂ çözünürlüğünü değiştirerek). Bu nedenle, kalibrasyon aynı ortamda ve gerçek deney ile aynı sıcaklıkta yapılmalıdır. Sıcaklıkdalgalanmaları parlaklık sinyalini etkileyecek ve kaçınılmalıdır. Ancak, sıcaklık sabit tutulamıyorsa, O_2-hassasoptod (birden fazla nokta) farklı (ilgili) sıcaklıklarda kalibre ve değerlerin sonraki yeniden hesaplanması ile sıcaklık telafisi yapılmalıdır.
   3. Bir gaz karıştırma cihazı kullanarak, bilinen O₂ konsantrasyonunun hava/N₂ gaz karışımı ile suyu yıkayarak kalibrasyon akvaryumu içindeki O₂ konsantrasyonunu ayarlayın. Suyun yeterli bir süre için havalandırarak kullanılan gaz karışımı ile iyi dengelenir emin olun (akvaryum akış hızı ve boyutuna bağlıdır).
      NOT: Kalibrasyon akvaryumundaki O₂ seviyesinin harici, kalibre edilmiş O₂ sensörlü ve sıcaklık düşük bir şekilde izlenmesinizi öneririz (örn. fiber optik veya elektrokimyasal O₂ sensörü kullanarak).
   4. Kalibrasyon odasında farklı O₂ konsantrasyonlarında bir dizi görüntü alın.
      NOT: Elde edilen kalibrasyon verilerine uygun bir eğri sağlamak için en az beş farklı O₂ konsantrasyonu ölçülmelidir. 0 hPa (anoksik koşullar) olarak ölçmek ve daha sonra belirli bir gösterge boya dinamik aralığı üzerinde diğer değerleri dağıtmak önemlidir. Burada PtTFPP'yi polistiren matrisinde hareketsiz hale getirilen O₂duyarlı gösterge boyası olarak kullandık. Görüntüler 0, 48, 102, 156 ve 207 hPa olarak alınmıştır; 207 hPa verilen tuzluluk ve basınçta % 100 hava doygunluğu karşılık gelir.
4. Numunenin görüntülenmesi
   1. Örneği kameranın önüne yerleştirin ve hatta aydınlatmayı sağlayın.
   2. Tesisin ışılışı ömür boyu görüntüsünü edinmeden hemen önce, tesise (ve diğer tüm tüm ışık kaynaklarına) ışınlama sağlayan ışığı kapatın. Satın alma süresini yoğunluk görüntüsüne göre ayarlayın ve sinyalin ömür boyu tayinde iyi bir sinyal için aşırı doymamış veya çok zayıf olmasını sağlar.
   3. Bitkiyi değişen ışık koşullarına (örn. ışık/ karanlık) maruz bırakın ve bir dizi görüntü elde edin.
   4. Yapısal bir görüntüelde etmek için odadaki ışığı açın.
      NOT: Arka plan ışığı açıldığında, kamera gerçekçi bir ömür boyu görüntü ölçmez. Ancak, yoğunluk görüntüsü şimdi yarı saydam optod aracılığıyla görüldüğü gibi tüm görüş alanını gösterir.
   5. Edinilen görüntülerin daha sonra ölçeklemesini sağlamak için görüş alanında cetvel veya benzer bir görüntü alın.

5. Veri analizi

1. Kamera üreticisi tarafından sağlanan makroyu kullanarak faz ömrü ve yoğunluk görüntülerini doğrudan ilgili görüntüleme yazılımından dışa aktarın.
2. Serbestçe kullanılabilen bir görüntü analizi yazılımı kullanarak daha fazla görüntü analizi gerçekleştirin (bkz. Malzemeler Tablosu).
3. Görüntü analizi yazılımındaki kalibrasyonun faz ömrü ndeki görüntülerini açın ve ölçü işlevini kullanarak görüntünün tamamının ortalamasını belirleyin. Ölçülen yaşam sürelerini bilinen O₂ konsantrasyonlarına göre çizin ve kalibrasyon fonksiyonunu belirleyin(Şekil 4A).
4. Tüm verilerden 0 /τ hesaplayın (τ_0, O_2'ninyokluğunda ölçülen faz ömrüdür). Bu değerleri bilinen O₂ konsantrasyonlarına göre çizin (Şekil 4B).
5. Dinamik çarpışma söndürme (denklem 3)^38,39 [Q] O₂ konsantrasyonu için basitleştirilmiş iki sitemodeli kullanarak, kalibrasyon çiziminden K_sv ve f parametrelerini belirleyin. Daha sonra K_sv ve f'yi belirleyen veri analizi yazılımındaki uyum işlevini tanımlayın.

(3)

6. Belirlenen parametreleri kullanarak görüntülenmiş yaşam ömürlerini O₂ konsantrasyonlarına dönüştürmek için görüntü analiz yazılımında edinilmiş örnek görüntüleri açın, K_sv, f ve τ ₀.
   NOT: Alternatif bir yaklaşım olarak edinilmiş kalibrasyon fazı ömür değerleri(Şekil 4A)doğrudan kullanılabilir. Bu durumda, kalibrasyon için eğri sığdırım işlevini kullanan üstel bir uyum kullanılır.
7. Görüntü analizi yazılımında sonraki cetvel ile görüntüyü açın ve ölçüm aracını kullanarak bilinen bir mesafeyi ölçün. Bu ölçüyü Küme ölçeğialtında genel ölçek olarak ayarlayın.

Sonuçlar

Yeni görüntüleme sistemi için bir uygulama örneği olarak, karmaşık bir biyolojik numunenin 2D O₂ görüntülemesini (yani, su bitkisi Littorella uniflora'nınrizosferini) gösteriyoruz.

İlk olarak, yöntem bir düzlemsel sensör film, sözde düzlemsel optode imalatı açıklar. Şekil 1'degörüldüğü gibi, böyle bir optod şeffaf bir destek üzerine yayılan bir polimer matrisoptik gösterge ince bir tabakadan yapılır. Açıklanan protokoliz uyarınce, bıçak kaplama cihazının boşluğunda tanımlandığı gibi tek tip kalınlığa sahip homojen bir sensör filmi elde edilir. Üretilen optod yamalı bir sensör malzeme dağılımına sahipse (örn. kaplamadaki delikler, çizgiler veya boya agregaları (bu görsel olarak ve görsel olarak uv lambası yardımıyla değerlendirilebilir)), protokolün tekrarlanması ve tüm malzemelerin aseton kullanılarak iyice temizlenmesi gerekir.

Düzlemsel optod hazırlandıktan sonra, numune düzlemsel optodun algılama tabakası ile yakın temas halinde getirilebilir, burada bir rizo-sandviç odasına entegre düzlemsel optod ile gösterildiği gibi, çevredeki bir tortu matrisi içindeki bir bitkinin kökleri düzlemsel optoda yakın temas içinde konumlandırılabilir(Şekil 2). Doğru hazırlanırsa, rizo-sandviç odası bir akvaryumdan (kuluçka) diğerine (ölçüm) kolayca taşınabilir olmalıdır. Doğru inşa edilmezse, rizo-sandviç odası kararsız olabilir, tortu kaybedebilir veya hava kabarcıkları içerebilir. Bu nedenle, rizo-sandwich haznesinin montajdan hemen sonra görsel muayenesi önerilir.

Verilen protokol, frekans etki alanı tabanlı lüminesans ömür boyu kamerayı kullanarak düzlemsel optoda ile temas eden numunenin frekans-etki alanı tabanlı parlaklık ömür boyu görüntülemesini sağlar. Görüntü edinme modu ve bilimsel tamamlayıcı metal-oksit-yarı iletken (SCMOS) kamera özellikleri gibi bu kamera sistemi hakkında daha fazla bilgi son yayınlarda verilmiştir^8,29.

Kurulumun kendisi oldukça basittir ve sadece bir ışık kaynağını (bu durumda, bir LED uyarma kaynağı) ve optodlu örneği kontrol eden kamerayı içerir (Şekil 3). Tüm parçaların doğru bir şekilde bağlandığından ve numunenin homojen bir şekilde aydınlatıldığından emin olun. Ölçümleri önceden şekillendirirken arka plan ışıklarından kaçınılmalıdır.

Numunenin görüntülenmesinden önce, optodun kalibre edilmesi gerekir. Şekil 4A'dagörüldüğü gibi, ölçülen lüminesans ömrü yarı-üstel bozunmayı takiben artan O₂ konsantrasyonu ile azalır. Bu ilişki basitleştirilmiş iki siteli model(Şekil 4B ve denklem 3) kullanılarak da tanımlanabilir. Verilen örnekte, O₂ konsantrasyonu daha sonra hesaplamak için gerekli parametreler aşağıdaki gibidir; τ₀ = 56,26 μs, K_sv = 0,032 hPa^-1 ve f = 0,86.

Kalibrasyon yapmak, sistemin doğru çalıştığını test etmek için de ideal bir yoldur. Tüm bileşenler burada açıklandığı şekilde (veya üreticilerin yönergeleri dahilinde) yüklenmişse, ölçülen ömür Şekil 4'tegörüldüğü gibi aynı O₂ bağımlılığını göstermelidir. Buna ek olarak, O₂ algılama malzemelerinin (polimer ve boya) aynı kombinasyonu için, ölçülen τ₀ burada ölçülen (özellikle deneysel sıcaklıktan etkilenmiş) aynı aralıkta (± birkaç μs) olmalıdır. Benzer bir kalibrasyon eğrisi elde edemiyorsanız, tüm adımların doğru şekilde izlendirilip izlendirildik. Bazen optode yanlışlıkla örnek yerine cam duvara bakan hassas tarafı ile sabitlenir, ya da elde edilen görüntüler üzerinde veya az pozlanmış.

Kalibrasyon parametreleri ile Lüminesans ömrünü (τ) görüntüleyerek O₂ konsantrasyonu belirlemek mümkündür. Bu şekil 5A, Bgösterilmiştir , Littorella uniflora rizosferde O₂ konsantrasyonunun dağılımı karanlıkta görüntülendi ve ışık maruziyeti sonra 500 μmol fotonm m -2 s^-1 için 12 saat, sırasıyla. Bitkinin fotosentetik aktivitesi nedeniyle, rizosferdeki O₂ konsantrasyonu ışığa maruz kaldıktan sonra artmıştır. Yaşam boyu görüntülerin yanı sıra, görüntüleme geometrisi sabit tutarken, dış aydınlatma altında da "yapısal" görüntüler elde edilebilir. Bu şekilde, O₂ görüntüleri yapısal görüntü(Şekil 5C),kesitler veya ilgi bölgeleri ile tam olarak ilişkili olabilir. Örnek olarak, tek bir kök üzerindeki O₂ konsantrasyon profilleri sırasıyla karanlık ve ışıkta elde edilen görüntüden çıkarılabilmiştir (Şekil 5D).

Şekil 1: Düzlemsel O₂ optod imalatı. (A) Pet folyo cam bir plaka üzerine sabitlenir ve bıçak kaplama cihazı folyoüzerine yerleştirilir. (B) Hazırlanan sensör kokteyli, pet folyoya bıçak kaplama cihazının önünde ince bir çizgi olarak yayılır. (C) Bıçak kaplama cihazı, sensör kokteylini PET folyo üzerinde ince bir film olarak yaymak için aşağıya doğru hareket ettirilir ve solvent buharlaşması düzlemsel optode kullanmaya hazır olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bir düzlemsel O₂ optod entegrasyonu ile rhizo-sandviç oda montaj. (A) Optode bir su filmi kullanılarak cam plakalardan birine sabitlenir. (B) Optod elektrikli bant ile plakaya yapıştırılır. (C) Tortu, bağlı boşluklarla (yani mikroskop slaytları) karşı plakaya doldurulur. (D) Bitki kökleri eşit şekilde yayılan tortu üzerine yerleştirilir. (E) Rhizo-sandwich haznesi kapatılır ve geçici olarak kelepçelerle sabitlenir. (F) Tamamen kapalı ve monte rhizo-sandviç odası. (G) Optoda'yı kuluçka lambası ile ışığa maruz kalmaktan korumak ve alg büyümesini önlemek için monte edilmiş rhizo-sandviç odasının üzerine plastik bir kapak yerleştirilir. (H) Rhizo-sandviç odası bir akvaryumda kuluçkaya yatırılabıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Frekans-etki alanı tabanlı lüminesans ömür boyu kamera içeren görüntüleme kurulumu, amaç şeffaf akvaryum ve rizo-sandviç odası duvarları ile arkadan optode ile örnek odaklanmış. LED uyarma kaynağının ışık kılavuzu, numuneyi eşit olarak aydınlatmak için konumlandırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Düzlemsel O₂ optod için kalibrasyon eğrileri. (A) Su dolu kalibrasyon odasındaki ilgili O₂ konsantrasyonlarında ölçülen farklı fosforluk ömürleri. (B) Dinamik çarpışma söndürme için basitleştirilmiş iki siteli model kullanılarak donatılmış kalibrasyon verilerinin Stern-Volmer çizimi (denklem 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Su bitkilittorella uniflorarizosferde O₂ dağılımıömür boyu görüntüleme . (A) O₂ dağılımı yaklaşık 500 μmol fotonm -2 s^-1 de 12 saat boyunca ışık altında bitki tuttuktan sonra . (B) O₂ dağılımı, bitkiyi 1 saat karanlığa tuttuktan sonra (C) Düzlemsel optoddan görülen bitki köklerinin yapısal görüntüsü. (D) Kesitsel O₂ konsantrasyon profili (konum A ve B panelindeki sarı çizgi ile gösterilir) 12 saat açık (kırmızı) ve 1 saat karanlıkta (siyah) sonra. (Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., Kühl, M. Luminescence Yaşam Boyu Kimyasal SensörlerGörüntüleme - Zaman-Etki Alanı ve Frekans-Etki Alanı Tabanlı Kamera Sistemleri arasında bir karşılaştırma izni ile uyarlanmıştır. Analitik Kimya. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)). Telif Hakkı (2019) Amerikan Kimya Derneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Bu protokolde optode hazırlığından O₂ görüntü analizine kadar tüm iş akışı ele alınmıştır. Bu protokolü izleyerek, kimyasal görüntüler yeni frekans-etki alanı tabanlı lüminesans ömür boyu kamera kullanılarak elde edilebilir. Uygulamaya bağlı olarak, düzlemsel optodlar sensör tabakasının çeşitli boyutlarda ve katman kalınlığında, santimetre karesantimetrenin birkaç onda birinden mikroskop kapak lı ve <1 μm kalınlığında sensör katmanları^6,40arasında değişen katman kalınlığında imal edilebilir. Bu yöntemin potansiyeli belirli bir uygulama ile gösterilmiştir, ancak bitki rizosferlerinde O₂ görüntüleme ile sınırlı değildir^12,28.

Bu yöntem, saf parlaklık yoğunluğu tabanlı kimyasal görüntüleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında çeşitli faydaları vardır. Luminescence ömür boyu görüntüleme değil, ya da en azından çok daha az, düzensiz aydınlatma, düzensiz optod kalınlığı etkilenen ve fotoğraf ağartma²⁵. Ayrıca, bu yöntem oranmetrik görüntüleme^17,37ortak ek bir referans boya kullanımını önler. Diğer yaşam boyu tabanlı kamera sistemleri ile karşılaştırıldığında, yaygın olarak kullanılan gated zaman-etki alanı kameralar gibi^8,26, burada sunulan yeni kamera sistemi ve protokol karşılaştırılabilir sonuçlar sunabilir. Yakın tarihli bir yayında, bu iki sistemin analitik özellikleri karşılaştırıldı ve frekans-etki alanı tabanlı parlaklık ömür boyu kamera sistemi en azından durdurulan zaman etki alanı tabanlı selefi⁸karşılaştırılabilir olduğu bulundu .

Sadece polimer matristeki bir göstergeden oluşan en basit O₂ optod'u sunduk. Birçok olası O₂ göstergeleri yanı sıra²⁰ bu katkı maddeleri kullanılabilir, yani, tio₂ veya elmas tozu² gibi saçılma ajanları sensör sinyalini artırmak için optod şeffaflığı azaltırken. Ayrıca ek boyalar enerji transferi⁴¹ile sinyal yoğunluğunu artırmak için kullanılabilir.

Düzlemsel optode imalatı için, tarif edilen sensör kokteyl bileşimini kullanırken, solvent buharlaşmasından sonra 7,5 ila 12 μm civarında son sensör tabakası kalınlığı nı (kullanılan boşluğun yaklaşık %10'u) vermek için 75 - 120 μm'lik bıçak kaplama cihazında bir boşluk kullanmanızı öneririz. Bu, daha yüksek boya yüklemesi veya daha yüksek parlaklık gösterge ve referans boyaları ve yanıt süresi seçilerek değiştirilebilen sinyal yoğunluğu arasında iyi bir uzlaşmadır. Katman kalınlığındaki artış tepki süresinin artmasına neden olur, çünkü analitin çevredeki ortamla algılama katmanında termodinamik dengeye ulaşması için gereken zaman aralığı^12'yeçıkar.

Burada açıklandığı gibi optodeler, o₂ konsantrasyonundaki değişikliklere birkaç saniye içinde tepki^{verirler 17.} Ultraince sensör kaplamaları ile saniyenin altında tepki süreleri spin kaplama⁶ile gerçekleştirilebilir. Destek veya bıçak kaplama cihazı iyi temizlenmemişse, homojen sensör katmanlarına neden olabilir. Ayrıca, kokteyl tamamen homojen olmadığında veya kaplama cihazının önüne yayıldıktan sonra çok hızlı uygulandığında böyle istenmeyen bir sonuç görülebilir. Bu nedenle, en iyi optodes hazırlamak için bazı uygulama gerekebilir.

Bu yöntem, optode yakın temas halinde konulabilir görüntü örnekleri için kullanılabilir, bazı deniz hayvanları gibi⁴², biyofilm⁶ ve toprak³¹ sadece birkaç isim. Biz bir amaç kullanarak bağımsız bir kurulum mevcut, ancak, kamera kolayca daha yüksek çözünürlüklü kimyasal görüntüleme için bir mikroskop birleştiğinde olabilir⁴³.

Zaman etki tabanlı lüminesans ömür boyu görüntüleme arka plan floresan²⁶bastırılması etkin iken, bu yeni frekans etki alanı tabanlı kamera sistemi kullanırken bir sorundur⁸. Sürekli görüntü edinimi sayesinde, bu kamera seçilen LED tarafından heyecanlanabilecek herhangi bir arka plan floresanını kaydeder ve seçilen spektral pencereye kamera hedefindeki emisyon filtresi tarafından tanımlandığı şekilde yayır. Bu görünüşte daha düşük bir ömür boyu ve sonuç olarak yanlış okumalar neden olacaktır. O₂ sensör uyarma ve emisyon ile örtüşen önemli bir içfloresan floresan örnekleri ile çalışmak durumunda, karbon siyahı içeren ek bir tabaka kaplama tarafından optod üstüne ekstra bir optik izolasyon uygulamak esastır^2,17. Böylece, sadece düzlemsel optod yayılan parlaklık kamera ulaşacaktır. Arka plan parlaklığını kontrol etmek için optode olmayan bir görüntü alınabilir, bu da sadece numunenin içsel parlaklığını gösterir. Gösterge boyanın parlaklık yoğunluğunu artırmak için sensör kokteyline TiO₂ veya elmas tozu^2,44gibi saçılma ajanları eklemek de mümkündür. Ancak, bu da daha hızlı fotoğraf ağartma yol açabilir ve TiO₂ bilinen bir fotoğraf katalizörü, bir boya fotostabilite bozabilir⁴¹. Göz önünde bulundurulması gereken bir başka yönü de arka plan ışığıdır. Parlaklık yaşam ları görüntülendiğinde, arka plan ışığının mümkün olduğunca verimli bir şekilde kaçınılması gerekir. Bu nedenle, bu görüntüleme yöntemi kurulumun karanlık bir ortama yerleştirilmesini gerektirir ve görüntü edinimi sırasında herhangi bir dış ışık kaynağının geçici olarak kapatılması gerekir.

Özetle, parlaklık ömür boyu görüntüleme birçok farklı uygulamalara adapte edilebilir sağlam bir kimyasal görüntüleme yöntemidir. Bu protokol (bkz. bölüm 1 - 5) Bir O₂ görüntüsü oluşturmak için gerekli tüm adımları kapsar ve 2D O₂ görüntüleme için durdurulan devre arası kameranın yerine düzlemsel optodeler ile değiştirebilen şu anda en esnek frekans etki alanı parlaklık ömür boyu görüntüleme sistemini kullanır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air pump with air stone and water pump	Local aquarium store
Chloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
DC4 silicone compound	Dow Corning GmbH	2793695
Gas mixer	Vögtlin Instruments GmbH	red-y compact meter GCM	This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices
Glass plates and aquaria	Local aquarium or hardware store
ImageJ Software	ImageJ		Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)
Knife-coating device	BYK-GARDNER GMBH byk.com	2021	This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.
LED lamp, Reflector PAR38	Megaman	MM17572
LED LEDHUB	Omicon Laserage, Germany		Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential
LOCTITE AA 3494	Henkel AG & Co. KGaA	NA	Acrylic-based instant adhesive
NIS Elements AR Software	Nikon Inc		Software package used for image acquisition
pco.flim	PCO AG, Germany		Frequency domain based luminescence lifetime camera
platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)	Frontier Scientific	PtT975	O2 indicator
polyethylene terephthalate (PET) foil	Goodfellow	320-992-72	Such foils might also be found from other providers and serve as solid support
Polystyrene (PS)	Sigma Aldrich	9003-53-6	Polymer matrix
Schott RG610 filter	www.uviroptics.com		Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective
Vinyl electrical tape	Scotch, Super 33+	NA
Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor	delivered with the camera		Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount