Luminescenza Lifetime Imaging di O2 con un sistema di telecamere basato su frequenza-dominio

Riepilogo

Descriviamo l'uso di una nuova telecamera a vita di luminescenza del dominio di frequenza per la mappatura delle distribuzioni 2D O₂ con fogli di sensori ottici. Il sistema di telecamere e le procedure di analisi delle immagini sono descritte insieme alla preparazione, alla calibrazione e all'applicazione di fogli di sensori per la visualizzazione del microambiente O₂ nella rizosfera delle piante acquatiche.

Abstract

Viene descritto un metodo per l'immagine di ossigeno disciolto (O₂), in 2D ad alta risoluzione spaziale (< 50-100 m) e temporale (< 10 s). Il metodo utilizza fogli di sensori luminescenti sensibili O₂ (optode planari) in combinazione con un sistema di telecamere specializzato per l'imaging della durata della luminescenza nel dominio della frequenza. Gli optodi planari vengono preparati sciogliendo il colorante indicatore sensibile_Oin un polimero e diffondendo la miscela su un supporto solido in uno spessore definito tramite rivestimento del coltello. Dopo l'evaporazione del solvente, l'optode planare viene posto a stretto contatto con il campione di interesse - qui dimostrato con le radici della pianta acquatica Littorella uniflora. Il_cambiamento o 2 dipendente dalla concentrazione nella durata della luminescenza del coloranti indicatore all'interno dell'optode planare è immagine attraverso il retro della pellicola portante trasparente e la parete dell'acquario utilizzando una fotocamera speciale. Questa telecamera misura la durata della luminescenza (z) attraverso uno spostamento dell'angolo di fase tra un segnale di eccitazione modulato e un segnale di emissione. Questo metodo è superiore ai metodi di imaging dell'intensità della luminescenza, in quanto il segnale è indipendente dalla concentrazione o dall'intensità del colore della fonte di eccitazione e si basa esclusivamente sul tempo di decadimento della luminescenza, che è un parametro intrinsecamente referenziato. Di conseguenza, non è necessario un tintura di riferimento aggiuntiva o altri mezzi di riferimento. Dimostriamo l'uso del sistema per l'imaging macroscopico O₂ di rizosfere vegetali, ma il sistema di telecamere può anche essere facilmente accoppiato a un microscopio.

Introduzione

La distribuzione e la dinamica di gas e ioni disciolti nei sedimenti e nei suoli forniscono informazioni chiave sui processi biogeochimici come la respirazione microbica^1,2, o la perdita radiale di ossigeno dalle radici vegetali^3,4,5, e il microambiente chimico dei microbi^6,7, rizosfere vegetali^5,8,9 e tane animali^{10, 11,12}. L'attività biologica e chimica in tali ambienti con diffusione limitata può creare ripide sfumature di substrati chimici o prodotti di processi biogeochimici. In particolare, la disponibilità di O₂ ha un enorme impatto sui processi biogeochimici e quindi sulla biologia e l'ecologia di un sistema¹³. Pertanto, l'analisi delle concentrazioni di O₂ ad alta risoluzione spaziale e temporale è di primaria importanza nelle scienze acquatiche e terrestri. In primo luogo, sono stati sviluppati microsensori elettrochimici e ottici^14,15 per misurare questo importante analita. Successivamente, è stata introdotta l'imaging 2 dimensionale (2D) di O₂ con optodi planari^{12,16,17,18,19}, che ha permesso la visualizzazione e la quantificazione della distribuzione eterogenea O₂ nei suoli e nei sedimenti.

Gli optodi Planar O₂ sono costituiti da un coloranti indicatore sensibile O₂₂, che viene sciolto in un polimero adatto²¹. Il coloranti indicatore è eccitato a specifiche lunghezze d'onda ottiche ed emette luce spostando verso il rosso al rilassamento sotto forma di luminescenza. In presenza di O₂, il colorante indicatore eccitato può trasferire la sua energia alla molecola O₂ al momento della collisione, che è indicato come disintazione di luminescenza basata sulla collisione²². Pertanto, l'intensità della luminescenza e la durata della luminescenza sono ridotte con l'aumento della concentrazione di O₂₂ ^. In un caso ideale il cambiamento di intensità e durata segue l'equazione Stern-Volmer (equazione 1) utilizzando l'intensità di luminescenza o la durata in assenza (I₀;₎o presenza (I, ) di O₂ ad una data concentrazione [Q]. La costante Stern-Volmer (K_sv) è una misura per la sensibilità dell'optode verso O₂; K_SV dipende da variabili ambientali come temperatura e pressione.

(1)

La registrazione di tali cambiamenti nella luminescenza su un foglio di sensore planare con un sistema di telecamere può essere utilizzata per visualizzare i cambiamenti corrispondenti nella distribuzione O_2. Inizialmente, è stato utilizzato l'imaging O₂ basato sull'intensità della luminescenza semplice¹⁸. Tuttavia, tale metodologia è molto sensibile alle interferenze esterne, che compromettono l'affidabilità dei risultati a causa di un'illuminazione eterogenea, fluttuazioni nella fonte di eccitazione o fotocamera, nonché distribuzione irregolare del tintura indicatore all'interno dell'optode planare.

Alcune di queste limitazioni possono essere alleviate utilizzando optodi planari per l'imaging ratiometrico^17,24, dove il colorante indicatore sensibile O₂è co-immobilizzato nello strato polimerico dell'optode planare con un colorante di riferimento insensibile che emette in un intervallo spettrale diverso rispetto all'indicatore O_2. Sulla base di immagini di emissione acquisite in due finestre spettrali, il segnale di emissione sensibile a O₂è diviso per il segnale di riferimento, generando un'immagine di rapporto meno incline alle suddette interferenze^5,17. Il metodo richiede l'uso di un secondo coloranti, che idealmente può essere eccitato dalla stessa sorgente di eccitazione, ma emette a una diversa lunghezza d'onda (senza sovrapposizione spettrale significativa), in un'altra finestra spettrale della fotocamera (ad esempio, in un altro canale di colore di una fotocamera RGB).

In alternativa, l'imaging O₂ può essere basato sulla quantificazione del cambiamento dipendente da O₂nella durata della luminescenza del colorante indicatore, che non è influenzato da illuminazione o eterogeneità irregolare nella concentrazione dell'indicatore²⁵. I primi sistemi di imaging O₂ basati sulla luminescenza si basavano su misurazioni del dominio temporale con un sistema di telecamere a dispositivo accoppiato caricato (CCD) gate-able²⁶, in cui viene utilizzata una fonte di eccitazione pulsata e le immagini della luminescenza vengono rilevate su intervalli di tempo definiti all'interno dell'eccitazione o dell'emissione dell'indicatore^8,23,27. Da tali immagini, la durata della luminescenza può essere determinata e correlata alla corrispondente concentrazione di O₂ in una calibrazione. Successivamente, le immagini a vita di luminescenza per un dato campione premuto contro l'optode planare possono essere convertite in immagini della corrispondente distribuzione 2D della concentrazione di O_2. Questo sistema è stato utilizzato in molte applicazioni sia in laboratorio che in situ^16,28, ma l'essenziale telecamera CCD gate-able non è più disponibile in commercio.

Recentemente, è stato rilasciato un diverso sistema di telecamere a vita di luminescenza, che acquisisce le immagini nel dominio di frequenza⁸. Il sistema si basa su una fonte di luce continuamente modulata per l'eccitazione. Questo può essere un'onda sinusoidale o quadrata invece di un'eccitazione pulsata, che viene utilizzata per l'acquisizione di immagini nel dominio temporale. Questa modulazione si traduce in un'emissione modulata di luminescenza del colorante indicatore O_2, che è spostata di fase da un angolo, - che dipende dalla durata della luminescenza del colorante indicatore (vedi equazione 2).

(2)

Il cambiamento tra l'ampiezza di eccitazione e di emissione (cioè il cosiddetto indice di modulazione o profondità (ampiezza divisa per la parte di luminescenza costante)) dipende anche dalla durata della luminescenza. Quindi, impostando una frequenza di modulazione nota, lo speciale sensore di immagine CMOS all'interno della fotocamera è in grado di misurare la durata della luminescenza nella gamma ns fino alla gamma s come descritto nel dettaglio altrove ^8,29,30. È possibile trovare una guida generale sul principio operativo (utilizzando il seguente collegamento https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8).

Nel seguente protocollo, dimostriamo l'uso del nuovo sistema di telecamere per l'imaging della distribuzione della concentrazione di O₂ intorno alle radici della pianta acquatica d'acqua dolce Littorella uniflora in 2D^9,31. Vorremmo sottolineare che questo metodo non è affatto limitato a questa applicazione. Optodi sensibili all'ossigeno o particelle di sensori²⁷ in combinazione con vari metodi di imaging sono stati utilizzati nella ricerca medica³², in biostampa³³, per vernici sensibili alla pressione^34,35, o per studiare i sistemi fotosintetici^2,36,37, solo per citarne alcuni altri campi di applicazione.

Protocollo

1. Fabbricazione di optode planare O₂

1. Sciogliere 1,5 mg di colorante luminescente O₂ colorante platino(II)-5,10,15,25-tetrakis-(2,3,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP) e 100 mg di polistirolo (PS) in 1 g di cloroformio per ottenere il cosiddetto 'sensore'.
   NOTA: Il cocktail può essere conservato in una fiala di vetro chiusa e a tenuta di gas per alcune ore in frigo e buio fino a ulteriore utilizzo.
2. Fissare un terephthalate (PET) in polietilene pulito (PET) (dimensioni a seconda dell'applicazione) su una lastra di vetro pulita con l'aiuto di un'acqua o di etanolo (70%) pellicola (Figura 1A).
3. Posizionare il dispositivo di rivestimento pulito del coltello (120 m) sulla lamina e applicare una linea del cocktail del sensore davanti al dispositivo utilizzando una pipetta di vetro (Figura 1B). Quindi, trascinare il dispositivo di rivestimento del coltello lentamente e uniformemente sulla lamina PET per distribuire il cocktail in modo uniforme.
   NOTA: tutti i materiali e gli strumenti devono essere puliti accuratamente e la fabbricazione deve essere eseguita in un ambiente privo di polvere, come un cappuccio con fumi, una panca di flusso o sotto un dispositivo di aspirazione a punti. Per evitare eterogeneità nel foglio del sensore finale, i passaggi successivi all'applicazione del cocktail del sensore sulla lamina devono essere eseguiti rapidamente, poiché il cloroformio evapora rapidamente.
4. Asciugare l'optode planare finito O₂-sensibile nell'aria ambiente per 1 h e poi la notte in un armadio riscaldante a 50-60 gradi centigradi, risultando ad uno spessore finale dello strato dopo l'evaporazione del solvente di 12 m . Conservare le optode prodotte nel buio (ad esempio, in una busta di carta) fino a un ulteriore utilizzo (Figura 1C).
   NOTA: gli optodi Planar O₂ possono essere conservati a secco e al buio per diversi mesi o anni prima dell'uso. Uno spessore finale dello strato compreso tra 1 e 20 m ha dimostrato di fornire buoni risultati, con un segnale di luminescenza sufficiente e tempi di risposta adeguati.

2. Camera Rhizo-sandwich

1. Pulire due lastre di vetro (24,5 x 14 cm^2,spessore: 4 mm) con 96% di etanolo.
2. Utilizzare adesivo istantaneo a base di acrilico, in base alla luce, (vedi Tabella dei materiali)per incollare i vetrini al microscopio (76 x 26 mm^2,spessore: 1 mm) lungo i bordi della prima lastra di vetro (cioè il lato della camera posteriore), lasciando un lungo bordo aperto. Utilizzare una taglierina per accorciare i vetrini del microscopio in base alle esigenze.
   AVVISO: il vetro di taglio può causare bordi taglienti e deve essere maneggiato con cura.
   NOTA: I vetrini al microscopio funzionano come distanziali tra la parte anteriore e posteriore, e a seconda dello spessore delle radici e delle dimensioni della pianta, più strati di vetrini al microscopio possono essere incollati uno sopra l'altro.
3. Tagliare l'optode planare nella forma e nelle dimensioni richieste per adattarsi allo spazio tra i vetrini del microscopio incollato. Posizionarlo all'interno della lastra di vetro anteriore con il lato rivestito verso l'alto, per consentire il contatto con il campione di interesse quando viene premuto contro di esso.
4. Nastro un bordo della lamina optode alla piastra di vetro e aggiungere alcune gocce di acqua del rubinetto tra la piastra di vetro e la pellicola di optode (Figura 2A). Abbassare lentamente la pellicola su queste goccioline d'acqua permettendogli di raddrizzare se stesso sulla superficie del vetro.
5. Rimuovere con attenzione le bolle d'aria intrappolate tra l'optode planare e la piastra di vetro utilizzando un tessuto molle, evitando di graffiare il rivestimento del sensore. Asciugare la lastra di vetro e nastro i restanti bordi della lamina optode alla lastra di vetro (Figura 2B).
   NOTA: È necessario scegliere un nastro con adere adeguata sott'acqua.
6. Setacciare il sedimento utilizzando una dimensione della rete di 0,5 mm. Posizionare un cucchiaio di sedimento bagnato sulla prima lastra di vetro (Figura 2C).
   NOTA: la dimensione della mesh non deve essere maggiore della metà dello spessore del distanziale.
7. Distribuire il sedimento in modo uniforme e regolarlo allo stesso spessore dei distanziali a scorrimento al microscopio utilizzando una piastra di vetro piatto. Pulire con cura la superficie superiore dei vetrini del microscopio per garantire che la seconda lastra di vetro sigilli correttamente la camera.
8. Applicare il grasso di silicio sulla superficie del vetrino del microscopio. Coprire il sedimento con una sottile pellicola d'acqua, evitando con attenzione la formazione di bolle d'aria.
9. Lavare con cura un singolo germoglio di Littorella uniflora e posizionarlo sul sedimento, con le foglie della pianta sporgenti dal lato superiore aperto (Figura 2D).
10. Posizionare la seconda lastra di vetro, con l'optode attaccata ad esso, sul sedimento e applicare una leggera pressione per portare l'optode a stretto contatto con le radici della pianta e il sedimento circostante.
    NOTA: Le bolle d'aria intrappolate nel sedimento possono essere rimosse inclinando le lastre di vetro mentre le riuniscono.
11. Fissare le lastre di vetro insieme utilizzando morsetti (Figura 2E). Asciugare i bordi esterni con carta velina. Mantenere le foglie idratate per tutto l'assemblaggio del rhizo-sandwich (ad esempio, con l'aggiunta frequente di qualche goccia d'acqua).
12. Stringere la camera rhizo-sandwich utilizzando nastro elettrico in vinile. Sigillare i bordi con l'argilla di modellazione e nastro aggiuntivo con nastro elettrico in vinile (Figura 2F).
    NOTA: Se ci sono molte bolle d'aria nel sedimento, o grani di sedimenti tra i vetrini del microscopio distanziale e la seconda piastra di vetro, la camera deve essere rimontata come acqua pore può fuoriuscire (ripetere i passaggi 2.4 - 2.8).
13. Utilizzare una plastica opaca per coprire il rhizo-sandwich, ma lasciare una fessura nel foglio per le foglie della pianta a sporgere. Tagliare una finestra nella lamina di plastica, in modo che possa essere aperto per gli esperimenti dispiegandosi. Chiudere la finestra durante i tempi di acclimatazione utilizzando elastici (Figura 2G) per proteggere l'optode dallo sbiancamento fotografico mentre la pianta è incubata.
    NOTA: Poiché la crescita delle alghe potrebbe potenzialmente interferire con le concentrazioni di O₂ misurate, si consiglia di cercare di ridurla al minimo, utilizzando acqua filtrata, attrezzature sperimentali prepulite e rimuovendo le alghe al momento della formazione.

3. Incubazione camera Rhizo-sandwich

1. Posizionare la camera di rhizo-sandwich in un serbatoio d'acqua (32 x 7 x 28 cm³) in una posizione leggermente inclinata per favorire la crescita della radice contro l'optode planare.
2. Riempire il serbatoio dell'acqua con acqua sufficiente a sommergere completamente le foglie della pianta.
3. Stabilire un ciclo di 14 h luce, 10 h scuro per l'acclimatamento della pianta utilizzando una lampada a controllo del tempo. Mettere una pietra d'aria o una pompa dell'acqua nel serbatoio per garantire l'aerazione e la miscelazione dell'acqua (Figura 2H).

4. Imaging

1. Configurazione dell'imaging
   1. Rimuovere la pellicola di plastica che copre l'optode planare nella camera rhizo-sandwich. Posizionare la camera con la parete di vetro con l'optode in posizione verticale contro la parete dell'acquario. Utilizzare un distanziale per premere la camera rhizo-sandwich contro la parete dell'acquario.
      NOTA: Lo spessore complessivo della parete dell'acquario più la parete della camera rhizo-sandwich non dovrebbe diventare troppo spesso, tuttavia, gli spessori di vetro per le pareti di acquari per l'imaging della luminescenza sono raccomandati con > 1 cm, al fine di ridurre il cross-talk spaziale aumentando l'attenuazione della luce diffusa. È importante, utilizzare lo stesso materiale per entrambe le pareti di vetro (stesso indice refrattario), al fine di ridurre al minimo la dispersione della luce all'interfaccia del materiale; in quanto ciò porterebbe ad un'immagine sfocata e a¹².
   2. Posizionare la telecamera a vita di luminescenza basata su dominio di frequenza dotata di un obiettivo (vedi Tabella dei materiali)di fronte all'acquario e l'area di interesse (radici della pianta acquatica Littorella uniflora, che sono in contatto diretto con l'optode planare) (Figura 3).
      NOTA: la fotocamera potrebbe essere posizionata su un supporto di laboratorio per consentire una facile regolazione dell'altezza della fotocamera. La posizione del supporto di laboratorio deve essere contrassegnata e mantenuta fissa. Inoltre, la fotocamera può essere attaccata al supporto del laboratorio per evitare movimenti accidentali della fotocamera durante l'esperimento.
   3. Allevare un filtro di emissione adatto per l'imaging PtTFPP come tinri indicatore (vedi Tabella dei materiali)sull'obiettivo della fotocamera, per rimuovere le deduzioni dalla sorgente di eccitazione.
      NOTA: I filtri a vite sono ideali, ma i filtri quadrati possono essere utilizzati anche con un adattatore appropriato o con un attento tocco verso l'obiettivo.
   4. Collegare una sorgente di eccitazione LED (vedere Tabella dei materiali) all'output di modulazione e buio della fotocamera.
      NOTA: Il primo fornisce il segnale di modulazione per la sorgente luminosa, mentre il secondo spegne la luce durante la lettura dell'immagine del sensore di immagine. Collegare la sorgente di eccitazione LED e la fotocamera a un computer. La luce di fondo deve essere ridotta al minimo durante la lettura dell'immagine, oscurando l'intera stanza o mettendo un panno denso e nero sull'intero set-up. In quest'ultimo caso, è importante garantire una ventilazione sufficiente per evitare il riscaldamento della fotocamera.
   5. Fissare la guida luminosa nella sorgente di eccitazione LED e posizionarla per illuminare uniformemente la lamina di optode planare che copre l'area di interesse.
      NOTA: Nella sorgente di eccitazione LED utilizzata è possibile passare tra 3 diversi LED (460 nm, 528 nm, 625 nm), la cui intensità può essere regolata tramite il software di controllo.
2. Impostazioni e funzionamento della fotocamera
   NOTA: per gli esperimenti descritti, abbiamo utilizzato una videocamera a vita basata su dominio di frequenza in combinazione con un modulo dedicato per l'imaging a vita in un pacchetto software disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).
   1. Selezionare la fotocamera nel software scelto prima dell'uso.
      NOTA: i driver software e fotocamera devono essere installati prima di creare immagini seguendo le linee guida del produttore.
   2. Aprire il software di controllo LED (di nuovo installato prima di avviare l'esperimento) e scegliere il LED adatto (qui: 528 nm) selezionando standby. Impostare l'intensità del LED in base alle esigenze (qui al 30%). Assicurarsi che il LED sia attivato dal TTL esterno; questo viene fatto ticchettio analogico e la sincronizzazione per il LED.
      NOTA: L'intensità del LED deve essere regolata individualmente, in quanto una potenza laser troppo elevata può portare a uno sbiancamento fotografico accelerato dell'indicatore o del tintura di riferimento.
   3. Mettere a fuoco la fotocamera e regolare manualmente l'apertura dell'obiettivo (nel presente studio utilizzare f - 2,8).
      NOTA: È importante mettere a fuoco la fotocamera sull'optode planare e non sul vetro dell'acquario; questo può essere assicurato prendendo un'immagine con un righello per la scala, e concentrandosi sull'ombra del righello sull'optodo, piuttosto che sul righello effettivo.
   4. Impostare i seguenti parametri all'interno del pannello di controllo della telecamera del software: sorgente di modulazione interna; onda sinusoidale per la forma d'onda in uscita; campionamento di fase supplementare (Sì); 8 campioni di fase, ordine di fase opposto, Toccare A e B lettura; Frequenza di modulazione a 5 kHz.
      NOTA: questi parametri influiscono sulla qualità dell'immagine e possono essere modificati se necessario. Il produttore della fotocamera fornisce linee guida sui singoli parametri (il produttore della fotocamera sta rilasciando linee guida e aggiornamenti ogni volta che il software viene aggiornato).
   5. Prendere un'immagine di riferimento prima degli esperimenti.
      NOTA: Questo può essere fatto sia esaminando uno standard di calibrazione (un colore luminescente con una durata nota (ns o s)), o utilizzando la luce riflessa del LED. In quest'ultimo caso, il filtro passa lungo emissione deve essere rimosso dall'obiettivo e la durata nota può essere impostata su 1 ns.
   6. Regolare il tempo di esposizione nella sezione di calibrazione del software di imaging dedicato fino a quando la lettura delle statistiche del ROI (nella parte inferiore di questo pannello) per l'immagine normalizzata dell'intensità della luminescenza è compresa nell'intervallo da 0,68 a 0,72.
      NOTA: ora la durata del riferimento (ad esempio, 1 ns) viene fornita come input al software.
   7. Premere Acquisisci riferimento per avviare l'acquisizione di una serie di misurazione di riferimento.
      NOTA: Al termine, i dati di riferimento vengono memorizzati e le misurazioni singole o time lapse possono essere eseguite su campioni.
3. Calibrazione dell'optode O₂
   1. Posizionare un pezzo di un optode planare O_2-sensibilein un (piccolo) acquario di vetro. Fissare l'optode planare sulla parete di vetro della camera di calibrazione come descritto in precedenza (vedere la sezione 2.3). Posizionare l'acquario di calibrazione di fronte alla fotocamera. Assicurarsi che l'illuminazione uniforme da parte del LED, così come che l'optode riempie l'intero campo visivo.
      NOTA: L'optode planare deve essere dallo stesso pezzo di stagnola o realizzato dallo stesso cocktail sensore della lamina utilizzata nell'esperimento vero e proprio.
   2. Riempire l'acquario con lo stesso mezzo liquido utilizzato negli esperimenti.
      NOTA: l'utilizzo di diversi supporti per le tarature e gli esperimenti può influenzare la misurazione (ad esempio, modificando la risposta del sensore e/o la_solubilità del sensore). Pertanto, la calibrazione deve essere eseguita nello stesso mezzo e alla stessa temperatura dell'esperimento effettivo. Le fluttuazioni della temperatura influenzeranno il segnale di luminescenza e dovrebbero essere evitate. Tuttavia, se la temperatura non può essere mantenuta stabile, la compensazione della temperatura deve essere effettuata calibrando l'optode sensibile O₂(più punti) a temperature diverse (rilevanti) e il successivo ricalcolo dei valori.
   3. Regolare la concentrazione di O₂ all'interno dell'acquario di calibrazione lavando l'acqua con una miscela di gas aria /N₂ di concentrazione nota di O_2, utilizzando un dispositivo di miscelazione del gas. Assicurarsi che l'acqua sia ben equilibrata con la miscela di gas utilizzata aerando per un tempo sufficiente (dipende dalla portata e dalle dimensioni dell'acquario).
      NOTA: Si consiglia di monitorare il livello O₂ nell'acquario di calibrazione con un sensore O₂ esterno calibrato con compensazione della temperatura (ad esempio, utilizzando un sensore O₂ in fibra ottica o elettrochimico).
   4. Scattare una serie di immagini a diverse concentrazioni di O₂ nella camera di calibrazione.
      NOTA: è necessario misurare almeno cinque diverse concentrazioni di O₂ per consentire una curva adeguata adatta ai dati di calibrazione acquisiti. È importante misurare a 0 hPa (condizioni anossiche), quindi distribuire gli altri valori nell'intervallo dinamico del tintura indicatore specifico. Qui abbiamo usato PtTFPP come colorante sensibile O₂immobilizzato in una matrice di polistirolo. Le immagini sono state scattate a 0, 48, 102, 156 e 207 hPa; 207 hPa corrisponde al 100% della saturazione dell'aria alla salinità e alla pressione date.
4. Imaging del campione
   1. Posizionare il campione davanti alla fotocamera e garantire un'illuminazione uniforme.
   2. Spegnere la luce che fornisce irradia zione alla pianta (e a tutte le altre sorgenti luminose) appena prima di acquisire l'immagine di durata della luminescenza della pianta. Regolare il tempo di acquisizione in base all'immagine di intensità, assicurandosi che il segnale non sia né sovrasaturato né troppo debole per un buon rapporto segnale/rumore (S/N) nella determinazione della durata.
   3. Esporre la pianta a condizioni di luce variabili (ad esempio, luce / scuro) e acquisire una serie di immagini.
   4. Accendere la luce nella stanza per acquisire un'immagine strutturale.
      NOTA: quando la luce di sfondo è accesa, la fotocamera non misura un'immagine realistica a vita. Tuttavia, l'immagine di intensità ora mostra l'intero campo visivo visto attraverso l'optode semitrasparente.
   5. Acquisire un'immagine con un righello o simili nel campo visivo per consentire il ridimensionamento successivo delle immagini acquisite.

5. Analisi dei dati

1. Esportare la durata della fase e le immagini di intensità direttamente dal software di imaging dedicato, utilizzando la macro fornita dal produttore della fotocamera.
2. Eseguire ulteriori analisi delle immagini utilizzando un software di analisi delle immagini disponibile liberamente (vedere Tabella dei materiali).
3. Aprire le immagini della durata della fase della calibrazione nel software di analisi delle immagini e determinare la media dell'intera immagine utilizzando la funzione di misurazione. Tracciare le durate misurate rispetto alle concentrazioni note di O₂ per determinare la funzione di calibrazione (Figura 4A).
4. Calcolare 0 / s da tutti i dati (₀ è la durata della fase misurata in assenza di O₂). Tracciare questi valori rispetto alle concentrazioni note di O₂ (Figura 4B).
5. Determinare i parametri K_sv e f dal grafico di calibrazione, utilizzando il modello a due siti semplificato per lo spegnimento collisionale dinamico (equazione 3)^38,39 dove [Q] è la concentrazione O_2. Definire la funzione di adattamento nel software di analisi dei dati, che determina quindi K_sv e f.

(3)

6. Aprire le immagini di esempio acquisite nel software di analisi delle immagini per convertire le durate delle immagini in concentrazioni O_2, utilizzando i parametri determinati K_sv, f e ₀.
   NOTA: Come approccio alternativo, anche i valori di durata della fase di calibrazione acquisita (Figura 4A) possono essere utilizzati direttamente. In questo caso, per la calibrazione viene utilizzata una misura esponenziale che utilizza la funzione di adattamento della curva.
7. Aprire l'immagine con il righello successivo nel software di analisi delle immagini e misurare una distanza nota utilizzando lo strumento di misurazione. Impostare questa misurazione come scala globale in Imposta scala.

Risultati

Come esempio applicativo per il nuovo sistema di imaging, mostriamo l'imaging 2D O₂ di un campione biologico complesso (cioè la rizosfera della pianta acquatica Littorella uniflora).

In primo luogo, il metodo descrive la fabbricazione di una pellicola sensore planare, un cosiddetto optode planare. Come si vede nella Figura 1, tale optode è costituito da uno strato sottile di un indicatore ottico in una matrice polimerica che si diffonde su un supporto trasparente. Seguendo il protocollo descritto, si ottiene una pellicola sensore omogenea con uno spessore uniforme, come definito dallo spazio del dispositivo di rivestimento del coltello. Se l'optode prodotto ha una distribuzione del materiale del sensore patchy (ad esempio, fori nel rivestimento, mostra strisce o aggregati di tintura (questo può essere valutato visivamente e visivamente con l'aiuto di una lampada UV)), il protocollo deve essere ripetuto e tutti i materiali devono essere accuratamente puliti utilizzando acetone.

Una volta preparata l'optode planare, il campione può essere portato a stretto contatto con lo strato di rilevamento dell'optode planare, come mostrato qui con l'optode planare integrato in una camera rhizo-sandwich, dove le radici di una pianta all'interno di una matrice di sedimenti circostante possono essere posizionate a stretto contatto con l'optode planare (Figura 2). Se preparata correttamente, la camera rhizo-sandwich dovrebbe essere facilmente spostabile da un acquario (incubazione) all'altro (misurazione). Se non è stata costruita correttamente, la camera rhizo-sandwich può essere instabile, perdere sedimenti o contenere bolle d'aria. Si raccomanda pertanto l'esame visivo della camera rhizo-sandwich direttamente dopo l'assemblaggio.

Il protocollo specificato consente l'imaging a vita della luminescenza basata su dominio di frequenza del campione a contatto con l'optode planare utilizzando la fotocamera a vita di luminescenza basata su dominio di frequenza. Maggiori dettagli su questo sistema di telecamere come la modalità di acquisizione di immagini e le caratteristiche scientifiche complementari della telecamera metal-ossido-semiconduttore (SCMOS) sono fornite nelle recenti pubblicazioni^8,29.

La configurazione stessa è piuttosto semplice e include solo la fotocamera che controlla una fonte di luce (in questo caso, una sorgente di eccitazione LED) e il campione con l'optode (Figura 3). Assicurarsi che tutte le parti siano collegate correttamente e che il campione sia illuminato in modo omogeneo. La luce di fondo deve essere evitata durante la preformazione delle misurazioni.

Prima di imaging del campione, l'optode deve essere calibrato. Come si vede nella Figura 4A, la durata della luminescenza misurata diminuisce con l'aumento della concentrazione di O₂ a seguito di un decadimento quasi-esponenziale. Questa relazione può essere descritta anche utilizzando il modello a due siti semplificato(Figura 4B e equazione 3). Nell'esempio dato, i parametri necessari per calcolare successivamente la concentrazione di O₂ sono stati come segue; 0 x 56,26 s, K_sv - 0,032 hPa^-1 e f - 0,86.

L'esecuzione di una calibrazione è anche un modo ideale per verificare che il sistema funzioni correttamente. Se tutti i componenti sono installati come descritto qui (o all'interno delle linee guida dei produttori), la durata misurata dovrebbe mostrare la stessa dipendenza O₂ come si vede nella Figura 4. Inoltre, per la stessa combinazione di materiali di rilevamento O₂ (polimero e tinri), il misurato₀ dovrebbe essere nella stessa gamma (a pochi z) misurata qui (principalmente influenzata dalla temperatura sperimentale). Se non è possibile ottenere una curva di calibrazione simile, assicurarsi che tutti i passaggi siano stati seguiti correttamente. A volte l'optode viene accidentalmente fissato con il lato sensibile rivolto verso la parete di vetro piuttosto che il campione, o le immagini acquisite sono sovra o sottoesposte.

Con i parametri di calibrazione, è possibile determinare la concentrazione di O₂ esaminando la durata della luminescenza . Ciò è dimostrato nella Figura 5A,B, dove la distribuzione della concentrazione di O₂ nella rizosfera di Littorella uniflora è stata fotografata al buio e dopo l'esposizione alla luce a 500 fotoni mol m^-2 s^-1 per 12 h, rispettivamente. A causa dell'attività fotosintetica della pianta, la concentrazione di O₂ nella rizosfera è aumentata dopo l'esposizione alla luce. Oltre alle immagini a vita, anche le immagini "strutturali" possono essere acquisite sotto l'illuminazione esterna, mantenendo fissa la geometria dell'immagine. In questo modo, le immagini O₂ possono essere correlate con precisione all'immagine strutturale (Figura 5C), alle sezioni trasversali o alle regioni di interesse. Ad esempio, i profili di concentrazione O₂ in una singola radice sono stati estratti dall'immagine acquisita rispettivamente nel buio e nella luce (Figura 5D).

Figura 1: Fabbricazione di un optode planare O_2. (A) Un foglio di PET è fissato su una lastra di vetro e il dispositivo di rivestimento del coltello è posto sul foglio. (B) Il cocktail sensore preparato viene diffuso sulla lamina PET come una linea sottile davanti al dispositivo di rivestimento del coltello. (C) Il dispositivo di rivestimento del coltello viene spostato verso il basso per diffondere il cocktail del sensore come una pellicola sottile sulla lamina PET, che dopo l'evaporazione del solvente si traduce in un optode planare pronto all'uso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: assemblaggio da camera Rhizo-sandwich con integrazione di un optode planare O_2. (A) L'optode è fissato su una delle lastre di vetro utilizzando una pellicola d'acqua. (B) L'optode è incollato alla piastra con nastro elettrico. (C) Il sedimento viene riempito nella piastra opposta con i distanziali collegati (cioè i vetrini al microscopio). (D) Le radici delle piante sono poste sul sedimento uniformemente diffuso. (E) La camera rizo-sandwich è chiusa e temporaneamente fissata con morsetti. (F) Camera completamente chiusa e assemblata di rhizo-sandwich. (G) Per proteggere l'optode dall'esposizione alla luce da parte della lampada di incubazione ed evitare la crescita delle alghe, viene posto un coperchio di plastica sopra la camera assemblata di rhizo-sandwich. (H) La camera rhizo-sandwich incubata in un acquario. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Configurazione dell'imaging contenente la fotocamera a vita della luminescenza basata su dominio di frequenza, con l'obiettivo focalizzato sul campione con l'optode da dietro attraverso l'acquario trasparente e le pareti della camera rhizo-sandwich. La guida luminosa della sorgente di eccitazione LED è posizionata per illuminare il campione in modo uniforme. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Curve di calibrazione per optode planare O_2. (A) Diverse durate di fosforescenza misurate alle rispettive concentrazioni di O₂ nella camera di taration riempita d'acqua. (B) Grafico Stern-Volmer dei dati di calibrazione montato utilizzando il modello a due siti semplificato per lo spegnimento collisionale dinamico (equazione 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini a vita della distribuzione O₂ nella rizosfera della pianta acquatica Littorella uniflora. (A) O₂ distribuzione dopo aver tenuto la pianta sotto luce per 12 h a circa 500 fotoni mol m^-2 s^-1. (B) O₂ distribuzione dopo aver tenuto la pianta al buio per 1 h. (C) Immagine strutturale delle radici della pianta come visto attraverso l'optode planare. (D) Profilo di concentrazione o₂ trasversale (la posizione è indicata dalla linea gialla nel pannello A e B) dopo 12 h in luce (rosso) e 1 h nel buio (nero). Adattato con il permesso di (Koren, K., Mo'hammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., K'hl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors - Un confronto tra Time-Domain e Frequency-Domain Based Camera Systems. Chimica analitica. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)). Diritto d'autore (2019) American Chemical Society. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

In questo protocollo, viene coperto l'intero flusso di lavoro dalla preparazione dell'optode all'analisi delle immagini O_2. Seguendo questo protocollo, le immagini chimiche possono essere ottenute utilizzando la nuova fotocamera a vita di luminescenza basata su dominio di frequenza. A seconda dell'applicazione, gli optodi planari possono essere fabbricati in varie dimensioni e spessore dello strato dello strato del sensore che vanno da robusti optodi planari spessi 50-100 m di diversi decimi quadrati a scivolamenti di copertura al microscopio con strati di sensore <1 m di spessore^6,40. Il potenziale di questo metodo è stato dimostrato con una particolare applicazione, ma non è solo limitato all'imaging O₂ nelle rizosfere vegetali^12,28.

Questo metodo ha diversi vantaggi rispetto ai metodi di imaging chimico basati sull'intensità della luminescenza pura. L'imaging a vita di luminescenza non è, o almeno molto inferiore, influenzato da un'illuminazione irregolare, spessore di optode irregolare e sbiancamento fotografico²⁵. Inoltre, questo metodo evita l'uso di un tintura di riferimento aggiuntiva comune nell'imaging^{ratiometrico 17,37}. Rispetto ad altri sistemi di telecamere a vita, come le telecamere gated time-domain di uso comune^8,26, il nuovo sistema di telecamere e il protocollo qui presentati possono fornire risultati comparabili. In una recente pubblicazione, le caratteristiche analitiche di questi due sistemi sono state confrontate e si è scoperto che il sistema di telecamere a vita a vita di luminescenza basato su frequenza-dominio è almeno paragonabile al predecessore basato su dominio temporale^{interrotto 8}.

Abbiamo presentato la più semplice optode O₂ costituita solo da un indicatore in una matrice polimerica. Oltre a molti altri possibili indicatori O₂ ²⁰ che potrebbero essere utilizzati additivi possono essere inclusi, cioè agenti di dispersione come TiO₂ o polvere di diamante² per aumentare il segnale del sensore riducendo la trasparenza dell'optode. Anche coloranti aggiuntivi potrebbero essere utilizzati per migliorare l'intensità del segnale tramite trasferimento di energia⁴¹.

Per la fabbricazione di optodi planari, si consiglia di utilizzare uno spazio nel dispositivo di rivestimento del coltello di 75 - 120 m per produrre uno spessore finale dello strato del sensore di circa 7,5 a 12 m dopo l'evaporazione del solvente (circa il 10% dello spazio utilizzato), quando si utilizza la composizione del cocktail del sensore descritto. Questo è un buon compromesso tra l'intensità del segnale, che può essere modificato da un maggiore carico di tinture, o scegliendo indicatore e coloranti di riferimento di maggiore luminosità e tempo di risposta. Un aumento dello spessore dello strato comporta un aumento del tempo di risposta, poiché l'intervallo di tempo necessario all'analita per raggiungere un equilibrio termodinamico nello strato di rilevamento con il supporto circostante aumenta^{di 12}.

Gli optodi, come descritto qui, reagiscono ai cambiamenti di concentrazione di O₂ entro pochi secondi¹⁷ pur avendo un segnale di luminescenza sufficientemente forte. I rivestimenti dei sensori ultrasottili con tempi di risposta al secondo possono essere realizzati con spin-coating⁶. Se il supporto o il dispositivo di rivestimento del coltello non sono ben puliti, potrebbe causare strati di sensori inomogenei. Inoltre, quando il cocktail non è completamente omogeneo o applicato troppo rapidamente dopo la diffusione davanti al dispositivo di rivestimento un tale risultato indesiderato può essere osservato. Pertanto, potrebbe essere necessario un po 'di pratica per preparare optodi ottimali.

Il metodo può essere utilizzato per l'immagine di campioni che possono essere messi a stretto contatto con l'optode, come alcuni animali marini⁴², biofilm⁶ e suoli³¹ solo per citarne alcuni. Vi presentiamo una configurazione autonoma utilizzando un obiettivo, tuttavia, la fotocamera può essere facilmente accoppiata ad un microscopio per l'imaging chimico ad alta risoluzione⁴³.

Mentre l'imaging a vita di luminescenza basato su dominio temporale ha consentito la soppressione della fluorescenza di fondo²⁶, si tratta di un problema quando si utilizza il nuovo sistema di telecamere basato su dominio di frequenza⁸. Grazie all'acquisizione continua dell'immagine, questa fotocamera registrerà qualsiasi fluorescenza di fondo del campione che può essere eccitata dal LED selezionato ed emette nella finestra spettrale selezionata come definito dal filtro di emissione sull'obiettivo della fotocamera. Questo si tradurrà in una durata apparentemente inferiore e di conseguenza in false letture. Nel caso in cui si lavori con campioni con una significativa fluorescenza intrinseca sovrapposta all'eccitazione e all'emissione del sensore O_2, è essenziale applicare un isolamento ottico aggiuntivo sopra l'optode, ricoprendo uno strato aggiuntivo contenente il nero carbonio^2,17. Così, solo la luminescenza emessa dall'optode planare raggiungerà la fotocamera. Al fine di verificare la luminescenza di sfondo può essere presa un'immagine senza l'optode, che poi mostrerebbe esclusivamente la luminescenza intrinseca del campione. È anche possibile aggiungere agenti di dispersione come TiO₂ o polvere di diamante^2,44, al cocktail del sensore, per aumentare l'intensità della luminescenza del tinio indicatore. Tuttavia, questo può anche portare a più veloce foto sbiancamento e TiO₂ è un noto foto-catalizzatore, che può compromettere la fotostabilità di un colorante⁴¹. Un altro aspetto da considerare è la luce di fondo. Quando si immagina la durata della luminescenza, la luce di fondo deve essere evitata nel modo più efficiente possibile. Pertanto, questo metodo di imaging richiede che la configurazione sia posizionata in un ambiente scuro e qualsiasi sorgente luminosa esterna deve essere temporaneamente spenta durante l'acquisizione dell'immagine.

In sintesi, l'imaging a vita della luminescenza è un metodo di imaging chimico robusto che può essere adattato a molte applicazioni diverse. Questo protocollo (vedere la sezione 1 - 5) copre tutti i passaggi essenziali per generare un'immagine O₂ e utilizza il sistema di imaging a vita di luminosità del dominio di frequenza attualmente più flessibile, che può sostituire la fotocamera del dominio temporale interrotta per l'imaging 2D O₂ con optodi planari.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air pump with air stone and water pump	Local aquarium store
Chloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
DC4 silicone compound	Dow Corning GmbH	2793695
Gas mixer	Vögtlin Instruments GmbH	red-y compact meter GCM	This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices
Glass plates and aquaria	Local aquarium or hardware store
ImageJ Software	ImageJ		Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)
Knife-coating device	BYK-GARDNER GMBH byk.com	2021	This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.
LED lamp, Reflector PAR38	Megaman	MM17572
LED LEDHUB	Omicon Laserage, Germany		Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential
LOCTITE AA 3494	Henkel AG & Co. KGaA	NA	Acrylic-based instant adhesive
NIS Elements AR Software	Nikon Inc		Software package used for image acquisition
pco.flim	PCO AG, Germany		Frequency domain based luminescence lifetime camera
platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)	Frontier Scientific	PtT975	O2 indicator
polyethylene terephthalate (PET) foil	Goodfellow	320-992-72	Such foils might also be found from other providers and serve as solid support
Polystyrene (PS)	Sigma Aldrich	9003-53-6	Polymer matrix
Schott RG610 filter	www.uviroptics.com		Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective
Vinyl electrical tape	Scotch, Super 33+	NA
Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor	delivered with the camera		Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount