自由に泳ぐ魚における可動テトロデスによるニューロンの無線電気生理学的記録

要約

自由に泳ぐ金魚の脳からの細胞外神経信号を記録するための新しい無線技術が提示される。記録装置は、マイクロドライブ、ニューラルデータロガー、防水ケースの2つのテトロドで構成されています。データロガーとそのコネクタを除くすべての部品はカスタムメイドです。

要約

魚の行動を支配する神経機構はほとんど未知のままであるが、魚はすべての脊椎動物の大部分を占める。自由に動く魚から脳活動を記録する能力は、魚の行動の神経ベースの研究をかなり進めるだろう.さらに、脳内の記録位置の正確な制御は、魚の脳内の領域全体の協調神経活動を研究するために重要です。ここでは、自由に泳ぐ魚の脳から無線で記録する技術を提示し、記録場所の深さを制御する。このシステムは、マイクロドライブ制御テトロデスによって記録位置を調整できる新しい水互換インプラントに関連するニューラルロガーに基づいています。システムの機能は金魚のテレンセファロンからの記録によって示される。

概要

魚は脊椎動物の最大かつ最も多様なグループであり、他の脊椎動物と同様に、ナビゲート、社交、睡眠、狩猟などの複雑な認知能力を示しています。それにもかかわらず、魚の挙動を支配する神経機構は、ほとんどの部分が未知のままである。

過去数十年間、固定化された魚からの細胞外記録は、主に^行動1、2の神経基盤の異なる側面を調査するために実施されてきた。この技術は一部の感覚系に適しているが、固定化動物では不可能でない場合には神経行動の全スペクトルの調査は困難である。最初の進歩は、つながれた水泳^魚3、4のモートナー細胞からの記録に関与した。しかし、Mauthner細胞は不均衡に大きく、記録された作用電位振幅は、数mVと同じくらい高く行くことができ、記録を容易にする。その後、Canfieldら、^魚5のテレンセファロンから記録するためにテザー動物を使用する際の概念実証について説明した。魚からの神経活動を記録するためのもう一つの最近の技術は、カルシウムイメージングです(オルガーとデポラビエ^ハ6によるレビューを参照してください、およびVanwalleghem^ら7)。この技術は、皮膚と頭蓋骨が幼虫の段階で透明であるため、ゼブラフィッシュ幼虫で使用するために開発されました。ただし、この手法を使用して、開発の後の段階で複雑な動作を学習することはできません。

ここでは、自由に泳ぐ魚の脳から細胞外神経活動を記録する新しい技術を提示する。これは、Vinepinsky et al.⁸で説明されているプロトコルの修正バージョンです。主な革新は外科後の電極の位置を制御することを可能にするマイクロドライブの付加である。この技術は、マイクロドライブを介してニューラルデータロガーに接続されたテトロデスのセットを使用して、金魚の脳波から記録するために設計されています。全体のセットアップはワイヤレスで、魚の頭蓋骨に固定されています。システムの特定の重量は魚が自由に泳ぐことを可能にする小さい浮遊物を加えることによって水特有の重量に等しくなされる。

この手法は、信号をオンボード メモリ デバイスで増幅、デジタル化、および格納するニューラル データ ロガーの使用に基づいています。ロガー テレメトリ システムは、録画の開始と停止、およびビデオ カメラとの同期に使用されます。このプロトコルでは、マイクロドライブと一緒に防水ボックスに埋め込まれた16チャンネルニューラルロガーが使用されます。

マイクロドライブ・アセンブリーは、マイクロドライブ自体とマイクロドライブ・ハウジング (図 1A,B)の 2 つの主要コンポーネントから製造されます。ハウジングはマイクロドライブとテトロデスを保持し、頭蓋骨とロガーボックスの間のアンカーとしても機能します(図1C)。PVCロガーボックスは機械プロセスを使用して製造され、Oリングを使用して密封されています(図1E-G、補足図1、補足図2、補足図3(3D)図も参照)。一方の端で、インプラントの重量を補償し、浮力中性インプラントを魚に提供するために、ポリスチレンフォームの一部がロガーボックスに取り付けられています。プロトコルに記載されたマイクロドライブの構築は、Vandecasteele^ら9によって提示された手順に従い、マイクロドライブをハウジングに取り付ける変更を伴う(図1A)。すべての主要な手順が表示されます。

魚の頭蓋骨を調製するためのプロトコルに記載された手順は、Vinepinsky et^{al. 8}に提示されたものと同様であり、プロトコルで簡単に説明される。手術の翌日、魚は通常麻酔の効果から完全に回復し、行動実験の準備ができています。テトロードの位置は、マイクロドライブのネジを回すことによって調整できることに注意してください。ねじの全回転あたり300μmの間隔があり、目標の脳位置に達するまで75μmの進歩が推奨される。適切な脳アトラスは、対象の特定の脳領域をターゲットに相談する必要があります。魚がバッテリーまたはメモリカードの交換のために麻酔されるたびに電極インピーダンスをテストすることをお勧めします。

プロトコル

すべての手術手順は、動物福祉に関する地元の倫理委員会(例えば、IACUC)によって承認されなければなりません。

1. マイクロドライブハウジングの建設

1. ハウジングを構築するには、鋸を使用して19 mm x 29 mm x 1 mm プレートに幅 1 mm の真鍮板をカットします。エッジに垂直な長辺のそれぞれに 5.5 mm のスリットを 2 つカットし、各スリットが狭い側から 6.5 mm 離るようにします (図 2A)。
2. プライヤーを使用して、長辺のスリットの間の領域を内側に折りたたみ、下部を内側に折りたたみ、上側を外側に折りたたんでハウジングを取得します(図2B,C)。
3. 3mmドリルビットを使用して、マイクロドライブハウジングのネジの穴を作ります。
   注:これらの穴は後でハウジングをロガーボックスに取り付けるために使用されます(図2D)。
4. ハウジングの側面はんだ。
5. 細かい円形ファイルを使用して、ハウジングの下部に小さな、1.5 mm の半径、半円形のスリットを生成します(図 2E)。
   注:これは、電極を導くためにステンレス鋼管を挿入するために後で使用されます。
6. 1 mm ドリル ビットを使用して、テトロデス用のハウジングの背面に穴を開けます (図 2F)。
   注:ハウジングの 3D モデルは、補足住宅.stl ファイルにあります。

2. マイクロドライブの構築

1. カッターを使用して、1 行のオスのピン ヘッダー ストリップから 3 ピンの部分を分割します (図 1H)。ペンチを使用して、中央のピンを引き出します。
2. カッターを使用して、残りのピンを長さ 10 mm(ねじ長さより 2 mm 小さい)にカットします。もう 1 つの可能性は、より長いネジを使用することです(ステップ 2.4 を参照)。
3. 中央のピン穴を通して#65ドリルビットを使用して穴を開けます。00-99 タップを使用してスレッドをドリルします。
4. マイクロドライブと真鍮板(7.5mm x 2.5mm x 0.6 mm)を組み立てて、真鍮板がピンに触れとなるような。.最初の真鍮プレートを通してネジ(#00-90丸いヘッド、12 mm、真鍮)を挿入し、次にピンヘッダースレッドと2番目の真鍮プレートを通して挿入します。最後に、ネジにナットを置き、組み立てられたマイクロドライブを軽く締めます。
5. 真鍮板と一緒にピンをはんだ付けし、ナットをねじの先端ではんだ付けします。
6. マイクロドライブの真鍮板の側面の4点でマイクロドライブハウジングにマイクロドライブをはんだ付け。
7. 内径1.5mm、内径1.2mmのステンレス鋼管3mm長で長さ1本のステンレス鋼管を切り、鋭い端を避けるためにチューブの端を磨きます。
8. エポキシを使用して、マイクロドライブハウジングの底部にある小さな半円形スリットに6mmの長いチューブを接着します。3mm長いステンレス鋼をピンヘッダーに接着し、ハウジングに6mmの長いチューブを並べておきます。
9. 直径0.64mmの長さ5cmのシリコーンチューブセグメント2つと、直径0.250mmの5cm長いポリイミドチューブを1つカットします。
10. 2本のステンレス鋼管に3本のチューブを挿入します。シアノアクリレート接着剤を使用して、ピンヘッダーに取り付けられたステンレス鋼管にチューブを接着します。マイクロドライブを最後までねじ込み、2本の鋼管の上部と下部から余分なチューブを切断します。
    注:ハウジング付きのマイクロドライブを使用する準備ができました (図 1C)。

3. テトローデアレイの準備

1. 各テトロードに4つの電極を持つ2テトローデインプラントを作製するには、直径25μmのタングステンワイヤーのうち、長さ12cmの8本のワイヤーを用意し、Formvar絶縁を行います。
   注:同じ設計は4つのテトロデスを収容できる。
2. 16チャンネル電極インターフェースボード(EIB-16)PCB(材料表参照)のホルダーを顕微鏡下に置きます。
3. 柔らかい先端の間鍋とライターを使用して、炎を使用して片側の8本のワイヤーのそれぞれを取り除きます。
   注:これは、後で配線が PCB コネクタに正しく接続されるようにするためです。
4. EIB-16の穴の1つにワイヤーを押し込み、コーティングされた側面を穴に入れます。ピンを置き、ペンチを使用して押します。ピンと配線の未塗装側の間の抵抗を測定して、接続性を確認します。
   注:抵抗は数十オームの順序です。
5. 8 本のワイヤすべてで手順 3.4 を繰り返します。
6. 各ワイヤの端にダクト テープを使用して、4 本のワイヤの 2 つのグループをテープでまとめます。
   注:各グループは、テトローデを形成するために後で一緒に接着されます。
7. タングステンワイヤー1本1本を長さ12cm、直径50μmで切ります。EIB-16 接続の 1 つに接続します。
   注:このワイヤは、基準電極として機能します。
8. 記録ロガーの敷地となる直径75μmの長さ12cmの裸の銀線を2本切ります。EIB-16の接地接続に2本のワイヤをはんだ付けします。
9. EIB-16を電動旋回装置の上に持ち、4本のワイヤーの1つのグループのダクトテープ端を電動チューニング装置に置きます。時計回りに 130 回を適用し、その後に 20 回の反時計回りの回転を適用します。チアノアクリレート接着剤を塗布してテトローデを覆う。
10. 接着剤が治るのを待ちます。ダクトテープの近くでテトローデを切ります。
11. 手順 3.9 と 3.10 を 2 番目のテトロードで繰り返します。
    注:これにより、完成した 2 テトロードアレイが生成されます (図 1D)。

4. インプラントの組み立て

1. マイクロドライブをずっと下にねじ込みます。
2. 1 x 3Mプラス丸いヘッドネジを使用して、EIB-16をPVCプレートに取り付けます。
3. ソフトエンドピンセットを使用して、ロガーボックスカバーの前面にある穴からすべてのテトロドとワイヤを引き抜きます。
4. 2 x 6Mプラスフラットヘッドネジを使用して、PVCプレートをロガーボックスカバーに取り付けます。ロガーを EIB-16 に取り付けることができるように、EIB-16 コネクターを正しい方向に保ちます。EIB-16が所定の位置に固定されていることを確認し、記録された信号のモーションアーティファクトを回避します。
5. エポキシを使用して箱にワイヤーを密封します。一次シールは後で室温加硫(RTV)によって行われるので、できるだけ少なく適用してください。
6. 2mmネジを使用して、マイクロドライブハウジングをロガーボックスカバーに取り付けます。
7. テトロデスとすべてのワイヤーをマイクロドライブハウジングの背面の穴に通します。マイクロドライブ内の2本のシリコーンチューブにテトロドを通します。マイクロドライブ内のポリイミドチューブを通して50μmタングステン線を通します。
8. チューブの上端にシアノアクリレート接着剤を塗布してテトロデスとワイヤーをチューブに接着し、動きがマイクロドライブと一致していることを確認します。マイクロドライブを上部までねじ込みます。
9. 動きを防ぐために、マイクロドライブハウジング内の露出したテトロードとワイヤに軟質石油(材料表を参照)を適用します。
10. 加熱されたカミソリの刃を使用して、12ミリメートルx 14.5ミリメートルペトリ皿の底窓をカットします。エポキシでマイクロドライブハウジングの前面に窓を取り付けます。アース線は窓の外に置いておいてください。
11. ロガーボックスカバーとマイクロドライブハウジングの間の露出したテトロドとワイヤーにRTVコーティングを適用します。
12. RTVが硬化した後、中に小さな重量で箱を閉め、箱に水漏れがないことを確認するために一晩水に沈みます。
13. 鋭いはさみを使用して、テトロデスとリファレンスワイヤーを目的の長さにカットします。
14. マークされた押し出しポリスチレンフォーム(「材料表」を参照)をボックスに取り付けます。水浴に水没したときに浮力のバランスが取るように、そのサイズを調整します。
15. 白金ブラック溶液にテトロード先端を浸し、直接電流(-0.2 μA)を使用して電極をコーティングし、必要に応じて電極のインピーダンスを設定します。コーティングおよびインピーダンス測定には、マルチ電極インピーダンステスター(材料表参照)を使用します。
    注:金魚のパリウムでは、40kOhmの値が最適です。用途に応じて、電極インピーダンスは、白金ブラック^{コーティング10、11}を修正することによって調整することができる。

5. 麻酔準備 - 1% MS-222 原液

注意:麻酔製剤は、発がん性物質である粉末MS-222の使用を含む。したがって、ステップ5.2と5.3は、手袋を使用して化学フードで行う必要があります。

1. 100 mL を超えるチューブに 100 mL の水を追加します。
2. 化学フードに、使い捨て重みプレートをスケールに置きます。へらを使ってMS-222粉末を1g加え、粉末をチューブに加えます。
3. チューブをよく振りなさい。
   注:液体の形で、MS-222は手袋を着用する化学フードの外で使用することができるが、マスクを要求しない。
4. 使い捨て重み板をスケールに置きます。スパチュラを使用して重炭酸ナトリウムを2g加え、粉末をチューブに加えます。チューブをよく振りなさい。

6. 魚の頭蓋骨の準備

注:この段階で、魚はインプラント手術の準備ができています。手術の前に、すべてのコンポーネントと供給が適切な手順で殺菌されていることを確認してください。このステップでは、水外のU字型魚ホルダーが必要です。このプロトコルでは、長い金魚の尾に15 cmの頭部に合うアルミニウムホルダーが使用される。このシステムは、酸素化された水でエラを浸透しながら、水から魚を保持します。詳細については、ヴィネピンスキーら⁸を参照してください。

1. 魚が眠るまで0.02%MS-222水浴に20分間置きます。
2. 滅菌手袋を使用して、水から魚を取り出し、ホルダーに入れます。
   注:魚を浸透させる酸素化された水は、0.02%の濃度でMS-222を含み、手術中に魚が麻酔されたままになるようにします。
3. 滅菌スパチュラを使用して、10分間手術のために指定された場所の上の皮膚にリドカイン5%ペーストを適用し、その後、リドカインを除去します。
   注:特定の脳領域をターゲットに適切な脳アトラスを相談します。.
4. 滅菌15ブレードメスを使用して、インプラント領域の頭蓋骨の上の皮膚を取り除きます。
5. 0.7mmドリルビットの歯科ドリルを使用して、頭蓋骨に4つの穴を開けます。各穴に1mmネジ(長さ3mm)を挿入し、ネジを挿入する直前に穴にシアノアクリレート接着剤を塗布します。
6. 歯科用バーニッシャーを使用して、ネジと露出した頭蓋骨の周囲に歯科用セメントを塗布します。
7. 歯科ドリルを使用して、目的の脳領域の上の頭蓋骨に直径5mmの穴を作ります。頭蓋骨と脳の間の脂肪組織を取り除き、細かいピンセットと軟部組織紙を使用して脳領域ターゲットを露出させます。頭蓋骨の下の大きな血管に損傷を与えないように注意してください。
   注:この段階の終わりまでに、魚は調査を移植するために準備される。ここでは、このプロトコルに固有の主な手順についてのみ説明します。いくつかの術後処置(動物の健康と手術ツールおよび領域の殺菌に関する詳細な文書など)は、魚や小動物を含むすべての手術に適用可能であるため、提示または議論されない。

7. プローブの埋め込み

注:プロトコルの最後のステップを完了するには、インプラントを脳に挿入しながら所定の位置に保持できるマニピュレータが必要です。

1. マニピュレータを使用して、魚の脳を指し示すテトロデスでロガーボックスカバーを保持します。
2. テトロデスが脳に下がるとき、参照が脳の外にとどまるように参照電極を曲げます。
3. 頭蓋骨に収まるように敷地を切り取ります。必要に応じて、1 本のアース 線を頭蓋骨ねじの 1 つに接続します。
4. マイクロドライブハウジングの下部が頭蓋骨の近くにある間に電極が脳に挿入されるようにインプラントを下げます。
5. ハウジングと最も近い頭蓋骨ねじの間に少量の歯科用セメントを塗布して、インプラントを頭蓋骨に取り付けます。
6. 歯科セメントの最初の部分が治った後、歯科用セメントを適用し、頭蓋骨と露出した頭蓋骨全体の上の穴を閉じます。
   注:通常、露出した頭蓋骨全体をカバーするために、歯科セメントアプリケーションの数ラウンドが必要です。
7. ボックスにロガーとバッテリーを取り付け、すべてのネジでボックスを密封します。
8. 実験に使用する魚の種類に応じて抗生物質と局所鎮痛剤を適用します。
9. 魚が目を覚ますまで、新鮮な水で魚のエラを洗い流します。ホルダーから魚を取り出し、家庭用タンクに戻します。
   注:魚は手術後60分以内に完全に回収される。
10. 魚がインプラントで自由に泳げであることを確認してください (図 3、補足ビデオ 1)。必要に応じて、魚が容易にバランスを取ることができるように、ロガーボックスの上に押し出されたポリスチレンフォームのサイズを再調整します。

結果

記録セッション中、金魚は、その脳波の神経活動が記録されている間、正方形の水槽で自由に泳いでいました。これらの実験の目的は、単一細胞の神経活動が魚の行動をどのように決定するかを研究するであった。そのためには、記録されたデータでスパイク活動を特定する必要がありました。脳活動は記録されている間、31,250 Hzでデジタル化され、ハイパスはデー?...

ディスカッション

このプロトコルは、自由に泳ぐ金魚のテレンセファロンにテトローデ配列を埋め込む際に必要なステップを詳しく説明します。この技術は、脳内のテトロード位置を調整できるマイクロドライブと共に、最大16チャンネルから取得した信号を増幅して記録するニューラルロガーを実装します。マイクロドライブは記録を最大限に活用するために脳の位置を調節することを可能にする。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm round drill bits			Compatible with the drill.
15-blade Scalpel	Sigma-Aldrich
16 channel PCB board	Neurlynx	EIB-16
1X3M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
1X3M phillips round head screws			Stainless steel. Any type.
27 cm X 19 cm X 1 mm brass plate			See Figure 2
2X6M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
3140 RTV coating	Dow Crowning	2767996
75 µm Silver wire	A-M Systems
Brass machine screws #00-90		947-1006
Brass plates 7.5mm X 2.5mm X 0.6mm			A 3D drawing is provided. See supplementary 1
Coated Tungsten wire 25µm	California Fine Wire Company	5000160	Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000)
Coated Tungsten wire 50µm	A-M Systems	795500	Can be replaced with any other wire with low impedance
Cyanoacrilic glue
Dental Burnisher	ComDent UK		Any small sterille stainless-still tool will do.
Dental cement - GCFujiPLUS	GC	431011	Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other.
Dental drill or nail polish drill			Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement.
Drill bit #65		947-65
Fast curing epoxy			Any 5 minutes curing epoxy can be used here.
Logger box with O-ring sealing			A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger.
Motorized turning device			Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means.
Mouselog-16 Neural logger	Deuteron Technologies Ltd		There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam
MS-222	Sigma Aldrich	E10521	Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98%
Nano-Z plating	White Matter LLC		The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics.
PCB pins	Neurlynx	Neuralynx EIB Pins
Polymide tubing 250µm	A-M Systems	822000
Rechargable battery			3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time.
Silicone tubing 0.64 mm	A-M Systems	806100
Stainless steel 1.5 mm	A-M Systems	846000
Sudium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S9625
Tap #00-90		947-1301
Vaseline			Any type of soft petroleum skin protectant can be used here.