Беспроводная электрофизиологическая запись нейронов movable Tetrodes в Свободно плавающих рыб

Резюме

Представлен новый беспроводной метод записи внеклеточных нервных сигналов из мозга свободно плавающей золотой рыбки. Записывающее устройство состоит из двух тетродов, микропривода, регистратора нейронных данных и водонепроницаемого корпуса. Все детали изготовлены на заказ, за исключением регистратора данных и его разъема.

Аннотация

Нейронные механизмы, регулирующие поведение рыб, остаются в основном неизвестными, хотя рыбы составляют большинство всех позвоночных. Способность записывать активность мозга от свободно движущихся рыб будет заранее исследования на нервной основе поведения рыбы значительно. Кроме того, точный контроль места записи в головном мозге имеет решающее значение для изучения скоординированной нейронной активности в различных регионах в рыбьем мозге. Здесь мы представляем технику, которая записывает беспроводной из мозга свободно плавающих рыб, контролируя глубину места записи. Система основана на нейронном регистраторе, связанном с новым водносовместимым имплантатом, который может регулировать местоположение записи с помощью тетродов, управляемых микроприводом. Возможности системы иллюстрируются с помощью записей из теленцефалона золотой рыбки.

Введение

Рыбы являются самой большой и разнообразной группой позвоночных, и, как и другие позвоночные, они обладают сложными когнитивными способностями, такими как навигация, общение, сон, охота и т.д. Тем не менее, нейронные механизмы, регулирующие поведение рыб, по большей части остаются неизвестными.

В последние несколько десятилетий внеклеточные записи из обездвиженых рыб в первую очередь были реализованы для изучения различных аспектов нейронной основы поведения^1,2. Хотя этот метод подходит для некоторых сенсорных систем, исследование всего спектра нервной основы поведения трудно, если не невозможно в обездвиженные животные. Первые достижения включали запись из клеток Mauthner привязанных плавающих рыб^3,4. Тем не менее, клетки Маутнера непропорционально большие, и записанные потенциальные амплитуды действия, которые могут достигать нескольких м.В., облегчают запись. Позже, Canfield и др. описал доказательство концепции при использовании привязанного животного для записи из теленцефалона рыбы⁵. Другой недавний метод для записи нейронной активности от рыбы является изображения кальция (см. отзывы Оргер и де Polavieja⁶, и Vanwalleghem и др.⁷). Этот метод был разработан для использования с личинками зебры, потому что кожа и череп прозрачны во время личиночной стадии. Однако этот метод не может быть использован для изучения сложного поведения на более поздних стадиях разработки.

Здесь мы представляем новую технику для записи внеклеточной нервной активности из мозга свободно плавающих рыб. Это модифицированная версия протокола, описанная в Vinepinsky et al.⁸. Основным нововведением является добавление микропривода, который позволяет контролировать положение электродов после операции. Техника предназначена для записи из теленефалиона золотой рыбки с использованием набора тетродов, которые подключены к регистратору нейронных данных с помощью микропривода. Вся установка беспроводной и закреплены на черепе рыбы. Специфический вес системы выравнивается с водным весом, добавляя небольшой поплавок, который позволяет рыбе свободно плавать.

Методика основана на использовании регистратора нейронных данных, который усиливает, оцифровывает и хранит сигнал в бортовом устройстве памяти. Телеметрическая система регистратора используется для запуска и остановки записей, а также для синхронизации с видеокамерой. В этом протоколе используется 16-канальный нейронный регистратор, встроенный в водонепроницаемую коробку вместе с микроприводом.

Сборка микропривода изготовлена из двух основных компонентов: самого микропривода и корпуса микропривода(рисунок 1A,B). Корпус держит микропривод и тетроды, а также выступает в качестве якоря между черепом и коробкой регистратора(Рисунок 1C). Коробка регистратора ПВХ изготовлена с помощью машинного процесса и герметична с помощью O-кольца(рисунок 1E-G, см. также Дополнительную диаграмму 1, Дополнительная фигура 2, и Дополнительная рисунок 3 для трехмерной диаграммы 3D). С одной из концов, кусок полистирола пены крепится к коробке регистратора, чтобы компенсировать вес имплантата и обеспечить рыбу с плавучести нейтральный имплантат. Конструкция микропривода, описанная в протоколе, соответствует процедуре, представленной Vandecasteele et al.⁹ с модификацией для присоединения микропривода к корпусу(рисунок 1А). Представлены все основные шаги.

Процедура, описанная в протоколе подготовки черепа рыбы, аналогична процедуре, представленной в Vinepinsky et al.^8, и кратко описана в протоколе. На следующий день после операции, рыбы, как правило, полностью оправился от последствий анестезии и готовы к поведенческим экспериментам. Обратите внимание, что расположение тетроде может быть скорректировано путем поворота микроприводного винта. Винт имеет интервал 300 мкм на полное вращение и продвижение 75 мкм рекомендуется до тех пор, пока целевой расположение мозга не будет достигнуто. Соответствующий атлас мозга следует консультироваться с целью конкретной области мозга, представляющих интерес. Целесообразно испытать электрод impedance каждый раз, когда рыба под анестетом для замены батареи или карты памяти.

протокол

Все хирургические процедуры должны быть одобрены местными комитетами по этике по защите животных (например, IACUC).

1. Строительство микроприводного жилья

1. Чтобы построить корпус, вырезать 1 мм шириной латунной пластины в 19 мм х 29 мм х 1 мм пластины с помощью пилы. Вырежьте две 5,5 мм прорези на каждой из длинных сторон перпендикулярно краю, так что каждая щель 6,5 мм от узких сторон(рисунок 2A).
2. Используя плоскогубцы, сложите область между прорезями на длинных сторонах внутрь, затем сложите нижнюю часть внутрь и верхнюю сторону наружу, чтобы получить корпус(рисунок 2B,C).
3. Используя 3 мм сверло бит, сделать отверстия для винтов в микроприводе корпуса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти отверстия будут использованы позже, чтобы прикрепить корпус к коробке регистратора(Рисунок 2D).
4. Солдер стороны жилья.
5. Используя тонкий круговой файл, генерировать небольшой, 1,5 мм в радиусе, полукруглой щели в нижней части корпуса(рисунок 2E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет использоваться позже, чтобы вставить трубку из нержавеющей стали для руководства электродов.
6. Используйте 1 мм сверло бит, чтобы сделать отверстие в задней части корпуса для тетродов(Рисунок 2F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-модель жилья содержится в дополнительном корпусе.

2. Строительство микропривода

1. Используя резак, разорвать три-контактный кусок от одного ряда мужской заголовок полосы(рисунок 1H). Используя плоскогубцы, вытащите средний штифт.
2. Используя резак, вырезать оставшиеся булавки до 10 мм в длину (2 мм меньше, чем длина винта). Другая возможность заключается в использовании более длинного винта (см. шаг 2.4).
3. Просверлите отверстие с помощью #65 сверла через среднее отверстие штыря. Просверлите поток с помощью крана 00–99.
4. Соберите микропривод и латунные пластины (7,5 мм х 2,5 мм х 0,6 мм, см. Дополнительную рис учку 4)так, чтобы латунные пластины касались булавок. Вставьте винт (#00-90 круглая головка, 12 мм, латунь) через первую латунную пластину, затем через нить заголовок и вторую латунную пластину. Наконец, поместите гайку на винт и аккуратно затяните собранный микропривод.
5. Приспойка булавки вместе с латунными пластинами, и гайка с кончиком винта.
6. Приспойка микроприводв в микропривод корпуса в четырех точках по бокам микропривода латунных пластин.
7. Вырезать одну трубку из нержавеющей стали длиной 6 мм с внутренним диаметром 1,5 мм, а другой трубкой из нержавеющей стали длиной 3 мм с внутренним диаметром 1,2 мм. Польский концы труб, чтобы избежать резких концов.
8. Клей трубки длиной 6 мм к небольшой полукруглой щели в нижней части корпуса микропривода с помощью эпоксидной смолы. Клей 3 мм длиной из нержавеющей стали в контактный заголовок, выстроились с 6 мм длиной трубки на корпусе.
9. Вырезать два сегмента силиконовой трубки длиной 5 см диаметром 0,64 мм и одну пятисантиметровую полиимидную трубку диаметром 0,250 мм.
10. Вставьте три трубки в две трубки из нержавеющей стали. Клей трубки из нержавеющей стали трубки прилагается к штырь заголовок с помощью клея цианоакрилат. Винт микропривод атакжем вверх и отрезать избыток труб от верхней и нижней части двух стальных труб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микропривод с корпусом теперь готов к использованию(рисунок 1C).

3. Подготовка тетродейской решетки

1. Чтобы изготовить имплантат с двумя тетродеями с четырьмя электродами на каждом тетроде, приготовьте восемь проводов длиной 12 см, Formvar изолирован, из 25 мкм диаметром вольфрамовой проволоки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Такая же конструкция может вместить четыре тетрода.
2. Поместите под микроскопом держатель для 16-канального электродного интерфейса (EIB-16) PCB (см. Таблица материалов).
3. Используя мягкий наконечником пинцета и зажигалку, удалить покрытие от каждого из восьми проводов с одной стороны, используя пламя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо для того, чтобы провод был должным образом подключен к разъему PCB позже.
4. Нажмите проволоку в одно из отверстий в ЕИБ-16 с покрытием стороны в отверстие. Поместите булавку и нажмите его с помощью плоскогубцев. Проверьте подключение, измерив сопротивление между штифтом и непокрытой стороной провода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сопротивление находится на порядок десятков Ohms.
5. Повторите шаг 3.4 со всеми восемью проводами.
6. Лента две группы из четырех проводов вместе с помощью клейкой лентой в конце каждого провода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая группа будет склеена позже, чтобы сформировать тетрод.
7. Вырезать один кусок вольфрама проволоки 12 см в длину с диаметром 50 мкм. Подключите его к одному из соединений ЕИБ-16.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот провод будет служить эталонный электрод.
8. Вырезать две голые серебряные провода 12 см в длину с диаметром 75 мкм, которые послужат основанием для записи регистратора. Солдер два провода к наземному соединению в ЕИБ-16.
9. Держите EIB-16 над моторизованным поворотным устройством и поместите конец клейкой ленты одной группы из четырех проводов на моторизованном тюнинговочном устройстве. Нанесите 130 раундов по часовой стрелке с последующим 20 ротациями против часовой стрелки. Нанесите цианоакрилатный клей, чтобы покрыть тетрод.
10. Подождите, пока клей вылечится. Вырезать тетрод близко к клейкой лентой.
11. Повторите шаги 3.9 и 3.10 со вторым тетрод.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это производит готовый двухтетодный массив(рисунок 1D).

4. Сборка имплантата

1. Винт микропривод авнизу вниз.
2. Используя круглые головные винты 1 x 3M Phillips, прикрепите EIB-16 к пластине из ПВХ.
3. Используя мягкие пинцеты конца, вытяните все тетроды и провода через отверстие в передней части крышки коробки logger.
4. Используя плоские головные винты 2 x 6M Phillips, прикрепите пластину из ПВХ к крышке ящика для регистраторов. Держите разъем ЕИБ-16 в правильной ориентации, чтобы регистратор мог быть установлен на EIB-16. Убедитесь, что EIB-16 фиксируется на месте, чтобы избежать артефактов движения в записанном сигнале.
5. Печать проводов в коробку с помощью эпоксидной смолы. Применить как можно меньше, потому что первичное уплотнение будет сделано по комнатной температуры вулканизации (RTV) позже.
6. Прикрепите корпус микропривода к крышке ящика для регистраторов с помощью 2-мм винтов.
7. Нить тетродов и все провода через отверстие в задней части корпуса микропривода. Нить тетродо в двух силиконовых труб в микроприводе. Нить 50 мкм вольфрама провода через полиимидную трубку в микродрайве.
8. Клей тетродов и проводов к их трубам, применяя цианоакрилат клей в верхнем конце труб, чтобы обеспечить движение согласуется с микроприводом. Винт микропривод атакжем до самого верха.
9. Применить мягкую нефть (см. Таблица материалов) на подвергаются тетрод и провода внутри корпуса микропривода, чтобы предотвратить движение.
10. Вырежьте 12 мм х 14,5 мм Петри блюдо нижнее окно с помощью нагретого лезвия бритвы. Прикрепите окно к передней части корпуса микропривода с эпоксидной смолой. Держите наземные провода за окном.
11. Нанесите покрытие RTV на открытые тетроды и провода между крышкой ящика для регистраторов и корпусом микропривода.
12. После RTV вылечить, закрыть коробку с небольшим весом внутри, и погрузиться в воду на ночь, чтобы убедиться, что нет утечки воды в коробку.
13. Вырежьте тетроды и эталонную проволоку до нужной длины с помощью острых ножниц.
14. Прикрепите к коробке маркированную экструдированную пену полистирола (см. таблицу материалов). Отрегулируйте его размер, чтобы его плавучесть была сбалансирована при погружении в водяную ванну.
15. Опустите наконечники тетрода в платиновый черный раствор и используйте прямой ток (-0,2 зА), чтобы покрыть электроды и установить импедацию электродов по желанию. Используйте мультиэлектродный тестер impedance (см. Таблица материалов)для измерения покрытия и impedance.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В паллиуме золотая рыбка, значение 40 kOhm лучше. В зависимости от применения, электрод impedance может быть отрегулирован путем изменения платинового черного покрытия^10,11.

5. Препарат анестезии - 1% МС-222 Stock Solution

ПРЕДЕКТО: Препарат анестезии включает в себя использование порошкообразного МС-222, канцерогена. Таким образом, шаги 5.2 и 5.3 должны быть сделаны в химическом капюшоне с помощью перчаток.

1. Добавьте 100 мл воды в трубку, которая может содержать более 100 мл.
2. В химический капот, поместите одноразовые пластины взвешивания на шкале. Добавьте 1 г порошка MS-222 с помощью шпателя, затем добавьте порошок в трубку.
3. Встряхните трубку хорошо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В жидкой форме, MS-222 может быть использован вне химического капота носить перчатки, но не требует маски.
4. Поместите одноразовую пластину для взвешивания по шкале. Добавьте 2 г бикарбоната натрия с помощью шпателя, затем добавьте порошок в трубку. Встряхните трубку хорошо.

6. Подготовка черепа рыбы

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе рыба готова к операции по имплантации. Перед операцией убедитесь, что все компоненты и материалы были стерилизованы соответствующими процедурами. Для этого шага, из воды U-образный держатель рыбы не требуется. В этом протоколе, алюминиевый держатель, который подходит 15 см головы до хвоста длинной золотой рыбки используется. Эта система держит рыбу из воды, в то время как пронизывание жабры с кислородом воды. Подробности см. Винепинский и др.⁸.

1. Поместите рыбу в 0,02% модной ванны MS-222 в течение 20 минут, пока рыба не заснет.
2. Используя стерильные перчатки, возьмите рыбу из воды и поместите ее в держатель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кислородная вода, пронизаваемая рыбой, содержит МС-222 с концентрацией 0,02%, так что рыба остается под обезболной во время операции.
3. Используя стерильный шпатель, нанесите лидокаин 5% пасты на кожу выше назначенного места для операции в течение 10 минут, затем удалите лидокаин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проконсультируйтесь с соответствующим атласом мозга, чтобы ориентироваться на конкретную область мозга.
4. Используя стерильный 15 лезвия скальпель, удалить кожу над черепом в области имплантата.
5. Используя стоматологическую дрель с 0,7 мм сверло битов, просверлите 4 отверстия в черепе. Вставьте 1 мм винт (3 мм в длину) в каждое отверстие и применить cyanoacrylate клей на отверстия прямо перед вставкой винта.
6. Используя зубную ожоговую часть, нанесите зубной цемент на винты и на периферию открытых черепа.
7. Используя стоматологическую дрель, сделайте отверстие диаметром 5 мм в черепе над областью интереса мозга. Удалить жировой ткани между черепом и мозгом и подвергать цель области мозга с помощью тонкой пинцетом и мягкой бумаги ткани. Будьте осторожны, чтобы не повредить большие кровеносные сосуды под черепом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: К концу этого этапа, рыба готова имплантировать зонд. Здесь описаны только основные шаги, характерные для этого протокола. Несколько послеоперационных процедур (таких как подробная документация о здоровье животного и стерилизации хирургических инструментов и области) не представлены или обсуждены, поскольку они применимы ко всем операциям с рыбой или мелкими животными.

7. Имплантация зонда

ПРИМЕЧАНИЕ: Для завершения заключительного шага в протоколе необходим манипулятор, который может удерживать имплантат на месте, пока он вставляется в мозг.

1. Используйте манипулятор, чтобы держать крышку ящика с тетродами, указывающими вниз к рыбьему мозгу.
2. Согните эталонный электрод таким образом, что, когда тетроды опускаются в мозг, эталон остается вне мозга.
3. Вырезать основания так, что они вписываются в череп. Дополнительно соедините один грунтовый провод с одним из винтов черепа.
4. Нижняя имплантат так, что электроды вставляются в мозг в то время как нижняя часть корпуса микропривода рядом с черепом.
5. Начните прикреплять имплантат к черепу, применяя небольшое количество зубного цемента между корпусом и ближайшим черепным винтом.
6. После того, как первая часть зубного цемента вылечивается, наносите зубной цемент и закрывают отверстие над черепом и весь открытый череп.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно несколько раундов стоматологического цемента приложений, необходимых для того, чтобы покрыть весь открытый череп.
7. Установите регистратор и батарею в коробку и запечатать коробку со всеми винтами.
8. Применяют антибиотики и местные обезболивающие в зависимости от типа рыбы, используемой для экспериментов.
9. Промыть жабры рыбы с пресной водой, пока рыба не начнет просыпаться. Удалите рыбу из держателя и поместите его обратно в свой домашний резервуар.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рыба полностью восстанавливается в течение 60 минут после операции.
10. Убедитесь, что рыба может свободно плавать с имплантатом(Рисунок 3, Дополнительное видео 1). При необходимости спорите размер экструдированной пены полистирола над коробкой регистратора так, чтобы рыба легко балансировала.

Результаты

Во время записи сессии золотая рыбка свободно плавала в квадратном резервуаре для воды, в то время как нейронная активность в ее теленефалионе была записана. Целью этих экспериментов было изучение того, как нейронная активность одиночных клеток определяет поведение ?...

Обсуждение

В этом протоколе подробно описаны шаги, связанные с вжививанием тетроде массива в теленцефалон свободно плавающей золотой рыбки. Этот метод реализует нейронный регистратор, который усиливает и записывает сигналы, полученные из до 16 каналов вместе с микроприводом, который может регули...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm round drill bits			Compatible with the drill.
15-blade Scalpel	Sigma-Aldrich
16 channel PCB board	Neurlynx	EIB-16
1X3M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
1X3M phillips round head screws			Stainless steel. Any type.
27 cm X 19 cm X 1 mm brass plate			See Figure 2
2X6M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
3140 RTV coating	Dow Crowning	2767996
75 µm Silver wire	A-M Systems
Brass machine screws #00-90		947-1006
Brass plates 7.5mm X 2.5mm X 0.6mm			A 3D drawing is provided. See supplementary 1
Coated Tungsten wire 25µm	California Fine Wire Company	5000160	Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000)
Coated Tungsten wire 50µm	A-M Systems	795500	Can be replaced with any other wire with low impedance
Cyanoacrilic glue
Dental Burnisher	ComDent UK		Any small sterille stainless-still tool will do.
Dental cement - GCFujiPLUS	GC	431011	Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other.
Dental drill or nail polish drill			Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement.
Drill bit #65		947-65
Fast curing epoxy			Any 5 minutes curing epoxy can be used here.
Logger box with O-ring sealing			A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger.
Motorized turning device			Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means.
Mouselog-16 Neural logger	Deuteron Technologies Ltd		There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam
MS-222	Sigma Aldrich	E10521	Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98%
Nano-Z plating	White Matter LLC		The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics.
PCB pins	Neurlynx	Neuralynx EIB Pins
Polymide tubing 250µm	A-M Systems	822000
Rechargable battery			3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time.
Silicone tubing 0.64 mm	A-M Systems	806100
Stainless steel 1.5 mm	A-M Systems	846000
Sudium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S9625
Tap #00-90		947-1301
Vaseline			Any type of soft petroleum skin protectant can be used here.