Enregistrement électrophysiologique sans fil des neurones par les tetrodes mobiles dans les poissons nageant librement

Résumé

Une nouvelle technique sans fil pour enregistrer les signaux neuronaux extracellulaires du cerveau des poissons rouges nageant librement est présentée. Le dispositif d'enregistrement est composé de deux tétrodes, un microdrive, un enregistreur de données neuronales et un boîtier étanche. Toutes les pièces sont faites sur mesure, sauf pour l'enregistreur de données et son connecteur.

Résumé

Les mécanismes neuronaux régissant le comportement des poissons restent pour la plupart inconnus, bien que les poissons constituent la majorité de tous les vertébrés. La capacité d'enregistrer l'activité cérébrale des poissons en mouvement libre ferait avancer la recherche sur la base neuronale du comportement des poissons considérablement. En outre, le contrôle précis de l'emplacement d'enregistrement dans le cerveau est essentiel à l'étude de l'activité neuronale coordonnée à travers les régions dans le cerveau des poissons. Ici, nous présentons une technique qui enregistre sans fil à partir du cerveau des poissons nageant librement tout en contrôlant la profondeur de l'emplacement d'enregistrement. Le système est basé sur un enregistreur neuronal associé à un nouvel implant compatible avec l'eau qui peut ajuster l'emplacement de l'enregistrement par des tétrodes contrôlées par micropropulsion. Les capacités du système sont illustrées par des enregistrements du ténencéphale du poisson rouge.

Introduction

Les poissons sont le groupe de vertébrés le plus grand et le plus diversifié, et comme les autres vertébrés, ils présentent des capacités cognitives complexes telles que la navigation, la socialisation, le sommeil, la chasse, etc. Néanmoins, les mécanismes neuronaux régissant le comportement des poissons restent pour la plupart inconnus.

Au cours des dernières décennies, les enregistrements extracellulaires de poissons immobilisés ont principalement été mis en œuvre pour étudier différents aspects de la base neuronale du comportement^1,2. Bien que cette technique soit appropriée pour certains systèmes sensoriels, l'étude du spectre complet de la base neuronale du comportement est difficile, voire impossible chez les animaux immobilisés. Les premières avancées ont consisté à enregistrer à partir des cellules Mauthner des poissons nageurs attachés^3,4. Cependant, les cellules Mauthner sont disproportionnellement grandes et les amplitudes potentielles d'action enregistrées, qui peuvent aller aussi haut que quelques mV, facilitent l'enregistrement. Plus tard, Canfield et coll. ont décrit une preuve de concept lors de l'utilisation d'un animal attaché pour enregistrer à partir du téencéphale du poisson⁵. Une autre technique récente pour enregistrer l'activité neuronale des poissons est l'imagerie calcique (voir les commentaires de Orger et de Polavieja⁶, et Vanwalleghem et al.,⁷). Cette technique a été développée pour une utilisation avec des larves de poissons zèbres parce que la peau et le crâne sont transparents pendant le stade larvaire. Cependant, cette technique ne peut pas être utilisée pour étudier des comportements complexes dans les stades ultérieurs du développement.

Ici, nous présentons une nouvelle technique pour enregistrer l'activité neuronale extracellulaire du cerveau des poissons nageant librement. Il s'agit d'une version modifiée du protocole décrit dans Vinepinsky et al.⁸. La principale innovation est l'ajout d'un microdrive qui permet de contrôler la position des électrodes après la chirurgie. La technique est conçue pour l'enregistrement à partir du ténencéphale de poissons rouges à l'aide d'un ensemble de tétrodes qui sont connectés à un enregistreur de données neuronales via un microdrive. L'ensemble de la configuration est sans fil et ancré au crâne du poisson. Le poids spécifique du système est égalisé au poids spécifique à l'eau en ajoutant un petit flotteur qui permet aux poissons de nager librement.

La technique est basée sur l'utilisation d'un enregistreur de données neuronales qui amplifie, numérise et stocke le signal dans un dispositif de mémoire embarqué. Le système de télémétrie des enregistreurs est utilisé pour démarrer et arrêter les enregistrements, et pour la synchronisation avec la caméra vidéo. Dans ce protocole, un enregistreur neuronal de 16 canaux est utilisé, intégré dans une boîte imperméable à l'eau avec le microdrive.

L'assemblage de micropropulsion est fabriqué à partir de deux composants principaux : le microdrive lui-même et le boîtier de micropropulsion (Figure 1A,B). Le boîtier contient le microdrive et les tétrodes, et agit également comme l'ancre entre le crâne et la boîte de bûcherons (Figure 1C). La boîte d'enregistreur en PVC est fabriquée à l'aide d'un procédé machine et est scellée à l'aide d'un anneau O(figure 1E-G, voir aussi La figure supplémentaire 1, la figure 2 supplémentaireet la figure 3 supplémentaire pour un diagramme tridimensionnel [3D]). À une extrémité, un morceau de mousse de polystyrène est fixé à la boîte d'enregistreur pour compenser le poids de l'implant et fournir au poisson un implant neutre en flottabilité. La construction du microdrive décrit dans le protocole suit la procédure présentée par Vandecasteele et al.9 avec une modification pour attacher le microdrive au boîtier (Figure 1A). Toutes les étapes majeures sont présentées.

La procédure décrite dans le protocole pour préparer le crâne de poisson est semblable à celle présentée dans Vinepinsky et autres⁸ et est décrite brièvement dans le protocole. Un jour après la chirurgie, les poissons sont normalement complètement récupérés des effets de l'anesthésie et sont prêts pour les expériences comportementales. Notez que l'emplacement du tétrode peut être ajusté en tournant la vis microdrive. La vis a un espacement de 300 m par rotation complète et un avancement de 75 m est recommandé jusqu'à ce que l'emplacement du cerveau cible soit atteint. Un atlas cérébral approprié devrait être consulté pour cibler la région spécifique du cerveau d'intérêt. Il est conseillé de tester l'entrave à l'électrode chaque fois que le poisson est anesthésié pour le remplacement de la batterie ou de la carte mémoire.

Protocole

Toutes les interventions chirurgicales doivent être approuvées par les comités d'éthique locaux sur le bien-être animal (p. ex., l'IACUC).

1. Construction du microdrive Housing

1. Pour construire le boîtier, couper une plaque en laiton de 1 mm de large dans une plaque de 19 mm x 29 mm x 1 mm à l'aide d'une scie. Couper deux fentes de 5,5 mm sur chacun des longs côtés perpendiculaires au bord, de sorte que chaque fente est de 6,5 mm des côtés étroits (Figure 2A).
2. À l'aide de pinces, pliez la zone entre les fentes sur les longs côtés vers l'intérieur, puis pliez la partie inférieure vers l'intérieur et la partie supérieure vers l'extérieur pour obtenir le logement (Figure 2B,C).
3. À l'aide d'une perceuse de 3 mm, faire des trous pour les vis dans le boîtier de microdrive.
   REMARQUE: Ces trous seront utilisés plus tard pour attacher le boîtier à la boîte de bûcherons (Figure 2D).
4. Souder les côtés du boîtier.
5. À l'aide d'un fichier circulaire fin, générer un petit rayon de 1,5 mm, semi-circulaire, en bas du boîtier (Figure 2E).
   REMARQUE: Ceci sera utilisé plus tard pour insérer le tube en acier inoxydable pour guider les électrodes.
6. Utilisez un morceau de perceuse de 1 mm pour faire un trou à l'arrière du boîtier pour les tétrodes (Figure 2F).
   REMARQUE: Un modèle 3D du logement se trouve dans le dossier Logement supplémentaire.

2. Construction du Microdrive

1. À l'aide d'un cutter, briser une pièce à trois broches d'une bande d'en-tête mâle à une seule rangée (Figure 1H). À l'aide de pinces, retirez la goupille du milieu.
2. À l'aide d'un cutter, couper les broches restantes à 10 mm de longueur (2 mm de moins que la longueur de la vis). Une autre possibilité est d'utiliser une vis plus longue (voir l'étape 2.4).
3. Percer un trou à l'aide d'un #65 forer le trou de l'épingle du milieu. Percer un fil à l'aide d'un robinet 00 à 99.
4. Assembler le microdrive et les plaques de laiton (7,5 mm x 2,5 mm x 0,6 mm, voir Figure supplémentaire 4) de sorte que les plaques de laiton touchent les broches. Insérer une vis (#00-90 tête ronde, 12 mm, laiton) à travers la première plaque de laiton, puis à travers le fil d'en-tête de broche et la deuxième plaque en laiton. Enfin, placez un écrou sur la vis et serrez doucement le microdrive assemblé.
5. Souder les broches avec les plaques de laiton, et l'écrou avec le bout de la vis.
6. Souder le microdrive dans le boîtier microdrive à quatre points sur les côtés des plaques de laiton microdrive.
7. Coupez un tube en acier inoxydable de 6 mm de long avec un diamètre intérieur de 1,5 mm et un autre tube en acier inoxydable de 3 mm de long avec un diamètre intérieur de 1,2 mm. Polonais les extrémités des tubes pour éviter les extrémités pointues.
8. Collez le tube de 6 mm de long à la petite éboulement semi-circulaire au fond du boîtier de microdrive à l'aide d'époxy. Collez l'acier inoxydable de 3 mm de long à l'en-tête de la broche, aligné avec le tube de 6 mm de long sur le boîtier.
9. Coupez deux segments de tubes en silicone de 5 cm de long d'un diamètre de 0,64 mm et un tube en polyimide de 5 cm de long d'un diamètre de 0,250 mm.
10. Insérez les trois tubes dans les deux tubes en acier inoxydable. Collez les tubes au tube en acier inoxydable fixé à l'en-tête de la broche à l'aide de colle cyanoacrylate. Visser le microdrive tout le chemin vers le haut et couper l'excès de tubes du haut et du bas des deux tubes d'acier.
    REMARQUE: Le microdrive avec le boîtier est maintenant prêt à l'emploi (Figure 1C).

3. Préparation du tableau tetrode

1. Pour fabriquer un implant à deux tétrodes avec quatre électrodes sur chaque tétrode, préparez huit fils, chacun de 12 cm de long, protégé par Formvar, sur un fil de tungstène de 25 m de diamètre.
   REMARQUE: La même conception peut accueillir quatre tétrodes.
2. Placez un support pour un panneau d'interface d'électrode de 16 canaux (BEI-16) PCB (voir tableau des matériaux)sous le microscope.
3. À l'aide d'une pince à pointe molle et d'un briquet, retirer le revêtement de chacun des huit fils d'un côté à l'aide de la flamme.
   REMARQUE: Il s'agit de s'assurer que le fil sera correctement connecté au connecteur PCB plus tard.
4. Poussez un fil dans l'un des trous de la BEI-16 avec le côté enduit dans le trou. Placez une épingle et appuyez dessus à l'aide de pinces. Vérifiez la connectivité en mesurant la résistance entre la broche et le côté non couché du fil.
   REMARQUE: La résistance est de l'ordre de dizaines d'Ohms.
5. Répétez l'étape 3.4 avec les huit fils.
6. Tapez deux groupes de quatre fils ensemble à l'aide de ruban adhésif à l'extrémité de chaque fil.
   REMARQUE: Chaque groupe sera collé ensemble plus tard pour former un tétrode.
7. Couper un morceau de fil de tungstène de 12 cm de long avec un diamètre de 50 m. Connectez-le à l'une des connexions DE la BEI-16.
   REMARQUE: Ce fil servira d'électrode de référence.
8. Coupez deux fils d'argent nus de 12 cm de long d'un diamètre de 75 m qui serviront de terrain à l'enregistreur. Souder les deux fils à la connexion au sol dans la BEI-16.
9. Tenez la BEI-16 au-dessus d'un dispositif de rotation motorisé et placez l'extrémité du ruban adhésif d'un groupe de quatre fils sur le dispositif de tuning motorisé. Appliquer 130 tours dans le sens des aiguilles d'une montre suivis de 20 rotations dans le sens inverse des aiguilles d'une montre. Appliquer de la colle cyanoacrylate pour couvrir le tétrode.
10. Attendez que la colle guérisse. Couper le tétrode près du ruban adhésif.
11. Répétez les étapes 3.9 et 3.10 avec le deuxième tetrode.
    REMARQUE: Cela produit le tableau fini à deux tétrodes (Figure 1D).

4. Assemblage de l'implant

1. Visez le microdrive jusqu'a u bas.
2. À l'aide de vis rondes Phillips de 1 x 3M, attachez la BEI-16 à la plaque de PVC.
3. À l'aide d'une pince à épiler à extrémité souple, tirer tous les tétrodes et les fils à travers le trou à l'avant du couvercle de la boîte de bûcheron.
4. À l'aide des vis plates de tête Phillips de 2 x 6 M, attachez la plaque de PVC au couvercle de la boîte d'enregistreur. Maintenez le connecteur BEI-16 dans la bonne orientation afin que l'enregistreur puisse être monté sur la BEI-16. Assurez-vous que la BEI-16 est fixée en place pour éviter les artefacts de mouvement dans le signal enregistré.
5. Scellez les fils à la boîte à l'aide d'époxy. Appliquer le moins possible parce que l'étanchéité primaire se fera plus tard par la vulcanisation à température ambiante (VFR).
6. Fixez le boîtier de microdrive au couvercle de la boîte d'enregistreur à l'aide de vis de 2 mm.
7. Enfiler les tétrodes et tous les fils à travers le trou à l'arrière du boîtier de microdrive. Enfiler les tétrodes à travers les deux tubes de silicone dans le microdrive. Enfiler le fil de tungstène de 50 m à travers le tube de polyimide dans le microdrive.
8. Collez les tétrodes et les fils à leurs tubes en appliquant de la colle cyanoacrylate à l'extrémité supérieure des tubes, pour s'assurer que le mouvement est compatible avec le microdrive. Vislez le microdrive jusqu'au sommet.
9. Appliquer du pétrole doux (voir Tableau des matériaux)sur le tétrode exposé et les fils à l'intérieur du boîtier de microdrive pour empêcher le mouvement.
10. Couper une fenêtre de 12 mm x 14,5 mm à fond de boîte Petri à l'aide d'une lame de rasoir chauffée. Fixez la fenêtre à l'avant du boîtier de microdrive avec époxy. Gardez les fils au sol à l'extérieur de la fenêtre.
11. Appliquer le revêtement RTV sur les tétrodes et les fils exposés entre le couvercle de la boîte d'enregistreur et le boîtier de microdrive.
12. Après la guérison du RTV, fermez la boîte avec un petit poids à l'intérieur, et immerger dans l'eau pendant la nuit pour s'assurer qu'il n'y a pas de fuite d'eau dans la boîte.
13. Couper les tétrodes et le fil de référence à la longueur désirée à l'aide de ciseaux pointus.
14. Fixez la mousse de polystyrène extrudée marquée (voir Tableau des matériaux)à la boîte. Ajustez sa taille afin que sa flottabilité soit équilibrée lorsqu'elle est immergée dans un bain d'eau.
15. Trempez les pointes de tétrode dans une solution noire platine et utilisez un courant direct (-0,2 A) pour enrober les électrodes et définir l'impédance des électrodes comme vous le souhaitez. Utilisez un testeur d'impedance multiélectrode (voir Tableau des matériaux) pour les mesures de revêtement et d'impédance.
    REMARQUE: Dans le pallium de poisson rouge, une valeur de 40 kOhm est la meilleure. Selon l'application, l'impedance d'électrode peut être ajustée en modifiant le revêtement noir de platine^10,11.

5. Préparation à l'anesthésie — 1 % MS-222 Stock Solution

MISE EN GARDE: La préparation à l'anesthésie comprend l'utilisation de MS-222 en poudre, un cancérogène. Par conséquent, les étapes 5.2 et 5.3 doivent être faites dans une hotte chimique à l'aide de gants.

1. Ajouter 100 ml d'eau à un tube qui peut contenir plus de 100 ml.
2. Dans une hotte chimique, placer une plaque de pondération jetable sur une balance. Ajouter 1 g de poudre MS-222 à l'aide d'une spatule, puis ajouter la poudre au tube.
3. Secouez bien le tube.
   REMARQUE: Sous forme liquide, MS-222 peut être utilisé à l'extérieur du capuchon chimique portant des gants, mais ne nécessite pas de masque.
4. Placer une plaque de pondération jetable sur une balance. Ajouter 2 g de bicarbonate de sodium à l'aide d'une spatule, puis ajouter la poudre au tube. Secouez bien le tube.

6. Préparation du crâne de poisson

REMARQUE: À ce stade, le poisson est prêt pour la chirurgie implantaire. Avant la chirurgie, assurez-vous que tous les composants et fournitures ont été stérilisés par les procédures appropriées. Pour cette étape, un porte-poisson en forme de U hors de l'eau est nécessaire. Dans ce protocole, un support en aluminium qui s'adapte à une tête de 15 cm à la queue long poisson rouge est utilisé. Ce système maintient le poisson hors de l'eau tout en perfusant les branchies avec de l'eau oxygénée. Pour plus de détails voir Vinepinsky et coll.⁸.

1. Placer le poisson dans un bain d'eau MS-222 de 0,02 % pendant 20 min jusqu'à ce que le poisson dorme.
2. À l'aide de gants stériles, sortir le poisson de l'eau et le placer dans le support.
   REMARQUE: L'eau oxygénée perfusant le poisson contient MS-222 à une concentration de 0,02%, de sorte que le poisson reste anesthésié pendant la chirurgie.
3. À l'aide d'une spatule stérile, appliquer la lidocaïne 5% coller sur la peau au-dessus de l'endroit désigné pour la chirurgie pendant 10 min, puis enlever la lidocaïne.
   REMARQUE: Consultez un atlas cérébral approprié pour cibler la région spécifique du cerveau.
4. À l'aide d'un scalpel stérile de 15 lames, enlever la peau au-dessus du crâne dans la région de l'implant.
5. À l'aide d'une perceuse dentaire avec des bits de forage de 0,7 mm, percer 4 trous dans le crâne. Insérez une vis de 1 mm (3 mm de long) dans chaque trou et appliquez de la colle cyanoacrylate sur les trous juste avant d'insérer la vis.
6. À l'aide d'un brûleur dentaire, appliquer du ciment dentaire sur les vis et à la périphérie du crâne exposé.
7. À l'aide de la perceuse dentaire, faire un trou de 5 mm de diamètre dans le crâne au-dessus de la région du cerveau d'intérêt. Enlever le tissu adipeux entre le crâne et le cerveau et exposer la cible de la région du cerveau à l'aide de pincettes fines et de papier de soie molle. Veillez à ne pas endommager les gros vaisseaux sanguins sous le crâne.
   REMARQUE: À la fin de cette étape, le poisson est prêt à implanter la sonde. Seules les principales étapes spécifiques à ce protocole sont décrites ici. Plusieurs procédures postopératoires (telles que la documentation détaillée sur la santé de l'animal et la stérilisation des outils et de la zone de chirurgie) ne sont pas présentées ou discutées parce qu'elles s'appliquent à toutes les chirurgies avec des poissons ou de petits animaux.

7. Implantation de la sonde

REMARQUE: Pour compléter l'étape finale du protocole, un manipulateur qui peut maintenir l'implant en place pendant qu'il est inséré dans le cerveau est nécessaire.

1. Utilisez le manipulateur pour tenir le couvercle de la boîte de bûcheronavec les tétrodes pointant vers le cerveau du poisson.
2. Pliez l'électrode de référence de telle sorte que lorsque les tétrodes sont abaissées dans le cerveau, la référence reste en dehors du cerveau.
3. Couper les motifs de telle sorte qu'ils s'insèrent dans le crâne. En option, connectez un fil au sol à l'une des vis du crâne.
4. Abaissez l'implant de telle sorte que les électrodes sont insérées dans le cerveau tandis que la partie inférieure du boîtier de microdrive est près du crâne.
5. Commencez à attacher l'implant au crâne en appliquant une petite quantité de ciment dentaire entre le boîtier et la vis du crâne la plus proche.
6. Après que la première partie du ciment dentaire soit guérie, appliquez le ciment dentaire et fermez le trou au-dessus du crâne et du crâne exposé entier.
   REMARQUE: Habituellement, plusieurs séries d'applications de ciment dentaire sont nécessaires afin de couvrir l'ensemble du crâne exposé.
7. Installez l'enregistreur et la batterie dans la boîte et scellez la boîte avec toutes les vis.
8. Appliquer des antibiotiques et des analgésiques locaux en fonction du type de poisson utilisé pour les expériences.
9. Rincer les branchies du poisson avec de l'eau douce jusqu'à ce que le poisson commence à se réveiller. Retirez le poisson du support et placez-le dans son réservoir d'attache.
   REMARQUE: Le poisson est complètement récupéré dans les 60 minutes après la chirurgie.
10. Assurez-vous que le poisson est capable de nager librement avec l'implant (Figure 3, Vidéo supplémentaire 1). Si nécessaire, réajuster la taille de la mousse de polystyrène extrudée au-dessus de la boîte de bûcheron de sorte que le poisson peut équilibrer facilement.

Résultats

Au cours d'une session d'enregistrement, le poisson rouge nageait librement dans un réservoir d'eau carré tandis que l'activité neuronale dans son telencephalon était enregistrée. Le but de ces expériences était d'étudier comment l'activité neuronale des cellules individuelles détermine le comportement du poisson. Pour ce faire, l'activité de pointe devait être identifiée dans les données enregistrées. L'activité cérébrale, pendant qu'elle était enregistrée, a été nu...

Discussion

Ce protocole détaille les étapes impliquées dans l'implantation d'un tableau de tétrodes dans le téencéphale du poisson rouge nageant librement. Cette technique met en œuvre un enregistreur neuronal qui amplifie et enregistre les signaux acquis à partir de jusqu'à 16 canaux avec un microdrive qui peut ajuster la position du tétrode dans le cerveau. Le micropropulsion permet d'ajuster la position dans le cerveau pour optimiser l'enregistrement.

Ce protocole peut facilement être modif...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm round drill bits			Compatible with the drill.
15-blade Scalpel	Sigma-Aldrich
16 channel PCB board	Neurlynx	EIB-16
1X3M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
1X3M phillips round head screws			Stainless steel. Any type.
27 cm X 19 cm X 1 mm brass plate			See Figure 2
2X6M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
3140 RTV coating	Dow Crowning	2767996
75 µm Silver wire	A-M Systems
Brass machine screws #00-90		947-1006
Brass plates 7.5mm X 2.5mm X 0.6mm			A 3D drawing is provided. See supplementary 1
Coated Tungsten wire 25µm	California Fine Wire Company	5000160	Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000)
Coated Tungsten wire 50µm	A-M Systems	795500	Can be replaced with any other wire with low impedance
Cyanoacrilic glue
Dental Burnisher	ComDent UK		Any small sterille stainless-still tool will do.
Dental cement - GCFujiPLUS	GC	431011	Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other.
Dental drill or nail polish drill			Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement.
Drill bit #65		947-65
Fast curing epoxy			Any 5 minutes curing epoxy can be used here.
Logger box with O-ring sealing			A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger.
Motorized turning device			Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means.
Mouselog-16 Neural logger	Deuteron Technologies Ltd		There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam
MS-222	Sigma Aldrich	E10521	Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98%
Nano-Z plating	White Matter LLC		The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics.
PCB pins	Neurlynx	Neuralynx EIB Pins
Polymide tubing 250µm	A-M Systems	822000
Rechargable battery			3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time.
Silicone tubing 0.64 mm	A-M Systems	806100
Stainless steel 1.5 mm	A-M Systems	846000
Sudium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S9625
Tap #00-90		947-1301
Vaseline			Any type of soft petroleum skin protectant can be used here.