Registrazione elettrofisiologica wireless dei neuroni da tetrodi mobili in pesci che nuotano liberamente

Riepilogo

Viene presentata una nuova tecnica wireless per la registrazione di segnali neurali extracellulari dal cervello di pesci rossi che nuotano liberamente. Il dispositivo di registrazione è composto da due tetrodi, un microdrive, un registratore di dati neurali e una custodia impermeabile. Tutte le parti sono personalizzate, ad eccezione del data logger e del relativo connettore.

Abstract

I meccanismi neurali che regolano il comportamento dei pesci rimangono per lo più sconosciuti, anche se i pesci costituiscono la maggior parte di tutti i vertebrati. La capacità di registrare l'attività cerebrale dei pesci liberamente in movimento farebbe progredire notevolmente la ricerca sulla base neurale del comportamento dei pesci. Inoltre, un controllo preciso della posizione di registrazione nel cervello è fondamentale per studiare l'attività neurale coordinata tra le regioni del cervello dei pesci. Qui, presentiamo una tecnica che registra in modalità wireless dal cervello di pesci che nuotano liberamente mentre controlla per la profondità della posizione di registrazione. Il sistema si basa su un registratore neurale associato a un nuovo impianto compatibile con l'acqua in grado di regolare la posizione di registrazione mediante tetrodi controllati da microdrive. Le capacità del sistema sono illustrate attraverso registrazioni dal telencephalon del pesce rosso.

Introduzione

I pesci sono il più grande e diversificato gruppo di vertebrati, e come altri vertebrati presentano capacità cognitive complesse come la navigazione, socializzare, dormire, caccia, ecc. Tuttavia, i meccanismi neurali che regolano il comportamento dei pesci rimangono per la maggior parte sconosciuti.

Negli ultimi decenni, le registrazioni extracellulari da pesci immobilizzati sono state implementate principalmente per studiare diversi aspetti della base neurale del comportamento^1,2. Anche se questa tecnica è appropriata per alcuni sistemi sensoriali, l'indagine dell'intero spettro della base neurale del comportamento è difficile se non impossibile negli animali immobilizzati. I primi progressi hanno riguardato la registrazione dalle cellule Mauthner del pesce da nuoto legato^3,4. Tuttavia, le cellule Mauthner sono sproporzionatamente grandi e l'azione registrata potenziale ampiezza, che può andare alto come pochi mV, facilitare la registrazione. Più tardi, Canfield ealtri descrissero una prova di concetto quando si usaun animale legato per registrare dal telecefalo dei pesci⁵. Un'altra tecnica recente per la registrazione dell'attività neurale dai pesci è l'imaging del calcio (vedi recensioni di Orger e de Polavieja⁶e Vanwalleghem et al.⁷). Questa tecnica è stata sviluppata per l'uso con larve di pesce zebra perché la pelle e il cranio sono trasparenti durante lo stadio larvale. Tuttavia, questa tecnica non può essere utilizzata per studiare comportamenti complessi nelle fasi successive dello sviluppo.

Qui, presentiamo una nuova tecnica per la registrazione dell'attività neurale extracellulare dal cervello dei pesci che nuotano liberamente. Questa è una versione modificata del protocollo descritto in Vinepinsky et al.⁸. L'innovazione principale è l'aggiunta di un microdrive che permette di controllare la posizione degli elettrodi dopo l'intervento chirurgico. La tecnica è progettata per la registrazione dal telencephalon dei pesci rossi utilizzando una serie di tetrodi che sono collegati a un registratore di dati neurali tramite un microdrive. L'intera configurazione è wireless e ancorata al cranio del pesce. Il peso specifico del sistema è equalizzato al peso specifico dell'acqua aggiungendo un piccolo galleggiante che permette al pesce di nuotare liberamente.

La tecnica si basa sull'uso di un data logger neurale che amplifica, digitalizza e memorizza il segnale in un dispositivo di memoria di bordo. Il sistema di telemetria del logger viene utilizzato per avviare e arrestare le registrazioni e per la sincronizzazione con la videocamera. In questo protocollo, viene utilizzato un logger neurale a 16 canali, incorporato in una scatola impermeabile insieme al microdrive.

L'assieme del micromotore è fabbricato da due componenti principali: il micromotore stesso e l'alloggiamento del micromotore (Figura 1A,B). L'alloggiamento contiene il microdrive e i tetrodi, e funge anche da ancora tra il cranio e la scatola del logger (Figura 1C). La scatola del logger di PVC viene fabbricata utilizzando un processo macchina ed è sigillata utilizzando un anello O(Figura 1E-G, vedere anche Figura supplementare 1, Figura supplementare 2e Figura supplementare 3 per un diagramma tridimensionale [3D]). Ad un'estremità, un pezzo di schiuma di polistirolo è attaccato alla scatola del logger per compensare il peso dell'impianto e fornire al pesce un impianto neutro di galleggiamento. La costruzione del microtrasporto descritto nel protocollo segue la procedura presentata da Vandecasteele et al.⁹ con una modifica per collegare il microtrasporto all'alloggiamento (Figura 1A). Vengono presentati tutti i passaggi principali.

La procedura descritta nel protocollo per preparare il teschio di pesce è simile a quella presentata in Vinepinsky et al.⁸ ed è descritta brevemente nel protocollo. Un giorno dopo l'intervento chirurgico, i pesci sono normalmente completamente recuperati dagli effetti dell'anestesia e sono pronti per gli esperimenti comportamentali. Si noti che la posizione del tetrode può essere regolata ruotando la vite del microdrive. La vite ha una spaziatura di 300 m per rotazione completa e si raccomanda un avanzamento di 75 m fino a raggiungere la posizione del cervello di destinazione. Un atlante cerebrale appropriato dovrebbe essere consultato per indirizzare la regione cerebrale specifica di interesse. Si consiglia di testare l'impedimento elettrodo ogni volta che il pesce viene anetizzato per la sostituzione della batteria o della scheda di memoria.

Protocollo

Tutte le procedure chirurgiche devono essere approvate dai comitati etici locali sul benessere degli animali (ad esempio, IACUC).

1. Costruzione dell'alloggiamento microdrive

1. Per costruire l'alloggiamento, tagliare una piastra di ottone larga 1 mm in una piastra da 19 mm x 29 mm x 1 mm utilizzando una sega. Tagliare due fessure da 5,5 mm su ciascuno dei lati lunghi perpendicolarmente al bordo, in modo che ogni fessura si trovi a 6,5 mm di distanza dai lati stretti (Figura 2A).
2. Utilizzando le pinze, piegare l'area tra le fessure sui lati lunghi verso l'interno, quindi piegare la parte inferiore verso l'interno e il lato superiore verso l'esterno per ottenere l'alloggiamento (Figura 2B,C).
3. Utilizzando una punta di perforazione da 3 mm, fare fori per le viti nell'alloggiamento microdrive.
   NOT: Questi fori verranno utilizzati in seguito per attaccare l'alloggiamento alla casella del logger(Figura 2D).
4. Solder i lati dell'alloggiamento.
5. Utilizzando un file circolare fine, generare un piccolo, 1,5 mm di raggio, una linguella semicircolare nella parte inferiore dell'alloggiamento (Figura 2E).
   NOT: Questo verrà utilizzato in seguito per inserire il tubo in acciaio inox per guidare gli elettrodi.
6. Utilizzare una punta di trapano da 1 mm per fare un foro nella parte posteriore dell'alloggiamento per le tetrodes (Figura 2F).
   NOT: Un modello 3D dell'alloggiamento si trova nel file Supplementary housing.stl.

2. Costruzione del Microdrive

1. Utilizzando una fresa, rompere un pezzo a tre pin da una singola riga di striscia di intestazione pin maschile (Figura 1H). Utilizzando le pinze, estrarre il perno centrale.
2. Utilizzando una fresa, tagliare i perni rimanenti a 10 mm di lunghezza (2 mm in meno della lunghezza della vite). Un'altra possibilità è quella di utilizzare una vite più lunga (vedi passo 2.4).
3. Forare un foro utilizzando un #65 bit di perforazione attraverso il foro del perno centrale. Forare un filo usando un tocco di 0-99.
4. Assemblare il microdrive e le piastre di ottone (7,5 mm x 2,5 mm x 0,6 mm, vedere Figura supplementare 4) in modo che le piastre di ottone tocchino i perni. Inserire una vite (testa rotonda #00-90, 12 mm, ottone) attraverso la prima piastra di ottone, quindi attraverso il filo di testa del perno e la seconda piastra di ottone. Infine, mettere un dado sulla vite e stringere delicatamente il microdrive assemblato.
5. Sfumare i perni insieme con le piastre di ottone, e il dado con la punta della vite.
6. Striatura del microdrive nell'alloggiamento microguida in quattro punti ai lati delle piastre di ottone microdrive.
7. Tagliare un tubo in acciaio inossidabile lungo 6 mm con un diametro interno di 1,5 mm e un altro tubo in acciaio inossidabile lungo 3 mm con un diametro interno di 1,2 mm. Lucidare le estremità dei tubi per evitare estremità taglienti.
8. Incollare il tubo lungo 6 mm alla piccola schedine semicircolare nella parte inferiore dell'alloggiamento microdrive utilizzando la resina epossidica. Incollare l'acciaio inossidabile lungo 3 mm all'intestazione del perno, allineato con il tubo lungo 6 mm sull'alloggiamento.
9. Tagliare due segmenti di tubo in silicone lungo 5 cm con un diametro di 0,64 mm e un tubo di poliimide lungo 5 cm con diametro di 0,250 mm.
10. Inserire i tre tubi nei due tubi in acciaio inox. Incollare i tubi al tubo in acciaio inossidabile attaccato all'intestazione del perno utilizzando la colla cianoacrilata. Avvitare il microdrive tutta la strada fino e tagliare i tubi in eccesso dalla parte superiore e inferiore dei due tubi di acciaio.
    NOT: Il microdrive con l'alloggiamento è ora pronto per l'uso (Figura 1C).

3. Preparazione dell'array Tetrode

1. Per fabbricare un impianto a due tetrodi con quattro elettrodi su ogni tetrode, preparare otto fili, ciascuno lungo 12 cm, isolato Da Formvar, su un filo di tungsteno di 25 m di diametro.
   NOT: Lo stesso design può ospitare quattro tetrodi.
2. Posizionare un supporto per una scheda di interfaccia elettrodo a 16 canali (EIB-16) PCB (vedi Tabella dei materiali)al microscopio.
3. Utilizzando una pinzetta a punta morbida e un accendino, rimuovere il rivestimento da ciascuno degli otto fili su un lato utilizzando la fiamma.
   NOT: Questo per garantire che il filo sarà collegato correttamente al connettore PCB in un secondo momento.
4. Spingere un filo in uno dei fori della BEI-16 con il lato rivestito nel foro. Posizionare un perno e premere con pinze. Controllare la connettività misurando la resistenza tra il perno e il lato non rivestito del filo.
   NOT: La resistenza è nell'ordine di decine di Ohms.
5. Ripetere il passaggio 3.4 con tutti gli otto fili.
6. Nastro due gruppi di quattro fili insieme utilizzando nastro adesivo alla fine di ogni filo.
   NOT: Ogni gruppo sarà incollato insieme in seguito per formare un tetrode.
7. Tagliare un pezzo di filo di tungsteno lungo 12 cm con un diametro di 50 m. Collegarlo a una delle connessioni BEI-16.
   NOT: Questo filo servirà come elettrodo di riferimento.
8. Tagliare due fili d'argento nudi lunghi 12 cm con un diametro di 75 m che servirà da terreno per il registratore. Solder i due fili alla connessione a terra nella BEI-16.
9. Tenere la BEI-16 sopra un dispositivo di tornitura motorizzato e posizionare l'estremità del nastro adesivo di un gruppo di quattro fili sul dispositivo di sintonizzazione motorizzato. Applica 130 giri in senso orario seguiti da 20 rotazioni in senso antiorario. Applicare la colla cianoacrilata per coprire la tetrode.
10. Aspetta che la colla guarisca. Tagliare il tetrode vicino al nastro adesivo.
11. Ripetere i passaggi 3.9 e 3.10 con la seconda tetrode.
    NOT: Questo produce la matrice a due tetrodi finita (Figura 1D).

4. Assemblaggio dell'impianto

1. Al diavolo il microdrive fino in fondo.
2. Utilizzando viti rogo da 1 x 3M Phillips, attaccare la BEI-16 alla piastra in PVC.
3. Utilizzando una pinzetta di estremità morbida, tirare tutti i tetrodi e fili attraverso il foro nella parte anteriore del coperchio del portaerba.
4. Utilizzando le viti piane 2 x 6M Phillips, collegare la piastra in PVC al coperchio del lgger. Mantenere il connettore EIB-16 nell'orientamento corretto in modo che il logger possa essere montato sulla BEI-16. Assicurarsi che la BEI-16 sia fissata per evitare artefatti di movimento nel segnale registrato.
5. Sigillare i fili alla scatola utilizzando la resina epossidica. Applicare il meno possibile perché la guarnizione primaria sarà fatta con vulcanizzazione a temperatura ambiente (RTV) in seguito.
6. Fissare l'alloggiamento del microdrive al coperchio della scatola del logger utilizzando viti da 2 mm.
7. Infilare i tetrodi e tutti i fili attraverso il foro sul retro dell'alloggiamento del microdrive. Infilare i tetrodi attraverso i due tubi di silicone nel microdrive. Infilare il filo di tungsteno di 50 m attraverso il tubo di poliimide nel microdrive.
8. Incollare i tetrodi e i fili ai loro tubi applicando la colla cianoacrilata all'estremità superiore dei tubi, per garantire che il movimento sia coerente con il microdrive. Al diavolo il microdrive fino in cima.
9. Applicare il petrolio morbido (vedi Tabella dei materiali)sulla tetrode e sui fili esposti all'interno dell'alloggiamento della microguida per prevenire il movimento.
10. Tagliare una finestra inferiore del piatto Petri da 12 mm x 14,5 mm utilizzando una lama di rasoio riscaldata. Fissare la finestra nella parte anteriore dell'alloggiamento microdrive con resina epossidica. Tenere i fili di terra fuori dalla finestra.
11. Applicare il rivestimento RTV ai tetrodi e ai fili esposti tra il coperchio del riquadro del logger e l'alloggiamento del micromotore.
12. Dopo che il RTV è guarito, chiudere la scatola con un piccolo peso all'interno, e immergersi in acqua durante la notte per garantire che non vi sia alcuna perdita d'acqua nella scatola.
13. Tagliare i tetrodi e il filo di riferimento alla lunghezza desiderata utilizzando forbici affilate.
14. Attaccare la schiuma di polistirolo estruso marcata (vedere Tabella dei materiali)alla scatola. Regolare le sue dimensioni in modo che la sua galleggiabilità è bilanciata quando immerso in un bagno d'acqua.
15. Immergere le punte di tetrodo in una soluzione nera platino e utilizzare una corrente diretta (-0,2 A) per rivestire gli elettrodi e impostare l'impedimento degli elettrodi come desiderato. Utilizzare un tester di impedenza multielettroda (vedere Tabella dei materiali) per le misurazioni di rivestimento e impeditto.
    NOT: Nel pallio del pesce rosso, un valore di 40 kOhm è meglio. A seconda dell'applicazione, l'impedimento dell'elettrodo può essere regolato modificando il rivestimento nero platino^10,11.

5. Preparazione dell'anestesia - 1% MS-222 Stock Solution

ATTENZIONE: La preparazione dell'anestesia include l'uso di MS-222 in polvere, un cancerogeno. Quindi, i passi 5.2 e 5.3 devono essere fatti in una cappa chimica utilizzando guanti.

1. Aggiungere 100 mL di acqua a un tubo che può contenere più di 100 mL.
2. In un cappuccio chimico, posizionare una piastra di ponderazione usa e getta su una bilancia. Aggiungere 1 g di MS-222 in polvere con una spatola, quindi aggiungere la polvere al tubo.
3. Agitare bene il tubo.
   NOT: In forma liquida, MS-222 può essere utilizzato al di fuori del cappuccio chimico indossando guanti, ma non richiede una maschera.
4. Posizionare una piastra di ponderazione usa e getta su una bilancia. Aggiungere 2 g di bicarbonato di sodio con una spatola, quindi aggiungere la polvere al tubo. Agitare bene il tubo.

6. Preparazione del teschio di pesce

NOT: In questa fase, il pesce è pronto per la chirurgia dell'impianto. Prima dell'intervento, assicurarsi che tutti i componenti e le forniture siano stati sterilizzati con le procedure appropriate. Per questo passaggio, è necessario un supporto di pesce fuori dall'acqua a forma di U. In questo protocollo, viene utilizzato un supporto in alluminio che si adatta a un pesce rosso lungo testa a coda di 15 cm. Questo sistema tiene il pesce fuori dall'acqua mentre perfonde le branchie con acqua ossigenata. Per maggiori dettagli vedi Vinepinsky et^al.

1. Mettere il pesce in un bagno d'acqua MS-222 0,02% per 20 min fino a quando il pesce è addormentato.
2. Utilizzando guanti sterili, estrarre il pesce dall'acqua e metterlo nel supporto.
   NOT: L'acqua ossigenata perfusa il pesce contiene MS-222 ad una concentrazione dello 0,02%, in modo che il pesce rimanga anetizzato durante l'intervento chirurgico.
3. Utilizzando una spatola sterile, applicare la lidocaina 5% pasta sulla pelle sopra il luogo designato per un intervento chirurgico per 10 min, quindi rimuovere la lidocaina.
   NOT: Consultare un atlante cerebrale appropriato per indirizzare la regione del cervello specifica.
4. Utilizzando un bisturi sterile a 15 lame, rimuovere la pelle sopra il cranio nella regione dell'impianto.
5. Utilizzando un trapano dentale con punte di perforazione da 0,7 mm, perforare 4 fori nel cranio. Inserire una vite di 1 mm (lunga 3 mm) in ogni foro e applicare la colla cianoacrilato sui fori a destra prima di inserire la vite.
6. Utilizzando un bruciatore dentale, applicare il cemento dentale sulle viti e sulla periferia del cranio esposto.
7. Utilizzando il trapano dentale, fare un foro di 5 mm di diametro nel cranio sopra la regione del cervello di interesse. Rimuovere il tessuto adiposo tra il cranio e il cervello ed esporre il bersaglio regione del cervello utilizzando pinzette sottili e carta dei tessuti molli. Fare attenzione a non danneggiare i grandi vasi sanguigni sotto il cranio.
   NOT: Alla fine di questa fase, il pesce è pronto a impiantare la sonda. Solo i passaggi principali specifici di questo protocollo sono descritti qui. Diverse procedure postoperatorie (come la documentazione dettagliata sulla salute dell'animale e la sterilizzazione degli strumenti di chirurgia e dell'area) non sono presentate o discusse perché sono applicabili a tutti gli interventi chirurgici con pesci o piccoli animali.

7. Impiantare la sonda

NOT: Per completare la fase finale del protocollo, è necessario un manipolatore in grado di tenere l'impianto in posizione mentre è inserito nel cervello.

1. Utilizzare il manipolatore per tenere il coperchio della scatola del logger con i tetrodi che puntano verso il cervello dei pesci.
2. Piegare l'elettrodo di riferimento in modo che quando i tetrodi sono abbassati nel cervello, il riferimento rimane al di fuori del cervello.
3. Tagliare i terreni in modo che si inseriscono nel cranio. Facoltativamente, collegare un filo di terra a una delle viti del cranio.
4. Abbassare l'impianto in modo che gli elettrodi siano inseriti nel cervello mentre la parte inferiore dell'alloggiamento del microdrive è vicino al cranio.
5. Iniziare ad attaccare l'impianto al cranio applicando una piccola quantità di cemento dentale tra l'alloggiamento e la vite del cranio più vicina.
6. Dopo che la prima parte del cemento dentale è guarita, applicare il cemento dentale e chiudere il foro sopra il cranio e l'intero cranio esposto.
   NOT: Di solito sono necessari diversi cicli di applicazioni di cemento dentale al fine di coprire l'intero cranio esposto.
7. Installare il logger e la batteria nella scatola e sigillare la scatola con tutte le viti.
8. Applicare antibiotici e antidolorifici locali in base al tipo di pesce utilizzato per gli esperimenti.
9. Lavare le branchie del pesce con acqua fresca fino a quando il pesce inizia a svegliarsi. Rimuovere il pesce dal supporto e rimetterlo nella sua vasca di casa.
   NOT: Il pesce è completamente recuperato entro 60 min dopo l'intervento chirurgico.
10. Assicurarsi che il pesce sia in grado di nuotare liberamente con l'impianto (Figura 3, Supplementare Video 1). Se necessario, riadattare le dimensioni della schiuma di polistirolo estruso sopra la scatola del logger in modo che il pesce possa essere bilanciato facilmente.

Risultati

Durante una sessione di registrazione il pesce rosso nuotava liberamente in un serbatoio d'acqua quadrato mentre l'attività neurale nel suo telencephalon è stata registrata. L'obiettivo di questi esperimenti era quello di studiare come l'attività neurale di singole cellule determina il comportamento del pesce. A tale scopo, l'attività di bloccamento doveva essere identificata nei dati registrati. L'attività cerebrale, durante la registrazione, è stata digitalizzata a 31.250 Hz e il ...

Discussione

Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi necessarie per impiantare una serie di tetrodi nel telencephalon di pesci rossi che nuotano liberamente. Questa tecnica implementa un logger neurale che amplifica e registra i segnali acquisiti da un massimo di 16 canali insieme a un microdrive che può regolare la posizione tetrode nel cervello. Il microdrive permette di regolare la posizione nel cervello per ottimizzare la registrazione.

Questo protocollo può essere facilmente modificato per l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm round drill bits			Compatible with the drill.
15-blade Scalpel	Sigma-Aldrich
16 channel PCB board	Neurlynx	EIB-16
1X3M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
1X3M phillips round head screws			Stainless steel. Any type.
27 cm X 19 cm X 1 mm brass plate			See Figure 2
2X6M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
3140 RTV coating	Dow Crowning	2767996
75 µm Silver wire	A-M Systems
Brass machine screws #00-90		947-1006
Brass plates 7.5mm X 2.5mm X 0.6mm			A 3D drawing is provided. See supplementary 1
Coated Tungsten wire 25µm	California Fine Wire Company	5000160	Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000)
Coated Tungsten wire 50µm	A-M Systems	795500	Can be replaced with any other wire with low impedance
Cyanoacrilic glue
Dental Burnisher	ComDent UK		Any small sterille stainless-still tool will do.
Dental cement - GCFujiPLUS	GC	431011	Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other.
Dental drill or nail polish drill			Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement.
Drill bit #65		947-65
Fast curing epoxy			Any 5 minutes curing epoxy can be used here.
Logger box with O-ring sealing			A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger.
Motorized turning device			Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means.
Mouselog-16 Neural logger	Deuteron Technologies Ltd		There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam
MS-222	Sigma Aldrich	E10521	Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98%
Nano-Z plating	White Matter LLC		The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics.
PCB pins	Neurlynx	Neuralynx EIB Pins
Polymide tubing 250µm	A-M Systems	822000
Rechargable battery			3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time.
Silicone tubing 0.64 mm	A-M Systems	806100
Stainless steel 1.5 mm	A-M Systems	846000
Sudium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S9625
Tap #00-90		947-1301
Vaseline			Any type of soft petroleum skin protectant can be used here.