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要約

ここでは、哺乳類細胞におけるRNA結合タンパク質(RRB)のRNA標的を決定するために、フラグビオチンタンデム精製を用いて 、FbioCLIP-seqと呼ばれる改変CLIP-seqプロトコルを提示する。

要約

RNAおよびRNA結合タンパク質(RRP)は、複数の生物学的プロセスを制御します。RNAとRRPの空間的および時間的な配置は、これらのプロセスの繊細な規制の根底にある。CLIP-seq(架橋と免疫沈降)と呼ばれる戦略は、内因性タンパク質とRNAの相互作用をUV架橋と免疫沈降と捉え、免疫沈降を伴って開発されました。RBP研究では従来のCLIP-seq法が広く使用されているにもかかわらず、CLIP法は、高品質の抗体の入手可能性、精製されたRBPからの潜在的な汚染物質、同位体操作の要件、および退屈な実験手順中の情報の潜在的な損失によって制限されています。ここでは、FLAG-ビオチンタグタンデム精製を用いた 、FbioCLIP-seqと呼ばれる改変CLIP-seq法について説明します。タンデム精製と厳しい洗浄条件により、相互作用するRNA結合タンパク質のほとんどすべてが除去されます。したがって、これらの共精製されたRRPによって間接的に媒介されるRNAも減少する。当社 のFbioCLIP-seq法は、同位体を含まない、タンパク質特異的抗体フリーの方法で、SDS-PAGEおよび膜移動手順を伴わない直接タンパク質結合RNAを効率的に検出することを可能にします。

概要

RNAおよびRNA結合タンパク質(RRP)は、スプライシング、翻訳、リボソーム生物形成、エピジェネティック調節、および細胞運命遷移1、2、3、4、5、6を含む多様な細胞プロセスを制御する。これらのプロセスの繊細なメカニズムは、RNAとRRPのユニークな空間的および時間的配置に依存する。したがって、分子レベルでのRNA調節を理解するための重要なステップは、RRPの結合部位に関する位置情報を明らかにすることです。

架橋と免疫沈降(CLIP-seq)と呼ばれる戦略は、目的のタンパク質の免疫沈降に続いてUV架橋とタンパク質RNA相互作用を捕捉するために開発された。方法論の主な特徴は、UV照射によるRNA結合タンパク質とその直接結合RNA分子(〜1Å内)との間の共有結合架橋の誘導である。RBP フットプリントは、CLIP タグ クラスタリングとピーク コールによって決定できます。あるいは、CLIPの逆転写ステップは、単一ヌクレオチド分解能でRNA上のタンパク質結合部位を同定できる架橋部位へのインデル(挿入または欠失)または置換につながる可能性がある。Novoalign や CIMS のようなパイプラインは CLIP-seq8のハイスループットシーケンシング結果の分析のために開発されました。また、個別ヌクレオチド分解能架橋および免疫沈降(iCLIP)、強化CLIP(eCLIP)、および光活性化可能なリボヌクレオシド強化架橋および免疫沈降(PAR-CLIP)9、10、11、12を含むいくつかの改変CLIP-seq法も提案されている。

RRPの研究において従来のCLIP-seq法が広く使用されているにもかかわらず、CLIP法には幾つかの欠点がある。まず、退屈な変性ゲル電気泳動および膜移動手順は情報の損失を招き、限定的な配列の複雑さを引き起こす可能性がある。第二に、タンパク質特異的抗体ベースのCLIP法は、単一の標的タンパク質の代わりにタンパク質複合体を引き下げる可能性があり、これは、共精製されたRbPsからの偽陽性タンパク質とRNAの相互作用につながる可能性がある。第三に、抗体ベースの戦略は、高品質の抗体を使用しないRBPの研究のためにこれらの方法の適用が不十分な、高品質の抗体の研究には不十分である。第4に、従来のCLIP法では、タンパク質結合RNAに標識するために放射標識ATPが必要です。

ビオチン化タンパク質に対するストレプトアビジンの高い親和性は、特定のタンパク質またはタンパク質複合体を精製するための非常に強力なアプローチです。哺乳動物細胞において異所性に発現した細菌ビラビチンリガーゼによって人工ペプチド配列を運ぶタンパク質の効率的なビオチン化は、生体13でビオチン精製を行う効率的な戦略となる。我々は、FLAG-ビオチンタグタンデム精製14を用いて、FbioCLIP-seq(F LAG-バイオスズ媒介Cロス-lインクとImmunop再配列化に続いてハイスループットシーケンシング)と呼ばれる改変CLIP-seq法を開発した(図1)。タンデム精製と厳しい洗浄条件により、相互作用するRMPのほとんどすべてが除去される(図2)。厳しい洗浄条件はまた、SDS-PAGEと膜移動を回避することを可能にし、労働集約的で技術的に困難です。そして、eCLIPとirCLIPと同様に、FbioCLIP-seq法は同位体フリーです。ゲルの実行と転送ステップをスキップすると、情報の損失を回避し、本物のタンパク質とRNAの相互作用をそのまま維持し、ライブラリの複雑さを増します。さらに、タグ付けシステムの高効率は、高品質の抗体を利用できないRbPsにとって良い選択です。

ここでは、哺乳類細胞のFbioCLIP-seqプロトコルのステップバイステップの説明を提供します。簡単に言えば、細胞は254nm UVで架橋され、続いて細胞リシスおよびFLAG免疫沈降(FLAG-IP)が続く。次に、タンパク質RNA複合体は、ビオチン親和性捕捉によってさらに精製され、RNAはMNaseによる部分消化によって断片化される。次いで、タンパク質結合RNAを脱リン酸化し、3'リンカーで結紮する。5'RNAリンカーは、RNAがPNKでリン酸化され、プロテナーゼK消化によって溶出した後に添加されます。逆転写後、タンパク質結合RNAシグナルをPCRによって増幅し、アガロースゲル精製によって精製します。2つのRbPは、FbioCLIP-seqの結果を例示するために選ばれました。LIN28は、マイクロRNA成熟、タンパク質翻訳、および細胞リプログラミング15、16、17に関与するRNA結合タンパク質の特徴を有する。WDR43は、リボソームバイオジェネシス、真核転写、および胚性幹細胞多能性制御14,18を調整すると考えられているWD40ドメイン含有タンパク質である。CLIP-seqを用いたLIN28に関する以前に報告された結果と一致して、FbioCLIP-seqは、マイクロRNAミールレット7gおよびmRNA16、19の「GGAG」モチーフに関するLIN28の結合部位を明らかにする(図3)。WDR43 FbioCLIP-seqはまた、RRNA20の5'-ETSの外部転写スペーサー(5'-ETS)を有するWDR43の結合好みを同定した(図4)。これらの結果は、FbioCLIP-seq法の信頼性を検証します。

プロトコル

1. セルラインの構築

  1. 目的の遺伝子をピギーバクトベクターpPiggyBac-FLAG-bio-[対象のcDNA]-(ハイグロマイシン耐性)、FLAG-ビオチンエピトープ13、21を運ぶプラスミドにクローン化し、FLAG-ビオチンタグ融合RBP(FB RBP)を発現させる。
  2. pBaseベクターを用いて発現ベクターを 持つFBRBPを、ビラ酵素22を発現する細胞株にコトランスフェクトする。
    注:本研究では 、FBRBP遺伝子を、統合されたBirA発現ベクター21を持つマウス胚性幹細胞(mESC)にトランスフェクトした。あるいは 、FBRBP発現ベクターをpBaseとpPiggyBac-BirA-V5を一緒に細胞にコトランスフェクトすることができる。
  3. ゼラチン化した皿上でmESCで細胞を成長させ、37°Cで5%CO2でmES培地(材料表)に維持する。 ハイグロマイシンb(100 μg/mL)を1週間用いてトランスフェクトした細胞を選択します。
  4. 薬物選択後、SDSローディングバッファー(表1)により細胞を採取し、ウェスタンブロット23 を用いて、FLAG抗体およびストレプトアビジンHRPを有する遺伝子のタグ付けおよび発現をそれぞれ確認する。

2. クロスリンク

  1. 実験の1日前に10cmプレートにプレート~3 x 106 mES細胞を入れ、収穫時に細胞が合流率70~90%まで成長します(サンプル当たり5〜1000万個)。
  2. 真空で媒体を取り外します。2 mL の 0.25% トリプシン-EDTA を室温 (RT) で 2 分間処理し、新鮮な mESC 培地の 4 mL でトリプシンをクエンチします。細胞を15 mL遠心分離チューブに移します。4°Cで3分間300xgで遠心分離して細胞をスピンダウンし、上清を取り除きます。
  3. 4 mLのコールドPBSで細胞を懸濁し、細胞を10cmプレートに戻して架橋します。254 nm UV光を照射して細胞をクロスリンクします(400 mJ/cm2のパラメータを持つUVクロスリンカーを設定します)。
    注: セル単層の場合、セルは、トリプシン処理の前にプレート上の UV ライトと直接クロスリンクできます。
  4. 架橋細胞を15mLチューブに移します。4°Cで3分間300xgで遠心分離してスピンダウンし、上清を取り除く。
    注:クロスリンクセルペレットは使用するまで-80 °Cで保存することができます。

3. 細胞のライセート調製

  1. 500 μLの洗浄バッファー A (表 1)を 1 mM DTT、1 mM PMSF、1/500 プロテアーゼ阻害剤カクテル、および 400 U/mL RNase 阻害剤で補充した細胞をライスします。細胞をRNaseフリー1.5 mLチューブに移します。4°Cで穏やかな回転でローターに30-60分間細胞をインキュベートします。
  2. 37°CのDNase Iの30 μLで10分間、リセートを処理します。0.5 M EDTAの4 μLを加えて反応を止める。不溶性ペレットを4°Cで20分間12,000 x g 回転させ、上清を新しいプレチル1.5 mLチューブに移します。
    注:すぐに使用するには、氷の上に保管してください。上清がすぐに使用されない場合は、使用するまで-80°Cで保管してください。

4. フラグビーズの準備

  1. 新鮮な1.5 mLチューブにサンプルあたり40 μLのスラリーFLAGビーズを加えます。
  2. 0.5 mLの氷冷洗浄バッファーAで素早くビーズを洗い、4°Cで2分間3,000 x g ずつスピンダウンします。
  3. ステップ 4.2 を 1 回繰り返します。3,000 x g のビーズを 4 °C で 2 分間回転させます。 狭端のピペットチップでバッファーを慎重に取り外します。ビーズを取り除くのは避けてください。

5. 免疫沈降

  1. ステップ 3.2 から事前平衡化された FLAG ビーズに細胞ライセートを移します。ローラーシェーカー上のサンプルを4°Cで軽く回転させます。FLAGビーズを2-4時間または一晩にリセートしてインキュベートします。
  2. 3,000 x g で2分間ビーズを遠心分離し、上清を取り除きます。
  3. 4°Cのローテーターで5分間インキュベーションして0.5mLのプレチル洗浄バッファーAでビーズを洗い、3,000 x g のビーズを2分間回転させ、上清を取り除きます。洗浄を1倍にします。
  4. プレチルド洗浄バッファBの0.5mLでステップ5.3に記載されたとおりに洗浄2倍を繰り返す(表1)。

6. 3x FLAGペプチドによる溶出

  1. 5 mLの洗浄バッファー A を用いて 3x FLAG ペプチド 1 mg を 200 ng/mL の最終濃度に溶解して 3x FLAG 溶出液を調製します。
  2. ステップ 5.4 から FLAG ビーズを 3,000 x g で 2 分間スピンダウンします。上清を慎重に取り出します。狭い端のピペットチップを使用して、上清の大部分を取り除きます。
  3. 各サンプルに200 μLの3x FLAG溶出液を加えます。4°Cで30分間穏やかな回転でサンプルをインキュベートします。 FLAGビーズを3,000 x gで2分間スピンダウンします。上清を新鮮なチューブに移します。
  4. ステップ 6.2 および 6.3 で説明されているように溶出 2x を繰り返し、溶離液を一緒にプールします。FLAG-IPの効率を確認するためにウェスタンブロット分析または銀染色のための溶出物の5%を保存します。

7. ストレプトアビジンビーズ調製

  1. サンプルごとにストレプトアビジンビーズスラリーを50 μL用意します。30 sの磁気スタンドでビーズを収集し、ピペットチップで上清を取り除きます。
  2. 0.5 mLの氷冷洗浄バッファーAで素早くビーズを洗浄し、30sの磁気スタンドでビーズを回収します。
  3. 洗浄を1倍にします。洗った後に上清を取り除きます。

8. ビオチンアフィニティー精製

  1. ステップ 7.3 からステップ 6.4 からストレプトアビジンビーズにプールされた溶離剤を移し、サンプルを 4 °C で 1~3 時間または一晩ゆっくりと回転させます。
  2. 30 sの磁気スタンドでビーズを収集し、上清を取り除きます。500 μLの洗浄バッファー C (表 1)で、RT で 5 分間静かな回転でビーズ 2x を洗います。
  3. 磁気スタンドでビーズを収集し、上清を取り除きます。500 μLの洗浄バッファー D (表 1)で 2x のビーズを、RT で 5 分間回転して洗浄します。
  4. 磁気スタンドでビーズを収集し、上清を取り除きます。500 μLの氷冷PNKバッファーでビーズ2倍を素早く洗浄する(表1)。

9. 部分的なRNA消化

  1. MNase反応バッファーを用いてMNaseの105倍希釈を行う(表1)。各サンプルに100 μLのMNase溶液を追加します。37°Cの37°Cでビーズを1,200 rpm(5sラン、30sストップ)に10分間セットして、30sの磁気スタンドでビーズを集め、上清を取り除きます。
    注: MNase の濃度は、異なる RNA 結合タンパク質に最適化する必要があります。RNAを30-50 ntフラグメントに分解できるMNase濃度(最終ライブラリの挿入サイズによって決定される)が最適です。
  2. 500 μLの氷冷PNK+EGTAバッファーでビーズ2倍を素早く洗浄する(表1)。磁気スタンドでビーズを収集し、各洗浄ステップの間に上清を取り除きます。
  3. 500 μL の洗浄バッファー C で、5 分間 RT で 5 分間静かな回転でビーズ 2x を洗います。その後、500 μLの氷冷PNKバッファーでビーズ2xを素早く洗浄します。

10. RNAの脱リン酸化

  1. 10x CIPバッファー(材料表)の8 μL、CIP酵素3μL、水69μLを用いて、ふくらはぎ腸ホスファターゼ(CIP)反応ミックスを作ります。総容積は1反応あたり80 μLである。
  2. 磁気スタンドでビーズを収集し、バッファーを取り外します。CIP 反応ミックスをビーズに追加します。37°Cのビードを1,200 rpm(5 sラン、30sストップ)に10分間セットした場合の渦を発生させる。
  3. 500 μLの氷冷PNK+EGTAバッファーで、ビーズ2xを素早く洗浄します。500 μLの氷冷PNKバッファーでビーズ2xを素早く洗います。

11. 3' リンカーライゲーション

  1. 3'リンカーミックスを20 μM 3'リンカーの4 μL、4 μLの10x T4 RNAリガーゼバッファー、4 μL 50%PEG8000、2 μLのT4 RNAリガーゼ2(切り捨て)、26 μLの水で作ります。総容積は1反応あたり40 μLである。
  2. ステップ10.3から磁気スタンドでビーズを回収し、バッファを取り外します。ビーズに3'リンカーライゲーションミックスの40 μLを加えます。16°Cのビードを1,200rpm(5sラン、30sストップ)に3時間または一晩セットしてビーズを渦する。
  3. 500 μLの氷冷PNK+EGTAバッファーで、ビーズ2xを素早く洗浄します。500 μLの氷冷PNKバッファーでビーズ2xを素早く洗います。

12. PNK治療

  1. PNKミックスは、4 μLの10x PNKバッファー、2 μLのT4 PNK酵素、1μLの10 mM ATP、33 μLの水で混合します。総容積は1反応あたり40 μLである。
  2. 磁気スタンドでビーズを収集し、バッファーを取り外します。ビーズに40 μLのPNKミックスを加えます。1,200 rpm(5 s ラン、30 s ストップ)に 10 分間セットしたサーマルミキサーで、37 °C でビーズを穏やかに渦します。
  3. 500 μLの氷冷PNK+EGTAバッファーで素早くビーズを洗います。
  4. 500 μLの氷冷PNKバッファーで素早くビーズを洗います。ウェスタンまたは銀染色分析のためにビーズの5%を保存し、免疫沈降の効率を確認します。

13. RNAの分離

  1. ステップ12.4から磁気スタンドでビーズを回収し、バッファを取り外します。200 μLのプロテナーゼK消化バッファーを加える(表1)。37°Cで30分間のビーズをボルテックスし、サーマルミキサーを1,200rpm(5sラン、30sストップ)にセットした。ビーズを磁気的に分離し、実験のために上清を取ります。
  2. ステップ13.1から上清に400μLのRNA分離試薬(材料表)を加え、十分に混ぜ合わせ、氷の上で5分間インキュベートします。クロロホルムを80μL加え、十分に混ぜ合わせ、氷の上で5分間インキュベートします。12,000 x g で 10 分 4 °C のスピンダウン。
    注:このステップは、化学フードで行う必要があります。
  3. 上清(〜500μL)を取り、イソプロパノール:エタノールミックス(1:1)の2つのボリュームを加え、3 M酢酸ナトリウム(pH = 5.5)の1/10容量、および1μLのグリコーゲンを加えます。20°Cで2時間凍結する。4°Cの遠心分離機で12,000 x g 20分間。
  4. ペレットを氷冷70%エタノールで2倍洗います。ペレットを4°Cで12,000 x g で5分間回転させます。上清を取り除き、ペレットを乾燥させます。RNAを5μLのRNaseフリーH2Oで溶解します。

14. 5' RNAリンカーライゲーション

  1. 10x T4 RNAリガーゼバッファーの1 μL、BSA(1 μg/μL)の0.5 μL、1μLの10 mM ATP、1 μLのRNase阻害剤、および0.5 μLのT4 RNAリガーゼを用いて5'RNAライゲーションミックスを行います。総体積は1反応あたり4μLです。
  2. ステップ13.4からRNAに5'20μM RNAリンカーの1 μLを加え、70°Cで2分間加熱してRNAを変性させ、すぐに氷上で冷やします。
  3. ステップ14.2からRNAに5'RNAライゲーションミックスを加える。16°Cで一晩インキュベートする。

15. 逆転写

  1. セクション13に記載されているとおりにRNAを精製し、RNAを11.5μLのRNaseフリー水で溶解します。
  2. 精製したRNAに10μMの逆転写プライマーを1μL加え、70°Cで2分間加熱し、すぐに氷上で冷やします。
  3. 逆転写ミックスは、4 μLの 5x逆転写バッファー、1 μL の 10 mM dTPs、0.1 M DTT の 1 μL、RNase 阻害剤の 1 μL、および 0.5 μL の逆転写酵素 (表) を使用します。総容積は1反応あたり7.5 μLである。
  4. RNAに7.5μLの逆転写ミックスを加え、50°Cで30分間インキュベートし、70°Cで10分間インキュベーションして反応を止める。4°Cで出発します。

16. PCR増幅

  1. PCR増幅ミックスは、2x PCRマスターミックス(材料表)の15 μL、ステップ15.4から5μL、10μMフォワードプライマー1の0.6 μL(表2)、0.6μLの10μMリバースプライマー1(表2)、H2Oの8.8μLで混合します。総容積は30 μLである。
  2. cDNAを98°C30s、98°C10s、60°C30s、72°C30s(15-20サイクルの場合はステップ2-4を繰り返す)、72°C 2分、4°Cで保持します。 PCR製品を2-3%アガロースゲルで実行します。約100-150bpのDNAを切り取り、ゲル抽出キット(材料表)でDNAを抽出し、20μLの水でDNAを溶出します。
  3. 精製PCR産物の3μLを取り、フォワードプライマー2(表2)および逆プライマー2(インデックスプライマー)で増幅する。 表 2)インデックスシーケンスを導入する5サイクルのステップ16.2で説明されているように。ステップ16.2に記載されているようにPCR産物を精製する。
  4. ハイスループットシーケンスプラットフォームでライブラリをシーケンスします。

17. バイオインフォマティクス分析

  1. 前に説明した商用プログラムを使用してデータ分析を実行8.

結果

FbioCLIP-seq プロシージャの概略図を図 1に示します。FLAG媒介性またはストレプトアビジン媒介性ワンステップアフィニティー精製と比較して、FLAG-ビオチンタンデム精製は、ほとんどすべての精製タンパク質を除去し、間接的なタンパク質とRNA相互作用の汚染を回避する(図2)。LIN28 および WDR43 のFbioCLIP-seq の代表的な結果を

ディスカッション

ここでは、FLAG-ビオチン二重タグ付けシステムを利用してタンパク質RNA複合体のタンデム精製を行う改変CLIP-seq法を紹介します。FLAG-ビオチン二重タグ付けシステムは、タンパク質とタンパク質とDNA相互作用を同定する上で強力であることが示されている13,21.ここでは、タンパク質と相互作用するRNAを同定する際のこのシステムの高い特異性...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

中国国立基礎研究プログラム(2017YFA0504204、2018YFA0107604)、中国国立自然科学財団(31630095)、清華大学生命科学センターからの支援を受けています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
UV crosslinkerUVPHL-2000 HybrilLinker
Affinity Purification Beads
ANTI-FLAG beadsSigma-AldrichA2220
Streptavidin beadsInvitrogen112.06D
Reagents
10x PBSGibco70013032
3 M NaOAcAmbionAM9740
3 x FLAG peptideSigma-AldrichF4799
ATPSigma-AldrichA6559
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC1016
CIPNEBM0290SCIP buffer is in the same package.
DTTSigma-AldrichD0632
EDTASigma-AldrichE9884
EGTASigma-AldrichE3889
Gel purification kitQIAGEN28704
GlycogenAmbionAM9510
Magnesium chloride (MgCl2)Sigma-Aldrich449172
MNaseNEBM0247S
NP-40AmrescoM158-500ML
PMSFSigma-Aldrich10837091001
Porteinase KTAKARA9033
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8340
Q5 High-Fidelity 2X Master MixNEB0492S
reverse trancriptase (SupperScriptIII)Invitrogen18080093
RNA isolation reagent (Trizol)Invitrogen15596018
RNase InhibitorThermoFisherEO0381
RNaseOUTInvitrogen10777019
RQ1 DnasePromegaM6101
SDSSigma-Aldrich1614363
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
T4 PNKNEBM0201SPNK buffer is in the same package.
T4 RNA ligaesThermoFisherEL0021T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.
T4 RNA ligase2, truncatedNEBM0242ST4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.
Trypsin-EDTAThermoFisher25200072
UreaSigma-Aldrich208884
mESC culture medium
DMEM (80%)Gibco11965126
2-MercaptoethanolGibco21985023
FCS (15%)Hyclone
Glutamax (1%)Gibco35050061
LIFpurified recombinant protein; 10,000 fold dilution
NEAA (1%)Gibco11140050
Nucleoside mix (1%)MilliporeES-008-D
Penicillin-Streptomycin (1%)Gibco15140122
Kit
DNA gel extraction kitQIAGEN28704

参考文献

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