Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

Résumé

Ici, nous présentons un protocole CLIP-seq modifié ^{appelé FBIo}CLIP-seq avec purification tandem FLAG-biotine pour déterminer les cibles arn des protéines liant l’ARN (RBPs) dans les cellules mammifères.

Résumé

Les protéines liant l’ARN et l’ARN (P RB) contrôlent de multiples processus biologiques. L’arrangement spatial et temporel des ARN et des PRR sous-tend la réglementation délicate de ces processus. Une stratégie appelée CLIP-seq (liaison croisée et immunoprécipitation) a été mise au point pour capturer les interactions protéine-ARN endogènes avec les liaisons UV suivies d’immunoprécipitation. Malgré l’utilisation à grande échelle de la méthode clip-seq conventionnelle dans l’étude RBP, la méthode CLIP est limitée par la disponibilité d’anticorps de haute qualité, de contaminants potentiels provenant des P RB copurifiés, de l’exigence de manipulation des isotopes et de la perte potentielle d’information au cours d’une procédure expérimentale fastidieuse. Ici, nous décrivons une méthode clip-seq modifiée appelée ^FBIoCLIP-seq en utilisant la purification tandem tag FLAG-biotine. Grâce à la purification en tandem et à des conditions de lavage rigoureuses, presque toutes les protéines liant l’ARN interagissent sont éliminées. Ainsi, les ARN qui interagissent indirectement sous la couverture de ces PRR copurifiés sont également réduits. Notre ^{méthode FBIo}CLIP-seq permet une détection efficace des ARN directs liés aux protéines sans SDS-PAGE et sans procédures de transfert de membrane s’il n’y a pas d’isotopes et d’anticorps spécifiques aux protéines.

Introduction

Les ARN et les protéines liant l’ARN contrôlent divers processus cellulaires, y compris l’épissage, la traduction, la biogenèse ribosome, la régulation épigénétique et la transition du destin^{cellulaire 1,2,3,4,5,6}. Les mécanismes délicats de ces processus dépendent de l’arrangement spatial et temporel unique des ARN et des PRR. Par conséquent, une étape importante vers la compréhension de la régulation de l’ARN au niveau moléculaire consiste à révéler les informations positionnelles sur les sites contraignants des P RB.

Une stratégie appelée liaison croisée et immunoprécipitation (CLIP-seq) a été mise au point pour capturer les interactions protéine-ARN avec les liaisons UV suivies de l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt⁷. La principale caractéristique de la méthodologie est l’induction de liens croisés covalents entre une protéine liant l’ARN et ses molécules d’ARN directement liées (dans ~1 Å) par irradiation UV⁸. Les empreintes RBP peuvent être déterminées par le clustering des balises CLIP et l’appel de pointe, qui ont généralement une résolution de 30−60 nt. Alternativement, l’étape de transcription inverse de CLIP peut conduire à des indélébiles (insertions ou suppressions) ou des substitutions aux sites de liaison croisée, ce qui permet d’identifier les sites de liaison protéique sur les ARN à une résolution à nucléotide unique. Des pipelines comme Novoalign et CIMS ont été développés pour l’analyse des résultats de séquençage à haut débit de CLIP-seq⁸. Plusieurs méthodes clip-seq modifiées ont également été proposées, y compris la résolution individu-nucléotide reliant et immunoprécipitant (iCLIP), clip amélioré (eCLIP), irCLIP, et ribonucleoside-amélioré photoactivatable cross-linking and immunoprecipitation (PAR-CLIP)^9,10,11,12.

Malgré l’utilisation à grande échelle des méthodes traditionnelles clip-seq dans l’étude des P RB, les méthodes CLIP présentent plusieurs inconvénients. Tout d’abord, l’électrophoresis de gel dénaturé fastidieux et la procédure de transfert de membrane peuvent mener à la perte de l’information, et causer la complexité limitée de séquence. Deuxièmement, la méthode clip à base d’anticorps protéiques peut tirer vers le bas un complexe protéique au lieu d’une seule protéine cible, ce qui peut conduire à de fausses interactions positives protéine-ARN à partir des RBPs copurifiés. Troisièmement, la stratégie à base d’anticorps nécessite une grande quantité d’anticorps de haute qualité, ce qui rend l’application de ces méthodes inadéquate pour l’étude des RBPs sans anticorps de haute qualité disponibles. Quatrièmement, la méthode CLIP traditionnelle exige que l’ATP radioétique étiqueter les ARN liés aux protéines.

La forte affinité de la streptavidine avec les protéines biotinylées en fait une approche très puissante pour purifier des protéines ou des complexes protéiques spécifiques. La biotinylation efficace des protéines portant une séquence artificielle de peptide par ligase bactérien de biotine de BirA exprimée ectopiquement dans les cellules mammifères en fait une stratégie efficace pour exécuter la purification de biotine in vivo^13. Nous avons développé une méthode clip-seq modifiée ^{appelée FBIo}CLIP-seq(FLAG-Bioteinté Cross-lencrage et jemmunoprecipitation suivie d’un séquençage à haut débit) en utilisant FLAG-biotin tag tandem purification¹⁴ (Figure 1). Grâce à la purification en tandem et à des conditions de lavage rigoureuses, presque tous les P RB en interaction sontéliminés ( figure 2). Les conditions de lavage rigoureuses permettent également de contourner le SDS-PAGE et le transfert de membrane, qui est exigeant en main-d’œuvre et techniquement difficile. Et semblable à eCLIP et irCLIP, la ^{méthode FBIo}CLIP-seq est sans isotopes. Sauter les étapes de fonctionnement et de transfert du gel permet d’éviter la perte d’informations, de garder intactes les interactions protéine-ARN authentiques et d’augmenter la complexité de la bibliothèque. De plus, l’efficacité élevée du système de marquage en fait un bon choix pour les P RB sans anticorps de haute qualité disponibles.

Ici, nous fournissons une description étape par étape du protocole CLIP-seq ^fbiopour les cellules mammifères. En bref, les cellules sont reliées entre elles par 254 nm UV, suivies de la lyse cellulaire et de l’immunoprécipitation FLAG (FLAG-IP). Ensuite, les complexes protéine-ARN sont encore purifiés par la capture d’affinité de biotine et les ARN sont fragmentés par digestion partielle avec MNase. Ensuite, l’ARN lié aux protéines est déphosphorylaté et ligaté avec un linker de 3'. Un lieneur d’ARN de 5' est ajouté après que l’ARN soit phosphorylaté avec PNK et élulisé par la digestion de proteinase K. Après transcription inverse, les signaux arn lié aux protéines sont amplifiés par PCR et purifiés par purification du gel agarose. Deux RBPs ont été choisis pour illustrer le ^{résultat de FBIo}CLIP-seq. LIN28 est une protéine liant l’ARN bien caractérisée impliquée dans la maturation des microARN, la traduction des protéines et la reprogrammation^{cellulaire 15,16,17}. WDR43 est une protéine contenant du domaine WD40 qui coordonnerait la biogenèse ribosome, la transcription eucaryotique et le contrôle de la pluripotence des cellules souches^{embryonnaires 14,18}. Conformément aux résultats précédemment rapportés pour LIN28 avec CLIP-seq, ^FbioCLIP-seq révèle des sites contraignants de LIN28 sur des motifs « GGAG » dans le microARN mir-let7g et les ARNM^16,19 (Figure 3). WDR43 ^FbioCLIP-seq a également identifié la préférence contraignante de WDR43 avec des espaceurs transcrits externes de 5' (5'-ETS) des pré-rRNAs²⁰ (Figure 4). Ces résultats valident la fiabilité de ^{la méthode FBIo}CLIP-seq.

Protocole

1. Construction de lignes cellulaires

1. Cloner le gène d’intérêt dans un vecteur PiggyBac pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA d’intérêt]-(Hygromycine-résistant) plasmide qui porte un FLAG-biotin epitope^13,21 pour exprimer une étiquette FLAG-biotine fusionné RBP^(FBRBP).
2. Cotransfecter le ^{vecteur d’expression FB}RBP avec le vecteur pBase dans une lignée cellulaire exprimant l’enzyme BirA²².
   REMARQUE : Dans cette étude, le ^{gène FB}RBP a été transfecté en cellules souches embryonnaires de souris (MESCs) portant un vecteur intégré d’expression BirA²¹. Alternativement, ^{le vecteur d’expression FB}RBP peut être cotransfecté en cellules avec pBase et pPiggyBac-BirA-V5 ensemble.
3. Faire pousser les cellules en mESC sur des plats gélatineux et maintenir dans le milieu de culture mES (Table of Materials) en 5% CO₂ à 37 °C. Sélectionnez les cellules transfectées avec hygromycine b (100 μg/mL) pendant 1 semaine.
4. Après la sélection des médicaments, récolter les cellules par tampon de chargement SDS (tableau 1) et utiliser une tache^{occidentale 23} pour confirmer le marquage et l’expression du gène avec un anticorps FLAG et streptavidine-HRP, respectivement.

2. Liaison croisée

1. Plaque ~3 x 10^{cellules de 6} mES dans une plaque de 10 cm 1 jour avant l’expérience afin que les cellules se développent à 70−90% de confluence lors de la récolte (~5−10 millions de cellules par échantillon).
2. Retirer le milieu avec un vide. Traiter les cellules avec 2 mL de 0,25% trypsine-EDTA pendant 2 min à température ambiante (RT) et étancher la trypsine de 4 mL de mESC frais moyen. Transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 mL. Faites tourner les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 3 min à 4 °C et retirez le supernatant.
3. Suspendre les cellules avec 4 mL de PBS froid et plaquer les cellules à la plaque de 10 cm pour la liaison croisée. Relier les cellules par rayonnement à la lumière UV de 254 nm (réglez le lien entre les UV et un paramètre de 400 mJ/cm^2).
   REMARQUE : Pour les monocouches cellulaires, les cellules peuvent être reliées directement à la lumière UV sur la plaque avant le traitement par trypsine.
4. Transférer les cellules croisées dans un tube de 15 mL. Faites tourner vers le bas par centrifugation à 300 x g pendant 3 min à 4 °C et retirez le supernatant.
   REMARQUE : La pastille cellulaire croisée peut être stockée à -80 °C jusqu’à utilisation.

3. Préparation de lysate cellulaire

1. Lyse les cellules avec 500 μL de tampon de lavage A (Tableau 1) fraîchement complété avec 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 cocktail inhibiteur de la protéase, et 400 U / mL inhibiteur RNase. Transférer les cellules dans un tube de 1,5 mL sans RNase. Incuber les cellules pendant 30−60 min sur un rotor avec rotation douce à 4 °C.
2. Traiter le lysate avec 30 μL de DNase I à 37 °C pendant 10 min. Arrêtez la réaction en ajoutant 4 μL de 0,5 M EDTA. Faites tourner la pastille insoluble de 12 000 x g pendant 20 min à 4 °C et transférez le supernatant dans un nouveau tube préchilled de 1,5 mL.
   REMARQUE : Pour une utilisation immédiate, restez sur la glace. Si le supernatant ne sera pas utilisé immédiatement, conservez-le à -80 °C jusqu’à utilisation.

4. Préparation de perles FLAG

1. Ajouter 40 μL de perles FLAG de boue par échantillon à un tube frais de 1,5 mL.
2. Lavez rapidement les perles avec 0,5 mL de tampon de lavage glacé A et faites tourner vers le bas de 3 000 x g pendant 2 min à 4 °C.
3. Répétez l’étape 4.2 une fois. Faire tourner les perles avec 3 000 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirez soigneusement le tampon à l’aide d’une pointe de pipette à extrémité étroite. Évitez d’enlever les perles.

5. Immunoprécipice

1. Transférer la lysate cellulaire de l’étape 3.2 aux perles FLAG prééquilibrées. Faites pivoter tous les échantillons sur un shaker à rouleaux à 4 °C doucement. Incuber les perles FLAG avec du lysate pendant 2−4 h ou toute la nuit.
2. Centrifuger les perles pendant 2 min à 3000 x g et enlever le surnatant.
3. Laver les perles avec 0,5 mL de tampon de lavage préchilled A par incubation pendant 5 min dans un rotateur à 4 °C, faire tourner les perles avec 3 000 x g pendant 2 min et enlever le surnatant. Répétez le lavage 1x.
4. Répétez le lavage 2x tel que décrit à l’étape 5.3 avec 0,5 mL de tampon de lavage préchilled B (tableau 1).

6. Elution avec peptide FLAG 3x

1. Préparez la solution d’élitution FLAG 3x en dissolvant 1 mg de peptide FLAG 3x avec 5 mL de tampon de lavage A à une concentration finale de 200 ng/mL.
2. Faites tourner les perles FLAG de l’étape 5.4 avec 3.000 x g pendant 2 min. Retirer soigneusement le surnatant. Assurez-vous que la plupart du supernatant est enlevé à l’aide d’une pointe de pipette à extrémité étroite.
3. Ajouter 200 μL de solution d’élitution FLAG 3x à chaque échantillon. Incuber les échantillons en rotation douce pendant 30 min à 4 °C. Faites tourner les perles FLAG pendant 2 min à 3 000 x g. Transférer les surnatants dans des tubes frais.
4. Répétez l’élitution 2x tel que décrit dans les étapes 6.2 et 6.3 et mettre en commun les élitants ensemble. Économisez 5 % des élites pour l’analyse des taches occidentales ou la coloration en argent pour vérifier l’efficacité de FLAG-IP.

7. Préparation de perles de Streptavidin

1. Préparer 50 μL d’une boue de perle streptavidine pour chaque échantillon. Recueillir les perles avec un support magnétique pendant 30 s et enlever le supernatant avec une pointe pipette.
2. Lavez rapidement les perles avec 0,5 mL de tampon de lavage glacé A et recueillez les perles avec un support magnétique de 30 s.
3. Répétez le lavage 1x. Retirer le surnatant après le lavage.

8. Purification d’affinité de biotine

1. Transférer les élisents mis en commun de l’étape 6.4 aux perles de streptavidine de l’étape 7.3 et faire pivoter doucement les échantillons à 4 °C pendant 1−3 h ou toute la nuit.
2. Recueillir les perles avec un support magnétique pour 30 s et enlever le surnatant. Laver les perles 2x avec 500 μL de tampon de lavage C (Tableau 1) par rotation douce à RT pendant 5 min.
3. Recueillir les perles avec le support magnétique et enlever le supernatant. Laver les perles 2x avec 500 μL de tampon de lavage D (Tableau 1) en tournant à RT pendant 5 min.
4. Recueillir les perles avec le support magnétique et enlever le supernatant. Lavez rapidement les perles 2x avec 500 μL de tampon PNK glacé (tableau 1).

9. Digestion partielle de l’ARN

1. Faire une dilution^{de 10 5}fois de MNase avec tampon de réaction MNase (Tableau 1). Ajouter 100 μL de solution MNase à chaque échantillon. Vortex les perles à 37 °C avec un mélangeur thermique fixé à 1200 rpm (5 s de course, 30 s d’arrêt) pendant 10 min, recueillir les perles avec un support magnétique pour 30 s et enlever le supernatant.
   REMARQUE : La concentration de MNase doit être optimisée pour différentes protéines liant l’ARN. La concentration de MNase qui peut digérer les ARN en fragments de 30−50 nt (déterminés par la taille de l’insertion de la bibliothèque finale) est optimale.
2. Lavez rapidement les perles 2x avec 500 μL de tampon PNK+EGTA glacé(tableau 1). Recueillir les perles avec un support magnétique et enlever le supernatant entre chaque étape de lavage.
3. Laver les perles 2x avec 500 μL de tampon de lavage C par rotation douce pendant 5 min à RT. Lavez ensuite rapidement les perles 2x avec 500 μL de tampon PNK glacé.

10. Déphosphorylation de l’ARN

1. Faire un mélange de réaction de l’intestin du veau (CIP) avec 8 μL de tampon CIP 10x (Tableau des matériaux), 3 μL d’enzyme CIP, et 69 μL d’eau. Le volume total est de 80 μL par réaction.
2. Recueillir les perles avec un support magnétique et enlever le tampon. Ajouter le mélange de réaction CIP aux perles. Vortex les perles à 37 °C avec un mélangeur thermique réglé à 1200 rpm (5 s de course, 30 s d’arrêt) pendant 10 min.
3. Lavez rapidement les perles 2x avec 500 μL de tampon PNK+EGTA glacé. Lavez rapidement les perles 2x avec 500 μL de tampon PNK glacé.

11. Ligature linker 3'

1. Faire un mélange linker 3' avec 4 μL de 20 μM 3' linker, 4 μL de 10x T4 ARN ligase tampon, 4 μL de 50% PEG8000, 2 μL de T4 ARN ligase 2 (tronqué), et 26 μL d’eau. Le volume total est de 40 μL par réaction.
2. Recueillir les perles de l’étape 10.3 avec un support magnétique et retirer le tampon. Ajouter 40 μL du mélange de ligature linker de 3' aux perles. Vortex les perles à 16 °C avec un mélangeur thermique réglé à 1200 rpm (5 s de course, 30 s d’arrêt) pendant 3 h ou toute la nuit.
3. Lavez rapidement les perles 2x avec 500 μL de tampon PNK+EGTA glacé. Lavez rapidement les perles 2x avec 500 μL de tampon PNK glacé.

12. Traitement PNK

1. Faire un mélange PNK avec 4 μL de tampon PNK 10x, 2 μL d’enzyme T4 PNK, 1 μL de 10 mM ATP, et 33 μL d’eau. Le volume total est de 40 μL par réaction.
2. Recueillir les perles avec un support magnétique et enlever le tampon. Ajouter 40 μL de mélange PNK aux perles. Vortex les perles doucement à 37 °C avec un mélangeur thermique fixé à 1200 rpm (5 s de course, 30 s d’arrêt) pendant 10 min.
3. Lavez rapidement les perles avec 500 μL de tampon PNK+EGTA glacé.
4. Lavez rapidement les perles avec 500 μL de tampon PNK glacé. Économisez 5 % des perles pour l’analyse des taches occidentales ou argentées afin de confirmer l’efficacité de l’immunoprécipitation.

13. Isolement de l’ARN

1. Recueillir les perles de l’étape 12.4 avec un support magnétique et retirer le tampon. Ajouter 200 μL de tampon de digestion proteinase K (Tableau 1). Vortex les perles pendant 30 min à 37 °C avec un mélangeur thermique réglé à 1200 rpm (5 s de course, 30 s d’arrêt). Isoler magnétiquement les perles et prendre le supernatant pour l’expérience.
2. Ajouter 400 μL de reagent d’isolation arn(Tableau des matériaux)au supernatant de l’étape 13.1, bien mélanger et incuber sur la glace pendant 5 min. Ajouter 80 μL de chloroforme et bien mélanger, puis incuber sur la glace pendant 5 min. Tournez vers le bas avec 12.000 x g pendant 10 min 4 °C.
   REMARQUE : Cette étape doit être effectuée dans une hotte chimique.
3. Prenez le supernatant (~500 μL) et ajoutez deux volumes de mélange isopropanol:éthanol (1:1), 1/10 volume de 3 M d’acétate de sodium (pH = 5,5) et 1 μL de glycogène. Congeler à -20 °C pendant 2 h. Centrifugeuse à 4 °C avec 12 000 x g pendant 20 min.
4. Lavez la pastille 2x avec de l’éthanol glacé à 70 %. Faites tourner la pastille à 4 °C avec 12 000 x g pendant 5 min. Retirer le surnatant et sécher la pastille. Dissoudre les ARN dans 5 μL de H₂O sans RNase.

14. 5' Ligature linker ARN

1. Faire un mélange de ligature arn de 5' avec 1 μL de tampon ligase 10x T4 ARN, 0,5 μL de BSA (1 μg/μL), 1 μL de 10 mM ATP, 1 μL d’inhibiteur de RNase, et 0,5 μL de Ligase D’ARN T4. Le volume total est de 4 μL par réaction.
2. Ajouter 1 μL de 5' 20 μM de liaison ARN à l’ARN de l’étape 13.4, dénominateur de l’ARN en chauffant à 70 °C pendant 2 min, et réfrigérer sur la glace immédiatement.
3. Ajouter le mélange de ligature arn de 5' à l’ARN de l’étape 14.2. Incuber à 16 °C pendant la nuit.

15. Transcription inversée

1. Purifier les ARN tels que décrits à l’article 13 et dissoudre l’ARN avec 11,5 μL d’eau exempte de RNase.
2. Ajouter 1 μL d’amorce de transcription inversée de 10 μM à l’ARN purifié, chauffer à 70 °C pendant 2 minutes et réfrigérer immédiatement sur la glace.
3. Faites un mélange de transcription inversée avec 4 μL de tampon de transcription inverse de 5 x, 1 μL de 10 mM dNTP, 1 μL de 0,1 M DTT, 1 μL d’inhibiteur de la RNase et 0,5 μL de transcriptase inverse (Tableau des matériaux). Le volume total est de 7,5 μL par réaction.
4. Ajouter 7,5 μL de mélange de transcription inverse à l’ARN, incuber à 50 °C pendant 30 min et arrêter la réaction par incubation à 70 °C pendant 10 min. Laisser à 4 °C.

16. Amplification PCR

1. Faire un mélange d’amplification PCR avec 15 μL de 2x PCR master mix (Table of Materials), 5 μL de cDNA à partir de l’étape 15.4, 0,6 μL d’amorce avant de 10 μM 1 ( tableau2), 0,6 μL de 10 amorce inversée μM 1 (tableau 2) et 8,8 μL de H₂O. Le volume total est de 30 μL.
2. Amplifiez l’ADN avec les réglages suivants : 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (répéter les étapes 2−4 pendant 15−20 cycles), 72 °C 2 min et tenir à 4 °C. Exécutez le produit PCR sur un gel d’agarose de 2−3%. Découpez l’ADN de ~100−150 bp, extrayez l’ADN avec le kit d’extraction de gel(tableau des matériaux),et élisez l’ADN avec 20 μL d’eau.
3. Prenez 3 μL du produit PCR purifié, amplifiez avec l’amorce avant 2 (tableau 2) et l’amorce inversée 2 (amorce de l’indice; Tableau 2) tel que décrit à l’étape 16.2 pendant cinq cycles pour introduire des séquences d’index. Purifier le produit PCR tel que décrit à l’étape 16.2.
4. Séquencez la bibliothèque avec une plate-forme de séquençage à haut débit.

17. Analyse bioinformatique

1. Effectuer l’analyse des données à l’aide de programmes commerciaux comme^{décrit précédemment 8}.

Résultats

La représentation schématique de la procédure CLIP-seq du ^Fbioest indiquée dans la figure 1. Par rapport à la purification d’affinité en une étape médiée par flag ou à base de streptavidine, la purification en tandem FLAG-biotine a éliminé presque toutes les protéines copurifiées, évitant ainsi la contamination des interactions indirectes protéine-ARN (figure 2). Les résultats ^{représentatifs de FBIo}CLIP-seq pour LIN28 et...

Discussion

Ici, nous introduisons une méthode CLIP-seq modifiée ^{appelée FBIo}CLIP-seq, en profitant du système flag-biotine double marquage pour effectuer la purification en tandem des complexes protéines-ARN. Il a été démontré que le système de double étiquetage FLAG-biotine est puissant pour identifier les interactions protéine-protéines et protéines-ADN^13,21. Ici, nous démontrons la grande spécificité et la commodité de ce système dans l’id...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
UV crosslinker	UVP	HL-2000 HybrilLinker
Affinity Purification Beads
ANTI-FLAG beads	Sigma-Aldrich	A2220
Streptavidin beads	Invitrogen	112.06D
Reagents
10x PBS	Gibco	70013032
3 M NaOAc	Ambion	AM9740
3 x FLAG peptide	Sigma-Aldrich	F4799
ATP	Sigma-Aldrich	A6559
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016
CIP	NEB	M0290S	CIP buffer is in the same package.
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Gel purification kit	QIAGEN	28704
Glycogen	Ambion	AM9510
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	449172
MNase	NEB	M0247S
NP-40	Amresco	M158-500ML
PMSF	Sigma-Aldrich	10837091001
Porteinase K	TAKARA	9033
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	NEB	0492S
reverse trancriptase (SupperScriptIII)	Invitrogen	18080093
RNA isolation reagent (Trizol)	Invitrogen	15596018
RNase Inhibitor	ThermoFisher	EO0381
RNaseOUT	Invitrogen	10777019
RQ1 Dnase	Promega	M6101
SDS	Sigma-Aldrich	1614363
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
T4 PNK	NEB	M0201S	PNK buffer is in the same package.
T4 RNA ligaes	ThermoFisher	EL0021	T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.
T4 RNA ligase2, truncated	NEB	M0242S	T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25200072
Urea	Sigma-Aldrich	208884
mESC culture medium
DMEM (80%)	Gibco	11965126
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
FCS (15%)	Hyclone
Glutamax (1%)	Gibco	35050061
LIF			purified recombinant protein; 10,000 fold dilution
NEAA (1%)	Gibco	11140050
Nucleoside mix (1%)	Millipore	ES-008-D
Penicillin-Streptomycin (1%)	Gibco	15140122
Kit
DNA gel extraction kit	QIAGEN	28704