Profilazione a livello di trascrizione delle interazioni proteina-RNA attraverso il cross-linking e l'immunoprecipitazione mediata dalla purificazione tandem FLAG-Biotina

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo CLIP-seq modificato ^{chiamato Fbio}CLIP-seq con purificazione tandem FLAG-biotina per determinare gli obiettivi di RNA delle proteine leganti l'RNA (RRP) nelle cellule dei mammiferi.

Abstract

Le proteine leganti RNA e RNA (RRP) controllano molteplici processi biologici. La disposizione spaziale e temporale degli RRN e degli RRP è alla base della delicata regolazione di questi processi. È stata sviluppata una strategia chiamata CLIP-seq (cross-linking e immunoprecipitation) per catturare le interazioni proteina-RNA endogena con il cross-linking UV seguito dall'immunoprecipitazione. Nonostante l'ampio uso del metodo CLIP-seq convenzionale nello studio RBP, il metodo CLIP è limitato dalla disponibilità di anticorpi di alta qualità, potenziali contaminanti dagli RRP copurificati, requisito di manipolazione degli isotopi e potenziale perdita di informazioni durante una noiosa procedura sperimentale. Qui descriviamo un metodo CLIP-seq modificato ^{chiamato Fbio}CLIP-seq utilizzando la purificazione tandem tag FLAG-biotina. Attraverso la purificazione tandem e le rigorose condizioni di lavaggio, quasi tutte le proteine interagenti leganti l'RNA vengono rimosse. Pertanto, anche gli RNA che interagiscono indirettamente mediati da questi RMP copurificati sono ridotti. Il ^{nostro metodo FBIo}CLIP-seq consente un rilevamento efficiente di RNA dirette legate alle proteine senza SDS-PAGE e procedure di trasferimento di membrana in modo privo di isotopi e specifico per proteine.

Introduzione

Gli RNA e le proteine leganti l'RNA (RRP) controllano diversi processi cellulari tra cui splicing, traduzione, biogenesi ribosoma, regolazione epigenetica e transizione del destino^{cellulare 1,2,3,4,5,6}. I delicati meccanismi di questi processi dipendono dalla disposizione spaziale e temporale unica di RTA e RRP. Pertanto, un passo importante verso la comprensione della regolazione dell'RNA a livello molecolare è quello di rivelare le informazioni posizionali sui siti vincolanti degli RRP.

È stata sviluppata una strategia denominata cross-linking e immunoprecipitazione (CLIP-seq) per catturare le interazioni proteina-RNA con il cross-linking UV seguito dall'immunoprecipitazione della proteina di interesse⁷. La caratteristica chiave della metodologia è l'induzione di collegamenti incrociati covalenti tra una proteina legante l'RNA e le sue molecole di RNA direttamente legate (entro ~1 Å) dall'irradiazione UV⁸. Le impronte RBP possono essere determinate dal clustering di tag CLIP e dalle chiamate di picco, che di solito hanno una risoluzione di 30−60 nt. In alternativa, la fase di trascrizione inversa di CLIP può portare a indeli (inserimenti o deduzioni) o sostituzioni ai siti di collegamento incrociato, che consente l'identificazione di siti di legame proteico sugli RNA con una risoluzione mono nucleotidica. Condotte come Novoalign e CIMS sono state sviluppate per l'analisi dei risultati di sequenziamento ad alta produttività di CLIP-seq⁸. Sono stati proposti anche diversi metodi CLIP-seq modificati, tra cui il cross-linking e l'immunoprecipitazione della risoluzione del nucleotide individuale (iCLIP), CLIP avanzato (eCLIP), irCLIP e cross-linking e immunoprecipitazione fotoattivibili ribonucleoside (PAR-CLIP)^9,10,11,12.

Nonostante l'ampio uso dei metodi CLIP-seq tradizionali nello studio degli RRP, i metodi CLIP presentano diversi inconvenienti. In primo luogo, la noiosa elettroforesi del gel denaturato e la procedura di trasferimento a membrana possono portare alla perdita di informazioni e causare una complessità della sequenza limitata. In secondo luogo, il metodo CLIP specifico della proteina basato su anticorpi può abbattere un complesso proteico anziché una singola proteina bersaglio, il che può portare a false interazioni proteina-RNA positive dagli RRP copurificati. In terzo luogo, la strategia basata su anticorpi richiede una grande quantità di anticorpi di alta qualità, il che rende l'applicazione di questi metodi inadeguata per lo studio degli RRB senza anticorpi di alta qualità disponibili. In quarto luogo, il metodo TRADIZIONALE CLIP richiede ATP radioetichettato per etichettare gli RNA legati alle proteine.

L'alta affinità della streptavidina con le proteine biotinilate lo rende un approccio molto potente per purificare specifiche proteine o complessi proteici. L'efficiente biotinylazione delle proteine che trasportano una sequenza peptidica artificiale mediante la biotina ligasi bira etopica nelle cellule di mammifero lo rende una strategia efficiente per eseguire la purificazione della biotina in vivo¹³. Abbiamo sviluppato un metodo CLIP-seq modificato ^{chiamato Fbio}CLIP-seq(FLAG-Biotin-mediated Cross-linking e Immunoprecipitation seguito da sequenziamento ad alta produttività) utilizzando la purificazione tandem flag-biotina^{tag 14} (Figura 1). Attraverso la purificazione tandem e le rigorose condizioni di lavaggio, quasi tutti gli RRB interagenti vengono rimossi (Figura 2). Le rigorose condizioni di lavaggio consentono anche di aggirare l'SDS-PAGE e il trasferimento a membrana, che è ad alta intensità di manodopera e tecnicamente impegnativo. E simile a eCLIP e irCLIP, il ^{metodo Fbio}CLIP-seq è privo di isotopi. Saltare il gel in esecuzione e trasferire i passaggi evita la perdita di informazioni, mantiene intatte le autentiche interazioni proteina-RNA e aumenta la complessità della libreria. Inoltre, l'elevata efficienza del sistema di etichettatura lo rende una buona scelta per gli RMP senza anticorpi di alta qualità disponibili.

Qui forniamo una descrizione dettagliata del protocollo ^FBIoCLIP-seq per le cellule di mammifero. In breve, le cellule sono reticate da UV a 254 nm, seguite da lisi cellulare e immunoprecipitazione FLAG (FLAG-IP). Successivamente, i complessi proteina-RNA vengono ulteriormente purificati dalla cattura dell'affinità della biotina e gli RNA sono frammentati dalla digestione parziale con la MNasi. Quindi, l'RNA legato alla proteina viene defosforilato e legato con un linker 3 '. Un linker 5' di RNA viene aggiunto dopo che l'RNA è fosforilato con PNK ed eluitato dalla digestione della proteinasi K. Dopo la trascrizione inversa, i segnali di RNA legati alle proteine vengono amplificati dalla PCR e purificati dalla purificazione del gel di agarosio. Due RMP sono stati scelti per esemplificare il ^{risultato di Fbio}CLIP-seq. LIN28 è una proteina legante l'RNA ben caratterizzata coinvolta nella maturazione dei microRNA, nella traduzione delle proteine e nella riprogrammazione^{cellulare 15,16,17}. WDR43 è una proteina wd40 contenente il dominio che si pensa coordini la biogenesi ribosoma, la trascrizione eucariotica e il controllo della pluripotenza delle cellule staminali embrionali^14,18. Coerentemente con i risultati precedentemente riportati per LIN28 con CLIP-seq, ^FbioCLIP-seq rivela siti di legame di LIN28 su motivi "GGAG" nel microRNA mir-let7g e^{mRNAAs 16,19} ( Figura3). WDR43 ^FbioCLIP-seq ha anche identificato la preferenza di associazione di WDR43 con distanziale trascritto esterno da 5' (5'-ETS) di pre-rRNA²⁰ (Figura 4). Questi risultati convalidano l'affidabilità ^{del metodo FBIo}CLIP-seq.

Protocollo

1. Costruzione della linea cellulare

1. Clonare il gene di interesse in un piggyBac vettore pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA di interesse]-(resistente alla igromicina) plasmide che porta un epitopo FLAG-biotina^13,21 per esprimere un tag FLAG-biotina fusa RBP^(FBRBP).
2. Cotrasfetto il vettore di espressione ^FBRBP con il vettore pBase in una linea cellulare che esprime l'enzima BirA²².
   NOTA: In questo studio, il gene ^FBRBP è stato trasfetto in cellule staminali embrionali di topo (mESC) che trasportano un vettore di espressione BirA^{integrato 21}. In alternativa, il ^{vettore di}espressione FB RBP può essere cotrasfetto in celle con pBase e pPiggyBac-BirA-V5 insieme.
3. Far crescere le cellule in mESC su piatti gelatinizzati e mantenerle in mezzo di coltura mES(Tavola dei Materiali)in CO₂ al 5% a 37 °C. Selezionare le cellule trasfette con igromicina b (100 μg/mL) per 1 settimana.
4. Dopo la selezione del farmaco, raccogliere le cellule mediante tampone di carico SDS (Tabella 1) e utilizzare una macchia^{occidentale 23} per confermare l'etichettatura e l'espressione del gene rispettivamente con un anticorpo FLAG e una streptavidina-HRP.

2. Cross-linking

1. Piastra ~3 x 10⁶ mES cellule in una piastra di 10 cm 1 giorno prima dell'esperimento in modo che le cellule crescano fino al 70−90% di confluenza quando raccolte (~5−10 milioni di cellule per campione).
2. Rimuovere il mezzo con un vuoto. Trattare le cellule con 2 mL dello 0,25% di tripsiderina-EDTA per 2 minuti a temperatura ambiente (RT) e temprare la triptina di 4 mL di mezzo mESC fresco. Trasferire le celle in un tubo di centrifuga da 15 ml. Far girare le cellule centrifugando a 300 x g per 3 min a 4 °C e rimuovere il supernatante.
3. Sospendere le celle con 4 mL di PBS freddo e placcare le celle alla piastra di 10 cm per il cross-linking. Collegare le cellule tramite radiazioni con luce UV a 254 nm (impostare il cross-linker UV con un parametro di 400 mJ/cm²).
   NOTA: Per i monostrati cellulari, le cellule possono essere collegate con la luce UV direttamente sulla piastra prima del trattamento con tripina.
4. Trasferire le celle collegate a croce in un tubo da 15 ml. Spin down per centrifugazione a 300 x g per 3 min a 4 °C e rimuovere il supernatante.
   NOTA: Il pellet di cella collegato incrociato può essere conservato a -80 °C fino all'uso.

3. Preparazione del llysato cellulare

1. Lire le cellule con 500 μL di tampone di lavaggio A(tabella 1)appena integrate con 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 cocktail inibitore della proteasi e 400 U/mL RNasi inibitore. Trasferire le celle in un tubo RNasi-free da 1,5 ml. Incubare le cellule per 30−60 minuti su un rotore con una rotazione delicata a 4 °C.
2. Trattare il lisato con 30 μL di DNasi I a 37 °C per 10 min. Interrompere la reazione aggiungendo 4 μL di 0,5 M EDTA. Far girare il pellet insolubile di 12.000 x g per 20 min a 4 °C e trasferire il supernatante su un nuovo tubo prechilled da 1,5 ml.
   NOTA: Per un uso immediato, tenere sul ghiaccio. Se il supernatante non verrà utilizzato immediatamente, conservarlo a -80 °C fino all'uso.

4. Preparazione delle perle FLAG

1. Aggiungere 40 μL di perline FLAG per campione a un tubo fresco da 1,5 ml.
2. Lavare rapidamente le perline con 0,5 mL di tampone di lavaggio ghiacciato A e girare verso il basso di 3.000 x g per 2 min a 4 °C.
3. Ripetere il passaggio 4.2 una volta. Spin giù le perline con 3.000 x g per 2 min a 4 °C. Rimuovere con cura il tampone con una punta di pipetta a estremità stretta. Evitare di rimuovere le perline.

5. Immunoprecipitazione

1. Trasferire il lysate della cella dal passaggio 3.2 alle perle FLAG pre-equilibrate. Ruotare delicatamente tutti i campioni su uno shaker a rulli a 4 °C. Incubare le perle FLAG con lisato per 2−4 ore o durante la notte.
2. Centrifugare le perline per 2 minuti a 3.000 x g e rimuovere il supernatante.
3. Lavare le perline con 0,5 mL di tampone di lavaggio prechilled A per incubazione per 5 minuti in un rotatore a 4 °C, far girare giù le perline con 3.000 x g per 2 min e rimuovere il supernatante. Ripetere il lavaggio 1x.
4. Ripetere il lavaggio 2x come descritto al passaggio 5.3 con 0,5 mL di tampone di lavaggio prechilled B (Tabella 1).

6. Eluizione con peptide FLAG 3x

1. Preparare 3x soluzione di eluizione FLAG sciogliendo 1 mg di peptide FLAG 3x con 5 mL di tampone di lavaggio A ad una concentrazione finale di 200 ng/mL.
2. Spin down le perline FLAG dal passaggio 5.4 con 3.000 x g per 2 min. Rimuovere attentamente il supernatante. Assicurarsi che la maggior parte del supernatante venga rimossa utilizzando una punta di pipetta finale stretta.
3. Aggiungere 200 μL di soluzione di eluizione FLAG 3x a ciascun campione. Incubare i campioni con rotazione delicata per 30 min a 4 °C. Spin down le perline FLAG per 2 min a 3.000 x g. Trasferire i supernatanti in tubi freschi.
4. Ripetere l'eluizione 2x come descritto nei passaggi 6.2 e 6.3 e mettere in comune gli eluenti. Risparmia il 5% degli eluenti per l'analisi western delle macchie o la colorazione dell'argento per verificare l'efficienza di FLAG-IP.

7. Preparazione delle perline di streptavidina

1. Preparare 50 μL di un liquame di perline di streptavidina per ciascun campione. Raccogliere le perline con un supporto magnetico per 30 s e rimuovere il supernatante con una punta di pipetta.
2. Lavare rapidamente le perline con 0,5 mL di tampone di lavaggio ghiacciato A e raccogliere le perline con un supporto magnetico per 30 s.
3. Ripetere il lavaggio 1x. Rimuovere il supernatante dopo il lavaggio.

8. Purificazione dell'affinità della biotina

1. Trasferire gli eluenti raggruppati dal passaggio 6.4 alle perline di streptavidina dal passo 7.3 e ruotare delicatamente i campioni a 4 °C per 1−3 h o durante la notte.
2. Raccogliere le perline con un supporto magnetico per 30 s e rimuovere il supernatante. Lavare le perline 2x con 500 μL di tampone di lavaggio C (Tabella 1) con rotazione delicata a RT per 5 min.
3. Raccogliere le perline con il supporto magnetico e rimuovere il supernatante. Lavare le perline 2x con 500 μL di tampone di lavaggio D (Tabella 1) ruotando a RT per 5 min.
4. Raccogliere le perline con il supporto magnetico e rimuovere il supernatante. Lavare rapidamente le perline 2 volte con 500 μL di tampone PNK ghiacciato(tabella 1).

9. Digestione parziale dell'RNA

1. Effettuare una diluizione^{di 10 5}volte della MNasi con tampone di reazione di MNasi(tabella 1). Aggiungere 100 μL di soluzione di MNasi a ciascun campione. Vortice le perline a 37 °C con un miscelatore termico impostato a 1.200 giri/min (corsa 5 s, 30 s stop) per 10 min, raccogliere le perline con un supporto magnetico per 30 s e rimuovere il supernatante.
   NOTA: La concentrazione di MNasi deve essere ottimizzata per diverse proteine leganti l'RNA. La concentrazione di MNasi che può digerire gli RNA in frammenti di 30−50 nt (determinata dalla dimensione dell'inserto della libreria finale) è ottimale.
2. Lavare rapidamente le perline 2x con 500 μL di tampone PNK+EGTA ghiacciato(tabella 1). Raccogliere le perline con un supporto magnetico e rimuovere il supernatante tra ogni fase di lavaggio.
3. Lavare le perline 2x con 500 μL di tampone di lavaggio C a rotazione delicata per 5 minuti a RT. Quindi lavare rapidamente le perline 2x con 500 μL di tampone PNK ghiacciato.

10. Defosforilazione dell'RNA

1. Fare una miscela di reazione fosfatasi dell'intestino di vitello (CIP) con 8 μL di tampone CIP 10x(tabella dei materiali),3 μL di enzima CIP e 69 μL di acqua. Il volume totale è di 80 μL per reazione.
2. Raccogliere le perline con un supporto magnetico e rimuovere il tampone. Aggiungere la miscela di reazione CIP alle perline. Vortice le perline a 37 °C con un miscelatore termico impostato a 1.200 giri/min (corsa 5 s, fermata 30 s) per 10 min.
3. Lavare rapidamente le perline 2x con 500 μL di tampone PNK+EGTA ghiacciato. Lavare rapidamente le perline 2x con 500 μL di tampone PNK ghiacciato.

11. 3' legatura linker

1. Fare una miscela di linker 3' con 4 μL di 20 μM 3' linker, 4 μL di 10x T4 RNA ligasi buffer, 4 μL di 50% PEG8000, 2 μL di T4 RNA ligasi 2 (troncata) e 26 μL di acqua. Il volume totale è di 40 μL per reazione.
2. Raccogliere le perline dal passaggio 10.3 con un supporto magnetico e rimuovere il buffer. Aggiungere 40 μL del mix di ligation del linker 3' alle perline. Vortice le perline a 16 °C con un miscelatore termico impostato a 1.200 giri/min (corsa 5 s, fermata 30 s) per 3 ore o durante la notte.
3. Lavare rapidamente le perline 2x con 500 μL di tampone PNK+EGTA ghiacciato. Lavare rapidamente le perline 2x con 500 μL di tampone PNK ghiacciato.

12. Trattamento PNK

1. Fare una miscela PNK con 4 μL di tampone PNK 10x, 2 μL di enzima T4 PNK, 1 μL di 10 mM ATP e 33 μL di acqua. Il volume totale è di 40 μL per reazione.
2. Raccogliere le perline con un supporto magnetico e rimuovere il tampone. Aggiungere 40 μL di miscela PNK alle perline. Vortice delicatamente le perline a 37 °C con un miscelatore termico impostato a 1.200 giri/min (corsa 5 s, fermata 30 s) per 10 min.
3. Lavare rapidamente le perline con 500 μL di tampone PNK+EGTA ghiacciato.
4. Lavare rapidamente le perline con 500 μL di tampone PNK ghiacciato. Risparmia il 5% delle perline per l'analisi della colorazione occidentale o argentata per confermare l'efficienza dell'immunoprecipitazione.

13. Isolamento dell'RNA

1. Raccogliere le perline dal passaggio 12.4 con un supporto magnetico e rimuovere il buffer. Aggiungere 200 μL di proteinasi K tampone di digestione(tabella 1). Vortice le perline per 30 min a 37 °C con un miscelatore termico impostato a 1.200 giri/min (corsa 5 s, fermata 30 s). Isolare magneticamente le perline e prendere il supernatante per l'esperimento.
2. Aggiungere 400 μL di reagente di isolamento dell'RNA(Table of Materials)al supernatante del passaggio 13.1, mescolare accuratamente e incubare sul ghiaccio per 5 minuti. Aggiungere 80 μL di cloroformio e mescolare accuratamente e quindi incubare sul ghiaccio per 5 minuti. Spin down con 12.000 x g per 10 min 4 °C.
   NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito in una cappa chimica.
3. Prendere il supernatante (~500 μL) e aggiungere due volumi di mix isopropanolo:etanolo (1:1), 1/10 volume di 3 M acetato di sodio (pH = 5,5) e 1 μL di glicogeno. Congelare a -20 °C per 2 h. Centrifuga a 4 °C con 12.000 x g per 20 min.
4. Lavare il pellet 2 volte con ghiaccio freddo 70% di etanolo. Far girare il pellet a 4 °C con 12.000 x g per 5 minuti. Rimuovere il supernatante e asciugare il pellet. Sciogliere gli RNA in 5 μL di H₂O privo di RNasi.

14. 5' Legatura linker RNA

1. Fare una miscela di legatura 5' RNA con 1 μL di 10x T4 RNA ligasi tampone, 0,5 μL di BSA (1 μg/μL), 1 μL di 10 mM ATP, 1 μL di inibitore della RNasi e 0,5 μL di T4 RNA ligasi. Il volume totale è di 4 μL per reazione.
2. Aggiungere 1 μL di 5' 20 μM RNA linker all'RNA dal passo 13.4, denaturare l'RNA riscaldando a 70 °C per 2 min e raffreddare immediatamente sul ghiaccio.
3. Aggiungere il mix di legatura dell'RNA 5' all'RNA dal passaggio 14.2. Incubare a 16 °C durante la notte.

15. Trascrizione inversa

1. Purificare gli RNA come descritto nella sezione 13 e sciogliere l'RNA con 11,5 μL di acqua priva di RNasi.
2. Aggiungere 1 μL di primer di trascrizione inversa da 10 μM all'RNA purificato, riscaldare a 70 °C per 2 minuti e raffreddare immediatamente sul ghiaccio.
3. Fare una miscela di trascrizione inversa con 4 μL di 5x buffer di trascrizione inversa, 1 μL di 10 mM dNTPs, 1 μL di 0,1 M DTT, 1 μL di inibitore della RNasi e 0,5 μL di trascrittasi inversa(Tabella dei materiali). Il volume totale è di 7,5 μL per reazione.
4. Aggiungere 7,5 μL di miscela di trascrizione inversa all'RNA, incubare a 50 °C per 30 minuti e interrompere la reazione per incubazione a 70 °C per 10 minuti. Lasciare a 4 °C.

16. Amplificazione PCR

1. Creare una miscela di amplificazione PCR con 15 μL di 2x PCR master mix(Table of Materials),5 μL di cDNA dal passo 15.4, 0,6 μL di primer avanti 10 μM(tabella 2),0,6 μL di primer inverso 10 μM(tabella 2)e 8,8 μL di H₂O. Il volume totale è di 30 μL.
2. Amplificare il cDNA con le seguenti impostazioni: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (ripetere i passaggi 2−4 per 15−20 cicli), 72 °C 2 min e tenere a 4 °C. Eseguire il prodotto PCR su un gel di agarosio 2−3%. Tagliare il DNA di ~100−150 bp, estrarre il DNA con kit di estrazione del gel(Table of Materials)ed elutare il DNA con 20 μL di acqua.
3. Prendere 3 μL del prodotto PCR purificato, amplificare con primer avanti 2 (Tabella 2) e primer inverso 2 (primer indice; Tabella 2) La commissione per i dati come descritto nel passaggio 16.2 per cinque cicli per introdurre sequenze di indici. Purificare il prodotto PCR come descritto al passaggio 16.2.
4. Sequenziare la libreria con una piattaforma di sequenziamento ad alta velocità effettiva.

17. Analisi bioinformatica

1. Eseguire l'analisi dei dati utilizzando programmi commerciali come descritto in^{precedenza 8}.

Risultati

La rappresentazione schematica della ^{procedura FBIO}CLIP-seq è illustrata nella figura 1. Rispetto alla purificazione dell'affinità in un solo passaggio mediata da FLAG o streptavidina, la purificazione tandem FLAG-biotina ha rimosso quasi tutte le proteine copurificate, evitando la contaminazione delle interazioni indirette proteina-RNA (Figura 2). I risultati ^{rappresentativi per Fbio}CLIP-seq per LIN28 e WDR43 sono illustrati nella

Discussione

Qui introduciamo un metodo CLIP-seq modificato ^{chiamato Fbio}CLIP-seq, sfruttando il sistema di doppia etichettatura FLAG-biotina per eseguire la purificazione tandem dei complessi proteina-RNA. Il sistema di doppia etichettatura FLAG-biotina si è dimostrato potente nell'identificare le interazioni proteina-proteina e proteina-DNA^13,21. Qui dimostriamo l'alta specificità e convenienza di questo sistema nell'identificare gli RNA che interagiscono con l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
UV crosslinker	UVP	HL-2000 HybrilLinker
Affinity Purification Beads
ANTI-FLAG beads	Sigma-Aldrich	A2220
Streptavidin beads	Invitrogen	112.06D
Reagents
10x PBS	Gibco	70013032
3 M NaOAc	Ambion	AM9740
3 x FLAG peptide	Sigma-Aldrich	F4799
ATP	Sigma-Aldrich	A6559
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016
CIP	NEB	M0290S	CIP buffer is in the same package.
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Gel purification kit	QIAGEN	28704
Glycogen	Ambion	AM9510
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	449172
MNase	NEB	M0247S
NP-40	Amresco	M158-500ML
PMSF	Sigma-Aldrich	10837091001
Porteinase K	TAKARA	9033
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	NEB	0492S
reverse trancriptase (SupperScriptIII)	Invitrogen	18080093
RNA isolation reagent (Trizol)	Invitrogen	15596018
RNase Inhibitor	ThermoFisher	EO0381
RNaseOUT	Invitrogen	10777019
RQ1 Dnase	Promega	M6101
SDS	Sigma-Aldrich	1614363
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
T4 PNK	NEB	M0201S	PNK buffer is in the same package.
T4 RNA ligaes	ThermoFisher	EL0021	T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.
T4 RNA ligase2, truncated	NEB	M0242S	T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25200072
Urea	Sigma-Aldrich	208884
mESC culture medium
DMEM (80%)	Gibco	11965126
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
FCS (15%)	Hyclone
Glutamax (1%)	Gibco	35050061
LIF			purified recombinant protein; 10,000 fold dilution
NEAA (1%)	Gibco	11140050
Nucleoside mix (1%)	Millipore	ES-008-D
Penicillin-Streptomycin (1%)	Gibco	15140122
Kit
DNA gel extraction kit	QIAGEN	28704