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Resumo

Aqui apresentamos um protocolo clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq com purificação de tandem FLAG-biotin para determinar os alvos do RNA de proteínas de ligação de RNA (RBPs) em células de mamíferos.

Resumo

As proteínas de ligação de RNA e RNA (RBPs) controlam múltiplos processos biológicos. O arranjo espacial e temporal das RNAs e das RBPs fundamenta a delicada regulação desses processos. Uma estratégia chamada CLIP-seq (cross-linking e imunoprecipitação) foi desenvolvida para capturar interações proteicas endógenas-RNA com ligação UV seguida de imunoprecipitação. Apesar do amplo uso do método CLIP-seq convencional no estudo RBP, o método CLIP é limitado pela disponibilidade de anticorpos de alta qualidade, potenciais contaminantes dos RBPs copurificados, exigência de manipulação de isótopos e perda potencial de informações durante um procedimento experimental tedioso. Aqui descrevemos um método clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq usando a purificação de tag flag-biotin tandem. Através da purificação tandem e condições rigorosas de lavagem, quase todas as proteínas interativas de ligação de RNA são removidas. Assim, as RNAs interagindo indiretamente mediadas por esses RBPs copurificados também são reduzidas. Nosso método FbioCLIP-seq permite a detecção eficiente de RNAs vinculados à proteína direta sem procedimentos de transferência de SDS-PAGE e de transferência de membrana de forma livre de isótopos e sem proteínas.

Introdução

As RNAs e as proteínas de ligação de RNA (RBPs) controlam diversos processos celulares, incluindo emenda, tradução, biogênese ribossa, regulação epigenética e transição do destino celular1,2,3,4,5,6. Os mecanismos delicados desses processos dependem do arranjo espacial e temporal único das RNAs e RBPs. Portanto, um passo importante para entender a regulação do RNA no nível molecular é revelar as informações posicionais sobre os locais de vinculação de RBPs.

Uma estratégia chamada de inter-vinculação e imunoprecipitação (CLIP-seq) foi desenvolvida para capturar interações proteína-RNA com ligação UV seguida de imunoprecipitação da proteína de interesse7. A principal característica da metodologia é a indução de ligações cruzadas covalentes entre uma proteína de ligação de RNA e suas moléculas de RNA diretamente ligadas (dentro de ~1 Å) por irradiação UV8. As pegadas RBP podem ser determinadas por clustering de tag CLIP e chamada de pico, que geralmente têm uma resolução de 30-60 nt. Alternativamente, a etapa de transcrição reversa do CLIP pode levar a indels (inserções ou exclusões) ou substituições aos locais de ligação cruzada, o que permite a identificação de locais de ligação proteica nos RNAs em uma resolução de nucleotídeo único. Pipelines como Novoalign e CIMS foram desenvolvidos para a análise dos resultados de sequenciamento de alto rendimento do CLIP-seq8. Vários métodos modificados de CLIP-seq também foram propostos, incluindo a interfrontecimento e imunoprecipitação de resolução individual-nucleotídeo (iCLIP), clip aprimorado (eCLIP), irCLIP e fotoativação de ligação cruzada e imunoprecipitação (PAR-CLIP)9,10,11,12.

Apesar do amplo uso dos métodos tradicionais clip-seq no estudo de RBPs, os métodos CLIP têm várias desvantagens. Primeiro, o tedioso procedimento de eletroforese de gel desnaturado e transferência de membrana pode levar à perda de informações, e causar complexidade limitada da sequência. Em segundo lugar, o método CLIP baseado em anticorpos específicos da proteína pode puxar para baixo um complexo proteico em vez de uma proteína de destino único, o que pode levar a falsas interações proteína positiva-RNA a partir dos RBPs copurificados. Em terceiro lugar, a estratégia baseada em anticorpos requer uma grande quantidade de anticorpos de alta qualidade, o que torna a aplicação desses métodos inadequada para o estudo de RBPs sem anticorpos de alta qualidade disponíveis. Em quarto lugar, o método CLIP tradicional requer ATP radiolabeled para rotular as RNAs ligadas à proteína.

A alta afinidade de streptavidin com proteínas biotiniladas torna-se uma abordagem muito poderosa para purificar proteínas específicas ou complexos proteicos. A biotiningação eficiente de proteínas que carregam uma sequência de peptídeos artificiais por ligase de biotina bacteriana expressa em ectopicamente em células de mamíferos torna-se uma estratégia eficiente para realizar a purificação da biotina in vivo13. Desenvolvemos um método clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq (FLAG-Biocolorido Cross-linking e Immunoprecipitation seguido de sequenciamento de alta produtividade) usando flag-biotin tag tandem purificação14 (Figura 1). Através da purificação em tandem e condições rigorosas de lavagem, quase todos os RBPs interagindo são removidos(Figura 2). As condições rigorosas de lavagem também permitem contornar a transferência de SDS-PAGE e membrana, que é trabalhosa intensiva e tecnicamente desafiadora. E semelhante ao eCLIP e irCLIP, o método FBIOCLIP-seq é livre de isótopos. Pular o gel correndo e transferir etapas evita a perda de informações, mantém as interações autênticas proteína-RNA intactas e aumenta a complexidade da biblioteca. Além disso, a alta eficiência do sistema de marcação torna-o uma boa escolha para RBPs sem anticorpos de alta qualidade disponíveis.

Aqui fornecemos uma descrição passo-a-passo do protocolo FBIOCLIP-seq para células de mamíferos. Resumidamente, as células são cruzadas por 254 nm UV, seguidas por lise celular e imunoprecipitação flag (FLAG-IP). Em seguida, os complexos proteína-RNA são purificados pela captura de afinidade biotina e as RNAs são fragmentadas pela digestão parcial com MNase. Em seguida, o RNA ligado à proteína é desfosforilado e ligado com um linker de 3'. Um linker de RNA de 5' é adicionado depois que o RNA é fosforilado com PNK e elucido pela digestão proteinase K. Após transcrição reversa, os sinais de RNA ligados à proteína são amplificados por PCR e purificados pela purificação do gel agarose. Dois RBPs foram escolhidos para exemplificar o resultado do FBIOCLIP-seq. LIN28 é uma proteína bem caracterizada de ligação de RNA envolvida na maturação de microRNA, tradução de proteínas e reprogramação celular15,16,17. WDR43 é uma proteína contendo domínio WD40 pensada para coordenar biogênese ribossa, transcrição eucariótica e controle de pluripotência de células-tronco embrionárias14,18. Consistente com os resultados relatados anteriormente para LIN28 com CLIP-seq, o FbioCLIP-seq revela os locais de vinculação de LIN28 em motivos "GGAG" nos motivos microRNA mir-let7g e mRNAs16,19 (Figura 3). WDR43 FbioCLIP-seq também identificou a preferência vinculante de WDR43 com espaçadores transcritos externos de 5' (5'-ETS) de pré-rRNAs20 (Figura 4). Esses resultados validam a confiabilidade do método FBIOCLIP-seq.

Protocolo

1. Construção de linha celular

  1. Clone o gene de interesse em um bitão vetorial piggybac pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA de interesse]-(Resistente à hisgromicina) plasmídeo que carrega um epítope FLAG-biotina13,21 para expressar uma tag FLAG-biotin fundida RBP(FBRBP).
  2. Cotransfecte o FBRBP expressando vetor com o vetor pBase em uma linha celular expressando a enzima BirA22.
    NOTA: Neste estudo, o gene FBRBP foi transfectado em células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) carregando um vetor de expressão BirA integrado21. Alternativamente, o vetor deexpressão FB RBP pode ser cotransfectado em células com pBase e pPiggyBac-BirA-V5 juntos.
  3. Cultivar as células em mESC em pratos gelatinizados e manter no meio cultura mES (Tabela de Materiais) em 5% DE CO2 a 37 °C. Selecione as células transfeinadas com hygromicina b (100 μg/mL) durante 1 semana.
  4. Após a seleção de medicamentos, colde células por tampão de carga SDS(Tabela 1) e use uma mancha ocidental23 para confirmar a marcação e expressão do gene com um anticorpo FLAG e streptavidin-HRP, respectivamente.

2. Cross-linking

  1. Placa ~3 x 106 mES células em uma placa de 10 cm 1 dia antes do experimento para que as células cresçam para 70-90% de confluência quando colhidas (~5-10 milhões de células por amostra).
  2. Remova o meio com um vácuo. Trate as células com 2 mL de 0,25% de trypsin-EDTA por 2 minutos à temperatura ambiente (RT) e sacie a trippsina por 4 mL de mESC médio fresco. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mL. Gire as células por centrifugação a 300 x g por 3 min a 4 °C e remova o sobrenante.
  3. Suspenda as células com 4 mL de PBS frio e coloque as células de volta à placa de 10 cm para ligação cruzada. Cruze as células por radiação com luz UV de 254 nm (defina o cruzador UV com um parâmetro de 400 mJ/cm2).
    NOTA: Para monocamadas celulares, as células podem ser cruzadas com luz UV diretamente na placa antes do tratamento de trippsina.
  4. Transfira as células transversais para um tubo de 15 mL. Gire por centrifugação a 300 x g por 3 min a 4 °C e remova o sobrenante.
    NOTA: A pelota de célula interse ligada pode ser armazenada a -80 °C até usar.

3. Preparação de lise celular

  1. Lyse as células com 500 μL de tampão de lavagem A (Tabela 1) recém-suplementadas com 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 coquetel inibidor de protease e inibidor de RNase de 400 U/mL. Transfira as células para um tubo de 1,5 mL sem RNase. Incubar as células por 30-60 min em um rotor com rotação suave a 4 °C.
  2. Trate o lise com 30 μL de DNase I a 37 °C por 10 min. Pare a reação adicionando 4 μL de 0,5 M EDTA. Gire a pelota insolúvel em 12.000 x g por 20 min a 4 °C e transfira o supernante para um novo tubo pré-1,5 mL.
    NOTA: Para uso imediato, mantenha-se no gelo. Se o supernatante não for usado imediatamente, armazene-o a -80 °C até usar.

4. Preparação de contas flag

  1. Adicione 40 μL de contas flag de chorume por amostra a um tubo fresco de 1,5 mL.
  2. Lave rapidamente as contas com 0,5 mL de tampão de lavagem gelado A e gire para baixo em 3.000 x g por 2 min a 4 °C.
  3. Repita o passo 4.2 uma vez. Gire as contas com 3.000 x g por 2 min a 4 °C. Remova cuidadosamente o tampão com uma ponta de pipeta de extremidade estreita. Evite remover as contas.

5. Imunoprecipitação

  1. Transfira o lise celular da etapa 3.2 para as contas FLAG pré-equilibradas. Gire todas as amostras em um agitador de rolo a 4 °C suavemente. Incubar as contas FLAG com lise por 2-4 h ou durante a noite.
  2. Centrifugar as contas por 2 min a 3.000 x g e remover o supernaspe.
  3. Lave as contas com 0,5 mL de tampão de lavagem pré-moído A por incubação por 5 minutos em uma rotadora a 4 °C, gire as contas com 3.000 x g por 2 min e remova o supernatante. Repita a lavagem 1x.
  4. Repita a lavagem 2x conforme descrito na etapa 5.3 com 0,5 mL de tampão de lavagem pré-ciclado B(Tabela 1).

6. Elução com peptídeo DE BANDEIRA 3x

  1. Prepare a solução de elução 3x FLAG dissolvendo 1 mg de peptídeo DE 3x FLAG com 5 mL de tampão de lavagem A a uma concentração final de 200 ng/mL.
  2. Gire as contas flag do passo 5.4 com 3.000 x g por 2 min. Remova o supernatante cuidadosamente. Certifique-se de que a maior parte do supernatante seja removida usando uma ponta de pipeta de extremidade estreita.
  3. Adicione 200 μL de solução de eluição DE 3x FLAG a cada amostra. Incubar as amostras com rotação suave por 30 min a 4 °C. Gire as contas bandeira por 2 min a 3.000 x g. Transfira os supernantes para tubos frescos.
  4. Repita a elução 2x conforme descrito nas etapas 6.2 e 6.3 e misture os eluentes. Economize 5% dos eluentes para análise de manchas ocidentais ou coloração de prata para verificar a eficiência do FLAG-IP.

7. Preparação de contas streptavidin

  1. Prepare 50 μL de um chorume de contas streptavidina para cada amostra. Colete as contas com um suporte magnético de 30 s e remova o supernatante com uma ponta de pipeta.
  2. Lave rapidamente as contas com 0,5 mL de tampão de lavagem gelado A e colete as contas com um suporte magnético de 30 s.
  3. Repita a lavagem 1x. Remova o supernatante após a lavagem.

8. Purificação de afinidade de biotina

  1. Transfira os eluentes agrupados da etapa 6.4 para as contas streptavidinas da etapa 7.3 e gire suavemente as amostras a 4 °C por 1-3 h ou durante a noite.
  2. Colete as contas com um suporte magnético para 30 s e remova o supernaspeso. Lave as contas 2x com 500 μL de tampão de lavagem C(Tabela 1) por rotação suave na RT por 5 min.
  3. Colete as contas com o suporte magnético e remova o supernaspeso. Lave as contas 2x com 500 μL de tampão de lavagem D(Tabela 1) girando em RT por 5 min.
  4. Colete as contas com o suporte magnético e remova o supernaspeso. Lave rapidamente as contas 2x com 500 μL de tampão PNK gelado(Tabela 1).

9. Digestão parcial do RNA

  1. Faça uma diluição de10 5 vezesde MNase com tampão de reação MNase(Tabela 1). Adicione 100 μL de solução MNase a cada amostra. Vórtice as contas a 37 °C com um mixer térmico definido a 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) por 10 min, colete as contas com um suporte magnético para 30 s e remova o supernasal.
    NOTA: A concentração de MNase deve ser otimizada para diferentes proteínas de ligação de RNA. A concentração de MNase que pode digerir RNAs em fragmentos de 30-50 nt (determinados pelo tamanho da inserção da biblioteca final) é ótima.
  2. Lave rapidamente as contas 2x com 500 μL de tampão PNK+EGTA gelado(Tabela 1). Colete as contas com um suporte magnético e remova o sobrenatante entre cada etapa de lavagem.
  3. Lave as contas 2x com 500 μL de tampão de lavagem C por rotação suave por 5 min no RT. Em seguida, lave rapidamente as contas 2x com 500 μL de tampão PNK gelado.

10. Desfosforilação do RNA

  1. Faça uma mistura de reação de fosfattase intestinal de bezerro (CIP) com 8 μL de tampão CIP 10x(Tabela de Materiais),3 μL de enzima CIP e 69 μL de água. O volume total é de 80 μL por reação.
  2. Colete as contas com um suporte magnético e remova o buffer. Adicione a mistura de reação CIP às contas. Vórtice as contas a 37 °C com um mixer térmico definido a 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) por 10 minutos.
  3. Lave rapidamente as contas 2x com 500 μL de tampão PNK+EGTA gelado. Lave rapidamente as contas 2x com 500 μL de tampão PNK gelado.

Ligadura de linker de 11. 3'

  1. Faça uma mistura de ligase de 3'', com 4 μL de 20 μM 3', 4 μL de 10x tampão de ligase T4 RNA, 4 μL de 50% PEG8000, 2 μL de ligase T4 2 (truncado) e 26 μL de água. O volume total é de 40 μL por reação.
  2. Colete as contas da etapa 10.3 com um suporte magnético e remova o buffer. Adicione 40 μL da mistura de ligadura de linker de 3' às contas. Vórtice as contas a 16 °C com um mixer térmico definido a 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) por 3h ou durante a noite.
  3. Lave rapidamente as contas 2x com 500 μL de tampão PNK+EGTA gelado. Lave rapidamente as contas 2x com 500 μL de tampão PNK gelado.

12. Tratamento PNK

  1. Faça uma mistura PNK com 4 μL de tampão PNK de 10x, 2 μL de enzima T4 PNK, 1 μL de ATP de 10 mM e 33 μL de água. O volume total é de 40 μL por reação.
  2. Colete as contas com um suporte magnético e remova o buffer. Adicione 40 μL de mistura PNK às contas. Vórtice as contas suavemente a 37 °C com um mixer térmico definido a 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) por 10 minutos.
  3. Lave rapidamente as contas com 500 μL de tampão PNK+EGTA gelado.
  4. Lave rapidamente as contas com 500 μL de tampão PNK gelado. Economize 5% das contas para análise de coloração ocidental ou prateada para confirmar a eficiência da imunoprecipitação.

13. Isolamento do RNA

  1. Colete as contas da etapa 12.4 com um suporte magnético e remova o buffer. Adicione 200 μL de tampão de digestão proteinase K(Tabela 1). Vórtice as contas por 30 min a 37 °C com um mixer térmico definido a 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop). Isole magneticamente as contas e leve o supernatante para o experimento.
  2. Adicione 400 μL de reagente de isolamento de RNA(Tabela de Materiais) ao sobrenadante da etapa 13.1, misture bem e incubar no gelo por 5 minutos. Adicione 80 μL de clorofórmio e misture bem e, em seguida, incubar no gelo por 5 minutos. Gire para baixo com 12.000 x g para 10 min 4 °C.
    NOTA: Esta etapa deve ser realizada em uma capa química.
  3. Pegue o supernasciente (~500 μL) e adicione dois volumes de isopropanol:mistura de etanol (1:1), 1/10 de volume de acetato de sódio de 3 M (pH = 5,5) e 1 μL de glicogênio. Congele a -20 °C por 2 h. Centrifugar a 4 °C com 12.000 x g por 20 min.
  4. Lave a pelota 2x com 70% de etanol gelado. Gire a pelota a 4 °C com 12.000 x g por 5 min. Retire o supernatante e seque a pelota. Dissolva as RNAs em 5 μL de H2O sem RNase.

Ligadura de linker de 14. 5' 5' RNA

  1. Faça uma mistura de ligadura de 5' RNA com 1 μL de 10x T4 RNA ligase buffer, 0,5 μL de BSA (1 μg/μL), 1 μL de 10 mM ATP, 1 μL de inibidor RNase e 0,5 μL de liga ligase T4 RNA. O volume total é de 4 μL por reação.
  2. Adicione 1 μL de 5' 20 μM RNA linker ao RNA a partir da etapa 13.4, desnaturar o RNA por aquecimento a 70 °C por 2 min, e esfriar no gelo imediatamente.
  3. Adicione o mix de ligadura RNA de 5' ao RNA da etapa 14.2. Incubar a 16 °C durante a noite.

15. Transcrição reversa

  1. Purifique as RNAs conforme descrito na seção 13 e dissolva o RNA com 11,5 μL de água livre de RNase.
  2. Adicione 1 μL de 10 μM de transcrição reversa ao RNA purificado, aqueça a 70 °C por 2 min e esfrie no gelo imediatamente.
  3. Faça uma mistura de transcrição reversa com 4 μL de tampão de transcrição reversa de 5x, 1 μL de 10 mM dNTPs, 1 μL de 0,1 M DTT, 1 μL de inibidor RNase e 0,5 μL de transcriptase reversa(Tabela de Materiais). O volume total é de 7,5 μL por reação.
  4. Adicione 7,5 μL de mistura de transcrição reversa ao RNA, incubar a 50 °C por 30 min e parar a reação por incubação a 70 °C por 10 min. Deixe a 4 °C.

16. Amplificação do PCR

  1. Faça uma mistura de amplificação PCR com 15 μL de 2x PCR master mix(Tabela de Materiais),5 μL de cDNA a partir da etapa 15.4, 0,6 μL de 10 μM para a frente primer 1(Tabela 2),0,6 μL de 10 μM primer reverso 1(Tabela 2), e 8,8 μL de H2O. O volume total é de 30 μL.
  2. Amplie o cDNA com as seguintes configurações: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (repetição de passos 2−4 para 15-20 ciclos), 72 °C 2 min e 4 °C. Execute o produto PCR em um gel de 2-3% de agarose. Corte o DNA de ~100-150 bp, extraia DNA com kit de extração de gel(Tabela de Materiais),e elute o DNA com 20 μL de água.
  3. Pegue 3 μL do produto PCR purificado, amplie com primer dianteiro 2 (Tabela 2) e primer reverso 2 (primer de índice; Tabela 2) como descrito na etapa 16.2 para cinco ciclos para introduzir sequências de índice. Purifique o produto PCR conforme descrito na etapa 16.2.
  4. Sequenciar a biblioteca com uma plataforma de sequenciamento de alto rendimento.

17. Análise bioinformática

  1. Realize a análise de dados utilizando programas comerciais como descrito anteriormente8.

Resultados

A representação esquemática do procedimento FbioCLIP-seq é mostrada na Figura 1. Em comparação com a purificação de afinidade mediada por FLAG ou exptavidina, a purificação de tandem FLAG-biotin removeu quase todas as proteínas copurificadas, evitando a contaminação de interações proteicas indiretas-RNA(Figura 2). Os resultados representativos para FbioCLIP-seq para LIN28 e WDR43 são retratados na Figura...

Discussão

Aqui introduzimos um método clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq, aproveitando o sistema de marcação dupla FLAG-biotin para realizar a purificação tandem de complexos de proteína-RNA. O sistema de marcação dupla FLAG-biotina tem se mostrado poderoso na identificação de interações proteína-proteína-DNA13,21. Aqui demonstramos a alta especificidade e conveniência desse sistema na identificação das RNAs interagindo com proteínas. Atr...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

O apoio ao subsídio é do Programa Nacional de Pesquisa Básica da China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31630095) e do Centro de Ciências da Vida da Universidade de Tsinghua.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
UV crosslinkerUVPHL-2000 HybrilLinker
Affinity Purification Beads
ANTI-FLAG beadsSigma-AldrichA2220
Streptavidin beadsInvitrogen112.06D
Reagents
10x PBSGibco70013032
3 M NaOAcAmbionAM9740
3 x FLAG peptideSigma-AldrichF4799
ATPSigma-AldrichA6559
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC1016
CIPNEBM0290SCIP buffer is in the same package.
DTTSigma-AldrichD0632
EDTASigma-AldrichE9884
EGTASigma-AldrichE3889
Gel purification kitQIAGEN28704
GlycogenAmbionAM9510
Magnesium chloride (MgCl2)Sigma-Aldrich449172
MNaseNEBM0247S
NP-40AmrescoM158-500ML
PMSFSigma-Aldrich10837091001
Porteinase KTAKARA9033
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8340
Q5 High-Fidelity 2X Master MixNEB0492S
reverse trancriptase (SupperScriptIII)Invitrogen18080093
RNA isolation reagent (Trizol)Invitrogen15596018
RNase InhibitorThermoFisherEO0381
RNaseOUTInvitrogen10777019
RQ1 DnasePromegaM6101
SDSSigma-Aldrich1614363
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
T4 PNKNEBM0201SPNK buffer is in the same package.
T4 RNA ligaesThermoFisherEL0021T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.
T4 RNA ligase2, truncatedNEBM0242ST4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.
Trypsin-EDTAThermoFisher25200072
UreaSigma-Aldrich208884
mESC culture medium
DMEM (80%)Gibco11965126
2-MercaptoethanolGibco21985023
FCS (15%)Hyclone
Glutamax (1%)Gibco35050061
LIFpurified recombinant protein; 10,000 fold dilution
NEAA (1%)Gibco11140050
Nucleoside mix (1%)MilliporeES-008-D
Penicillin-Streptomycin (1%)Gibco15140122
Kit
DNA gel extraction kitQIAGEN28704

Referências

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