Flag-Biotin Tandem Arınma Aracılı Çapraz Bağlama ve İmmünopits Ile Protein-RNA Etkileşimlerinin Transkripsiyon-Geniş Profilleme

Özet

Burada, memeli hücrelerinde RNA bağlayıcı proteinlerin (RRB) RNA hedeflerini belirlemek için FLAG-biotin tandem saflaştırma ile ^FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq protokolü salıyoruz.

Özet

RNA ve RNA bağlayıcı proteinler (RRB' ler) birden fazla biyolojik işlemi kontrol eder. RNA'ların ve RRB'lerin mekansal ve zamansal düzenlemesi bu süreçlerin hassas bir şekilde düzenlenmesinin temelini oluşturur. ENdojen protein-RNA etkileşimlerini UV çapraz bağlanması ve ardından immünoprepitasyon ile yakalamak için CLIP-seq (çapraz bağlama ve immünopredimasyon) adı verilen bir strateji geliştirilmiştir. RBP çalışmasında konvansiyonel CLIP-seq yönteminin yaygın kullanımına rağmen, CLIP yöntemi yüksek kaliteli antikorların bulunabilirliği, saflaştırılmış RP'lerden potansiyel kirleticimaddeler, izotop manipülasyongereksinimi ve sıkıcı bir deneysel işlem sırasında potansiyel bilgi kaybı ile sınırlıdır. Burada FLAG-biotin etiketi tandem arınma kullanarak ^FbioCLIP-seq adlı değiştirilmiş bir CLIP-seq yöntemi ni tanımlıyoruz. Tandem arınma ve sıkı yıkama koşulları sayesinde, hemen hemen tüm etkileşen RNA bağlayıcı proteinler kaldırılır. Böylece, dolaylı olarak bu copurified RbPs aracılık rna'lar da azalır. ^FbioCLIP-seq metodumuz, sds-PAGE ve membran transfer prosedürleri olmadan doğrudan proteine bağlı RNA'ların izotopsuz ve proteine özgü antikorsuz bir şekilde etkin bir şekilde algılanmasını sağlar.

Giriş

RNA ve RNA bağlayıcı proteinler (RRB' ler) birleştirme, çeviri, ribozom biyogenez, epigenetik regülasyon ve hücre kaderi geçişi¹,^2,3,4,5,6gibi çeşitli hücresel süreçleri kontrol eder. Bu süreçlerin hassas mekanizmaları RNA'ların ve RRB'lerin eşsiz mekansal ve zamansal düzenlemesine bağlıdır. Bu nedenle, rna regülasyonunu moleküler düzeyde anlama yolunda önemli bir adım, RP'lerin bağlayıcı bölgeleri hakkındaki konumsal bilgileri ortaya çıkarmaktır.

Bir strateji çapraz bağlama ve immünoprepitasyon olarak anılacaktır (CLIP-seq)^uvçapraz bağlantı ile protein-RNA etkileşimleri yakalamak için geliştirilmiştir ilgi protein immünopreside ani 7. Metodolojinin en önemli özelliği, Bir RNA bağlayıcı protein ve doğrudan bağlı RNA molekülleri arasında kovalent çapraz bağlantıların indüksiyonudur (~ 1 şiçinde) UV ışınlama⁸. RBP ayak izleri, genellikle 30−60 nt çözünürlüğe sahip CLIP etiket kümeleme ve tepe arama ile belirlenebilir. Alternatif olarak, CLIP'in ters transkripsiyon adımı, tek nükleotid çözünürlükte RNA'larda protein bağlama sitelerinin tanımlanmasına olanak tanıyan çapraz bağlama sitelerine indels (eklemeler veya silmeler) veya ikamelere yol açabilir. Novoalign ve CIMS gibi boru hatları CLIP-seq⁸yüksek iş bölümü sekanslama sonuçlarının analizi için geliştirilmiştir. Çeşitli modifiye CLIP-seq yöntemleri de önerilmiştir, bireysel nükleotit çözünürlük çapraz bağlama ve immünoprepitasyon dahil (iCLIP), gelişmiş CLIP (eCLIP), irCLIP, ve fotoaktipabl ribonükleoside gelişmiş çapraz bağlama ve immünopredi (PAR-CLIP)^9,10,11,12.

RRB'lerin çalışmasında geleneksel CLIP-seq yöntemlerinin yaygın kullanımına rağmen, CLIP yöntemlerinin çeşitli dezavantajları vardır. İlk olarak, sıkıcı denatüre jel elektroforez ve membran transferi prosedürü bilgi kaybına yol açabilir, ve sınırlı dizi karmaşıklığına neden. İkinci olarak, proteine özgü antikor bazlı CLIP yöntemi tek bir hedef protein yerine bir protein kompleksini aşağı çekebilir, bu da saflaştırılmış RP'lerden yanlış pozitif protein-RNA etkileşimlerine yol açabilir. Dördüncü olarak, geleneksel CLIP yöntemi proteine bağlı RNA'ları etiketlemek için radiolabeled ATP gerektirir.

Streptavidin biyotinylated proteinlere yüksek yakınlık belirli proteinler veya protein kompleksleri arındırmak için çok güçlü bir yaklaşım yapar. Memeli hücrelerinde ektonik olarak ifade edilen bakteriyel BirA biotin ligaz ile yapay peptit dizilimini taşıyan proteinlerin verimli biyotinylation vivo biotin arıtma gerçekleştirmek için etkili bir strateji yapar¹³. Biz modifiye CLIP-seq yöntemi ^FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin aracılı Cross-lmürekkep ve benmmuno p recipitation yüksek iş itme takip) FLAG-biotin etiket tandem arıtma¹⁴ kullanarak geliştirdi (Şekil 1). Tandem arınma ve sıkı yıkama koşulları sayesinde, hemen hemen tüm etkileşen RRB'ler çıkarılır (Şekil 2). Sıkı yıkama koşulları, emek yoğun ve teknik açıdan zorlu olan SDS-PAGE ve membran transferinin de atlatılmasına olanak sağlar. Ve eCLIP ve irCLIP benzer, ^FbioCLIP-seq yöntemi izotop-free. Jel çalışan ve transfer adımları atlayarak bilgi kaybını önler, otantik protein-RNA etkileşimleri bozulmadan tutar ve kütüphane karmaşıklığını artırır. Ayrıca, etiketleme sisteminin yüksek verimlilik yüksek kaliteli antikorlar mevcut olmadan RbPs için iyi bir seçim yapar.

Burada memeli hücreleri için ^FbioCLIP-seq protokolü adım adım açıklamasını salıyoruz. Kısaca, hücreler çapraz bağlı 254 nm UV, hücre lysis ve FLAG immünopresipitasyon takip (FLAG-IP). Daha sonra, protein-RNA kompleksleri biotin afinite yakalama ile daha da saflaştırılır ve RNA'lar MNase ile kısmi sindirim ile parçalanır. Daha sonra proteine bağlı RNA fosforilasyona ve 3' linker ile bağlanır. RNA PNK ile fosforlandırıldıktan ve proteinaz K sindirimi ile eluted sonra 5' RNA bağlayıcı eklenir. Ters transkripsiyondan sonra, proteine bağlı RNA sinyalleri PCR ile yükseltilir ve agarose jel saflaştırma ile saflaştırılır. Fbio CLIP-seq sonucunu örneklemek için iki RRB seçildi. LIN28 mikroRNA olgunlaşma, protein çevirisi ve hücre yeniden programlama^15,16,17dahil iyi karakterize RNA bağlayıcı proteindir. WDR43 ribozom biyogenez, ökaryotik transkripsiyon ve embriyonik kök hücre pluripotency kontrol koordine etmek için düşünülen bir WD40 etki alanı içeren protein^14,18. CLIP-seq ile LIN28 için daha önce bildirilen sonuçlarla tutarlı ^{olarak, Fbio}CLIP-seq mikroRNA mir-let7g ve mRNA'larda "GGAG" motifleri üzerinde LIN28'in bağlayıcı alanlarını ortaya çıkarır^16,19 (Şekil 3). WDR43 ^FbioCLIP-seq ayrıca WDR43'ün bağlayıcı tercihini 5' harici transkripsiyonlu spacers (5'-ETS) öncesi rRNA'lar²⁰ (Şekil 4)ile belirlemİştir. Bu sonuçlar ^FbioCLIP-seq yönteminin güvenilirliğini doğrular.

Protokol

1. Hücre hattı yapımı

1. Bir PiggyBac vektör pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA ilgi]-(Hygromycin-dirençli) plazmid içine ilgi gen klon bir FLAG-biotin epitop¹³taşıyan^,21 bir FLAG-biotin etiketi rbp erimiş ifade etmek^(FBRBP).
2. BirA enzimini ifade eden bir hücre hattına pBase vektörü ile vektörü ifade eden ^FBRBP'yi Cotransfect²².
   NOT: Bu ^{çalışmada, FB}RBP geni entegre bir BirA ekspresyon vektörü²¹taşıyan fare embriyonik kök hücrelerine (mESCs) geçirilmiştir. Alternatif olarak, ^FBRBP ifade vektörü pBase ve pPiggyBac-BirA-V5 ile birlikte hücrelere cotransfected olabilir.
3. MESC'deki hücreleri jelatinize yemeklerde büyütün ve 37 °C'de %5 CO_2'de mES kültür ortamında(Malzeme Tablosu)koruyun. Higromisin b (100 μg/mL) ile transfected hücreleri seçin 1 hafta.
4. İlaç seçiminden sonra, SDS yükleme tamponu(Tablo 1)ile hasat hücreleri ve sırasıyla flag antikor ve streptavidin-HRP ile genin etiketlenmesi ve ekspresyonu onaylamak için Batı leke²³ kullanın.

2. Çapraz bağlama

1. Plaka ~3 x 10⁶ mES hücreleri 10 cm plaka 1 gün önce böylece hücreler hasat edildiğinde % 70−90 biraraya büyür (~ 5−10 milyon hücre örnek başına).
2. Ortamı vakumla çıkarın. Hücreleri oda sıcaklığında 2 dakika (RT) için %0,25 tripsin-EDTA ile tedavi edin ve trypsini 4 mL taze mESC ortamı ile söndürün. Hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 4 °C'de 3 dk 3 00 x g'da hücreleri santrifüj le aşağı çevirin ve süpernatantı çıkarın.
3. 4 mL soğuk PBS ile hücreleri askıya alın ve çapraz bağlama için hücreleri 10 cm plakaya geri plakalayın. Hücreleri 254 nm UV ışığı ile radyasyonla birbirine bağla (UV çapraz bağlantıcihazını 400 mJ/cm²parametreye göre ayarlayın).
   NOT: Hücre monolayers için, hücreler trypsin tedavisinden önce doğrudan plaka üzerinde UV ışığı ile çapraz bağlantılı olabilir.
4. Çapraz bağlı hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 4 °C'de 3 dk 3 00 x g'da santrifüj ile aşağı doğru çevirin ve süpernatantı çıkarın.
   NOT: Çapraz bağlı hücre peleti kullanıma kadar -80 °C'de saklanabilir.

3. Hücre lisat hazırlığı

1. 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 proteaz inhibitörü kokteyli ve 400 U/mL RNase inhibitörü ile taze olarak desteklenen 500 μL yıkama tamponu A(Tablo 1)içeren hücreleri lyse. Hücreleri 1,5 mL'lik bir RNase içermeyen tüpe aktarın. Hücreleri 30−60 dk boyunca bir rotor üzerinde 4 °C'de hafif bir dönüşle kuluçkaya yatırın.
2. 10 dakika boyunca 37 °C'de 30 μL DNase I ile lysate'yi tedavi edin. 0,5 M EDTA 4 μL ekleyerek reaksiyonu durdurun. Çözünmez peleti 4 °C'de 20 dakika boyunca 12.000 x g aşağı doğru çevirin ve supernatant'ı 1,5 mL'lik yeni bir önceden soğutulmuş tüpe aktarın.
   NOT: Hemen kullanım için, buz üzerinde tutun. Süpernatant hemen kullanılmayacaksa, kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.

4. BAYRAK boncuk hazırlama

1. Taze 1,5 mL'lik bir tüpe numune başına 40 μL bulamaç FLAG boncukekleyin.
2. Boncukları 0,5 mL buz gibi yıkama tamponu A ile hızlıca yıkayın ve 4 °C'de 2 dakika boyunca 3.000 x g aşağı doğru döndürün.
3. Adım 4.2'yi bir kez tekrarlayın. 4 °C'de 2 dk için 3.000 x g ile boncukaşağı çevirin. Arabelleği dar uçlu pipet ucuyla dikkatlice çıkarın. Boncukları çıkarmaktan kaçının.

5. İmmünyağış

1. Hücre lisatını 3.2.adımdan önceden dengelendirilmiş BAYRAK boncuklarına aktarın. Tüm numuneleri 4 °C'de bir silindir çalkalayıcıüzerinde hafifçe döndürün. BAYRAK boncuklarını 2−4 saat veya bir gecede lysate ile kuluçkaya yatırın.
2. 3.000 x g 2 dakika boncuk santrifüj ve supernatant kaldırın.
3. Boncukları 0,5 mL önceden soğutulmuş yıkama tamponu A'yı 4 °C'de bir rotatörde 5 dakika kuluçka ya da 2 dk için 3.000 x g ile çevirin ve süpernatantı çıkarın. Yıkama 1x tekrarlayın.
4. Adım 5.3'te açıklandığı gibi 2x yıkamayı önceden soğutulmuş yıkama tamponu B 0,5 mL ile tekrarlayın(Tablo 1).

6. 3x BAYRAK peptid ile elüsyon

1. 1 mg 3x FLAG peptidini 5 mL yıkama tamponu A ile 200 ng/mL'lik son konsantrasyona eriterek 3x FLAG elüsyonu çözeltisini hazırlayın.
2. 2 dk için 3.000 x g ile adım 5.4 bayrak boncuk aşağı spin. Supernatant dikkatle çıkarın. Supernatant çoğu dar bir uç pipet ucu kullanılarak kaldırılır emin olun.
3. Her numuneye 200 μL 3x FLAG elüsasyon çözeltisi ekleyin. Numuneleri 4 °C'de 30 dk hafif bir dönüşle kuluçkaya yatırın. 3.000 x g2 dakika için BAYRAK boncuk aşağı spin . Supernatants'ı taze tüplere aktarın.
4. 6.2 ve 6.3 adımlarında açıklandığı gibi elütion 2x'i tekrarlayın ve eluentleri bir araya getirin. FLAG-IP'nin verimliliğini kontrol etmek için batı leke analizi veya gümüş boyama için elüentlerin %5'inden tasarruf edin.

7. Streptavidin boncuk hazırlama

1. Her numune için 50 μL streptavidin boncuk bulamacı hazırlayın. 30 s için bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve bir pipet ucu ile supernatant kaldırın.
2. Boncukları 0,5 mL buz gibi yıkama tamponu A ile hızlıbir şekilde yıkayın ve 30 s'lik manyetik standla boncukları toplayın.
3. Yıkama 1x tekrarlayın. Yıkamadan sonra supernatant çıkarın.

8. Biotin afinite arınma

1. Havuzlu eluentleri adım 6.4'ten streptavidin boncuklarına 7.3 adımdan aktarın ve numuneleri 4 °C'de 1−3 saat veya bir gece boyunca hafifçe döndürün.
2. 30 s için bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Boncukları 5 dakika boyunca RT'de hafif çetreleyerek 500 μL yıkama tamponc(Tablo 1)ile yıkayın.
3. Manyetik standı ile boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. 5 dakika BOYUNCA RT'de dönerek boncukları 500 μL yıkama tamponu D(Tablo 1)ile yıkayın.
4. Manyetik standı ile boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Boncukları 500 μL buz gibi PNK tamponuyla hızlıca yıkayın (Tablo 1).

9. Kısmi RNA sindirimi

1. MNase reaksiyon arabelleği ile MNase 10⁵kat seyreltme olun (Tablo 1). Her numuneye 100 μL MNase çözeltisi ekleyin. 10 dakika boyunca 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) olarak ayarlanmış bir termal karıştırıcı ile 37 °C'deki boncukları girdaplayın, 30 s'lik manyetik standla boncukları toplayın ve süpernatantı çıkarın.
   NOT: MNase konsantrasyonu farklı RNA bağlayıcı proteinler için optimize edilmelidir. RNA'ları 30−50 nt parçalara sığdırabilen (son kitaplığın ekleme boyutuna göre belirlenir) MNase konsantrasyonu en uygun uymaktadır.
2. Boncukları 2x'i 500 μL buz gibi PNK+EGTA tamponuile hızlıca yıkayın (Tablo 1). Bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve her yıkama adımı arasında supernatant kaldırın.
3. Boncukları 2x 500 μL yıkama tamponcuğu C ile 5 dakika boyunca RT'de hafif çetren olarak yıkayın. Daha sonra boncukları 500 μL buz gibi PNK tamponuyla hızlıca yıkayın.

10. RNA'nın fosforilasyonunun bozulması

1. Bir buzağı bağırsağı fosfataz (CIP) reaksiyon karışımı ile 8 μL 10x CIP tampon(Tablo Malzemeler), 3 μL CIP enzimve 69 ° L su yapın. Reaksiyon başına toplam hacim 80 μL'dir.
2. Bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve tampon kaldırın. Boncuklara CIP reaksiyon karışımını ekleyin. 10 dk için 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) ayarlanmış bir termal karıştırıcı ile 37 °C'de boncuk girdap.
3. Boncukları 500 μL buz gibi PNK+EGTA tamponuyla hızlıca yıkayın. Boncukları 500 μL buz gibi PNK tamponuyla hızlıca yıkayın.

11. 3' bağlayıcı ligasyonu

1. 4 μL 20 μM 3' linker, 4 μL 10x T4 RNA ligaz tamponu, 4 μL %50 PEG8000, 2 μL T4 RNA ligase 2 (kesilmiş) ve 26 μL su ile 3' linker karışımı yapın. Reaksiyon başına toplam hacim 40 μL'dir.
2. Bir manyetik stand ile adım 10.3 boncuk toplamak ve tampon kaldırın. Boncuklara 3' linker ligation karışımından 40 μL ekleyin. 16 °C'de 16 °C'de 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) olarak ayarlanmış bir termal mikser ile 3 saat veya bir gecede boncukları girdap.
3. Boncukları 500 μL buz gibi PNK+EGTA tamponuyla hızlıca yıkayın. Boncukları 500 μL buz gibi PNK tamponuyla hızlıca yıkayın.

12. PNK tedavisi

1. 4 μL 10x PNK tamponu, 2 μL T4 PNK enzimi, 1 0 mM ATP ve 33 μL su ile PNK karışımı yapın. Reaksiyon başına toplam hacim 40 μL'dir.
2. Bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve tampon kaldırın. Boncuklara 40 μL PNK karışımı ekleyin. 10 dk için 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) ayarlanmış bir termal karıştırıcı ile 37 °C'de boncukları yavaşça girdap.
3. Boncukları 500 μL buz gibi PNK+EGTA tamponu ile hızlıca yıkayın.
4. Boncukları 500 μL buz gibi PNK tamponu yla hızlıca yıkayın. İmmünoenjin verimliliğini doğrulamak için boncukların %5'ini Batı veya gümüş boyama analizine ayırın.

13. RNA yalıtımı

1. Bir manyetik stand ile adım 12.4 boncuk toplamak ve tampon kaldırın. Proteinaz K sindirim tampon200 μL ekleyin (Tablo 1). 37 °C'de 30 dk boncukları 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) olarak ayarlanmış bir termal mikser ile girdap. Manyetik boncukları izole edin ve deney için süpernatant'ı alın.
2. Adım 13.1'den itibaren supernatant'a 400 μL RNA izolasyon reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin, iyice karıştırın ve 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Kloroform 80 μL ekleyin ve iyice karıştırın ve sonra 5 dakika buz üzerinde kuluçka. 10 dk 4 °C için 12.000 x g ile aşağı doğru çevirin.
   NOT: Bu adım kimyasal bir başlık içinde yapılmalıdır.
3. Supernatant alın (~ 500 μL) ve izopropanol iki cilt ekleyin:etanol karışımı (1:1), 3 M sodyum asetat 1/10 hacmi (pH = 5.5), ve glikojen 1 μL. -20 °C'de 2 saat dondurun. 20 dk için 12.000 x g ile 4 °C'de santrifüj.
4. Pelet 2x buz gibi% 70 etanol ile yıkayın. 5 dk için 12.000 x g ile 4 °C'de pelet aşağı çevirin. Supernatant çıkarın ve pelet kuru. RNA'ları 5 μL'lik RNase içermeyen H₂O'da çözün.

14. 5' RNA bağlayıcı ligasyonu

1. 1 μL 10x T4 RNA ligaz tamponu, 0,5 μL BSA (1 μg/μL), 1 00 mM ATP, 1 μL RNa sinhibitör ve 0,5 μL T4 RNA ligaz ile 5'l'lik RNA ligasyon karışımı yapın. Reaksiyon başına toplam hacim 4 μL'dir.
2. RNA'ya 1μL 5' 20 μM RNA bağlantı sını 13.4 adımdan ekleyin, 70 °C'de 2 dakika ısıtarak RNA'yı dennature yapın ve hemen buz üzerinde soğuyun.
3. Adım 14.2'den Itibaren RNA'ya 5' RNA ligasyon karışımını ekleyin. Bir gecede 16 °C'de kuluçkaya yatırın.

15. Ters transkripsiyon

1. Bölüm 13'te açıklandığı gibi RNA'ları arındırın ve RNA'yı 11,5 μL RNase içermeyen su ile eritin.
2. Saflaştırılmış RNA'ya 1 μL 10 μM ters transkripsiyon astarı, 70 °C'de 2 dk ısı ekleyin ve hemen buz üzerinde soğuyun.
3. 4 μL 5x ters transkripsiyon tamponu, 1 0 mM dNTPs 1 μL, 0,1 M DTT 1L, RNase inhibitörü 1 μL ve 0,5 μL ters transkripsiyon(Malzeme Tablosu)ile ters transkripsiyon karışımı yapın. Reaksiyon başına toplam hacim 7.5 μL'dir.
4. RNA'ya 7,5 μL ters transkripsiyon karışımı ekleyin, 50 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın ve 10 dk boyunca 70 °C'de kuluçka ya da reaksiyonu durdurun. 4 °C'de bırakın.

16. PCR amplifikasyon

1. 15 μL 2x PCR ana karışımı(Malzeme Tablosu),15.4 adımdan 5 μL cDNA, 10 μM ileri astar 1(Tablo 2), 0,6 μL 10 μM ters astar 1 (Tablo 2) ve 8.8 μL H₂O ile PCR amplifikasyon karışımı yapın. Toplam hacim 30 μL'dir.
2. CDNA'yı aşağıdaki ayarlarla yükseltin: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (15−20 devir için 2−4 tekrar adımları), 72 °C 2 dk ve 4 °C'de tutun. PCR ürününü %2−3 agarose jel üzerinde çalıştırın. ~100−150 bp'nin DNA'sını kesin, jel ekstraksiyon kiti(Malzeme Tablosu)ile DNA ayıklayın ve 20 μL su ile DNA'yı eleyin.
3. Saflaştırılmış PCR ürününün 3 μL'sini alın, ileri astar 2(Tablo 2) ve ters astar 2 (indeks astarı) ile yükseltin; Tablo 2) dizin dizilerini tanıtmak için beş döngü için adım 16.2'de açıklandığı gibi. 16.2 adımda açıklandığı gibi PCR ürün arındırın.
4. Kitaplığı yüksek iş dizisi sıralama platformuyla sırala.

17. Biyoinformatik analizi

1. Daha önce açıklandığı gibi ticari programları kullanarak veri analizi gerçekleştirin^8.

Sonuçlar

^FbioCLIP-seq prosedürünün şematik gösterimi Şekil 1'degösterilmiştir. FLAG aracılı veya streptavidin aracılı tek adımlı arınma ile karşılaştırıldığında, FLAG-biotin tandem saflaştırma, dolaylı protein-RNA etkileşimlerinin kontaminasyonunu önleyerek hemen hemen tüm saflaştırılmış proteinleri ortadan kaldırmış(Şekil 2). LIN28 ve WDR43 için ^FbioCLIP-seq için temsili sonuçlar Şekil ...

Tartışmalar

Burada, protein-RNA komplekslerinin tandem arınmasını gerçekleştirmek için FLAG-biotin çift etiketleme sisteminden yararlanarak ^FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq yöntemini tanıtıyoruz. FLAG-biotin çift etiketleme sistemi protein-protein ve protein-DNA etkileşimleri^13,21belirlenmesinde güçlü olduğu gösterilmiştir. Burada, bu sistemin proteinlerle etkileşime girerken RNA'ları tanımlamada yüksek özgüllüğün?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
UV crosslinker	UVP	HL-2000 HybrilLinker
Affinity Purification Beads
ANTI-FLAG beads	Sigma-Aldrich	A2220
Streptavidin beads	Invitrogen	112.06D
Reagents
10x PBS	Gibco	70013032
3 M NaOAc	Ambion	AM9740
3 x FLAG peptide	Sigma-Aldrich	F4799
ATP	Sigma-Aldrich	A6559
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016
CIP	NEB	M0290S	CIP buffer is in the same package.
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Gel purification kit	QIAGEN	28704
Glycogen	Ambion	AM9510
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	449172
MNase	NEB	M0247S
NP-40	Amresco	M158-500ML
PMSF	Sigma-Aldrich	10837091001
Porteinase K	TAKARA	9033
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	NEB	0492S
reverse trancriptase (SupperScriptIII)	Invitrogen	18080093
RNA isolation reagent (Trizol)	Invitrogen	15596018
RNase Inhibitor	ThermoFisher	EO0381
RNaseOUT	Invitrogen	10777019
RQ1 Dnase	Promega	M6101
SDS	Sigma-Aldrich	1614363
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
T4 PNK	NEB	M0201S	PNK buffer is in the same package.
T4 RNA ligaes	ThermoFisher	EL0021	T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.
T4 RNA ligase2, truncated	NEB	M0242S	T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25200072
Urea	Sigma-Aldrich	208884
mESC culture medium
DMEM (80%)	Gibco	11965126
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
FCS (15%)	Hyclone
Glutamax (1%)	Gibco	35050061
LIF			purified recombinant protein; 10,000 fold dilution
NEAA (1%)	Gibco	11140050
Nucleoside mix (1%)	Millipore	ES-008-D
Penicillin-Streptomycin (1%)	Gibco	15140122
Kit
DNA gel extraction kit	QIAGEN	28704