플래그-비오틴 탠덤 정화에 의해 중재된 상호 연결 및 면역 침전을 통해 단백질-RNA 상호 작용의 전사-전체 프로파일링

요약

여기서 우리는 포유류 세포에서 RNA 결합 단백질 (RBPs)의 RNA 표적을 결정하기 위하여 플래그 비오틴 탠덤 정제를 가진 ^FbioCLIP-seq에게 불린 수정된 CLIP-seq 프로토콜을 제시합니다.

초록

RNA 및 RNA 결합 단백질 (RBP)은 다중 생물학적 과정을 제어합니다. RNA 및 RBP의 공간 적 및 시간적 배열은 이러한 프로세스의 섬세한 조절에 기초합니다. CLIP-seq(교차 연결 및 면역 침전)라는 전략은 면역 강수량 다음으로 UV 교차 연결과 내인성 단백질-RNA 상호 작용을 포착하기 위해 개발되었습니다. RBP 연구에서 기존의 CLIP-seq 방법의 광범위한 사용에도 불구하고, CLIP 방법은 고품질 항체의 가용성, 코퓨화된 RBP의 잠재적 오염 물질, 동위원소 조작 요구 사항 및 지루한 실험 절차 중 정보의 잠재적 손실에 의해 제한됩니다. 여기서 우리는 플래그 비오틴 태그 탠덤 정화를 사용하여 ^FbioCLIP-seq라는 수정 된 CLIP-seq 방법을 설명합니다. 탠덤 정화 및 엄격한 세척 조건을 통해 거의 모든 상호 작용하는 RNA 결합 단백질이 제거됩니다. 따라서 이러한 공동화된 RBP에 의해 간접적으로 상호 작용하는 RNA도 감소된다. 우리의 ^FbioCLIP-seq 방법은 동위원소 가없고 단백질 특정 항체가 없는 방식으로 SDS-PAGE 및 멤브레인 이송 절차 없이 직접 단백질 바운드 RNA를 효율적으로 검출할 수 있습니다.

서문

RNA 및 RNA 결합 단백질(RBP)은 접합, 번역, 리보솜 생물발생, 후생유전학 적 조절 및 세포 운명 전이^{1,2,3,4,5,6을}포함한 다양한 세포^{공정을제어한다.} 이러한 프로세스의 섬세한 메커니즘은 RNA 및 RBP의 고유한 공간 및 측두화 배열에 따라 달라집니다. 따라서, 분자 수준에서 RNA 조절을 이해하는 중요한 단계는 RBP의 결합 부위에 대한 위치 정보를 공개하는 것이다.

교차 연결 및 면역 강수량(CLIP-seq)이라고 하는 전략은^UV교차 연결과 단백질-RNA 상호 작용을 포착하고 관심 있는 단백질7의 면역 침전을 통해 개발되었다. 방법론의 주요 특징은 RNA 결합 단백질과 UV 조사^8에의해 직접 결합된 RNA 분자(~1Å 내)사이의 공유 교차 링크유도이다. RBP 발자국은 일반적으로 30-60 nt의 해상도를 갖는 CLIP 태그 클러스터링 및 피크 호출에 의해 결정될 수 있습니다. 대안적으로, CLIP의 역전사 단계는 단일 뉴클레오티드 해상도에서 RNA에 단백질 결합 부위를 식별할 수 있는 교차 연결 부위에 대한 인델(삽입 또는 삭제) 또는 대체로 이어질 수 있다. Novoalign 및 CIMS와 같은 파이프라인은 CLIP-seq^8의고처리량 시퀀싱 결과를 분석하기 위해 개발되었습니다. 몇몇 수정된 CLIP-seq 방법은 또한 개별-뉴클레오티드 분해능 교차 연결 및 면역 침전(iCLIP), 향상된 CLIP(eCLIP), irCLIP 및 광액활성 리보뉴클레오시드-향상된 상호 연결 및 면역침전(PAR-CLIP)^{9,10,11,12를}포함하는 제안되었다.

RBP 연구에서 기존의 CLIP-seq 방법을 광범위하게 사용했음에도 불구하고 CLIP 메서드에는 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 지루한 변성 젤 전기포고및 멤브레인 전달 절차는 정보의 손실로 이어질 수 있으며, 제한된 서열 복잡성을 야기할 수 있다. 둘째, 단백질 특이적 항체 기반 CLIP 방법은 단일 표적 단백질 대신 단백질 복합체를 당기고, 이는 코퓨화된 RBP로부터 거짓 양성 단백질-RNA 상호작용으로 이어질 수 있다. 셋째, 항체 기반 전략은 고품질 항체없이 RBP의 연구에 적합하지 않은 이러한 방법의 적용을 가능하게 하는 고품질 항체의 다량이 필요하다. 넷째, 기존의 CLIP 방법은 단백질 바운드 RNA에 라벨을 붙이기 위해 무선 라벨ATP가 필요합니다.

생물학적 단백질에 대한 연쇄상 구도가 높기 때문에 특정 단백질이나 단백질 복합체를 정화하는 매우 강력한 접근법이 됩니다. 포유류 세포에서 자궁극피발성 세균비라 비오틴 리구아제에 의해 인공 펩티드 서열을 운반하는 단백질의 효율적인 생체자극화는 생체내^13에서비오틴 정화를 수행하는 효율적인 전략이다. 플래그-비오틴 태그 탠덤^정화(도 1)를이용하여 ^페토클립-세크(FLAG-Bio틴 매개 Cross-linking 및 Immunop회수 후 고처리량 시퀀싱)라는 수정된 CLIP-seq 방법을 개발하였다. 탠덤 정화 및 엄격한 세척 조건을 통해 거의 모든 상호 작용하는 RBP가 제거됩니다(그림2). 엄격한 세척 조건은 또한 SDS 페이지 와 멤브레인 전송을 우회 할 수 있습니다, 이는 노동 집약적이고 기술적으로 도전이다. 그리고 eCLIP 및 irCLIP과 유사, ^Fbio클립 - 세크 방법은 동위원소가 없습니다. 젤 실행 및 이송 단계를 건너뛰면 정보의 손실을 방지하고, 정통 단백질-RNA 상호 작용을 그대로 유지하며, 라이브러리 복잡성이 증가합니다. 또한, 태그 시스템의 높은 효율은 고품질 항체가 없는 RBP에 적합합니다.

여기서 우리는 포유류 세포에 대한 ^FbioCLIP-seq 프로토콜에 대한 단계별 설명을 제공합니다. 간략하게, 세포는 세포 용해 및 FLAG 면역 침전물 (FLAG-IP)에 선행된 254 nm UV에 의해 교차 연결됩니다. 다음으로, 단백질-RNA 복합체는 비오틴 친화성 포획에 의해 더욱 정제되고 RNA는 MNase와의 부분 소화에 의해 단편화된다. 이어서, 단백질 바운드 RNA는 3'링커로 탈포및 결찰된다. RNA가 PNK로 인포화되고 단백질제 K 소화에 의해 용출된 후에 5' RNA 링클러가 첨가됩니다. 역전사 후, 단백질 바운드 RNA 신호는 PCR에 의해 증폭되고 아가로즈 겔 정화에 의해 정제된다. 두 개의 RBP는 ^FbioCLIP-seq 결과를 예시하기 위해 선택되었습니다. LIN28은 마이크로RNA 성숙, 단백질 번역 및 세포 재프로그래밍^15,16,17에관여하는 잘 특징적인 RNA 결합 단백질이다. WDR43은 리보솜 생체 발생, 진핵 전사 및 배아 줄기 세포 편성^{대조군(14,18)을}조정하기 위해 생각되는 WD40 도메인 함유 단백질이다. 클립-세크와 LIN28에 대한 이전에 보고된 결과와 일치하여, ^FbioCLIP-seq는 마이크로RNA 미르-let7g 및 mRNAs^{16, 19} (그림 3)에서"GGAG"모티브에 LIN28의 결합 부위를 공개합니다. WDR43 ^FbioCLIP-seq는 또한 WDR43의 결합 선호도를 5' 외부 전사 스페이서(5'-ETS)로 확인하였다(도4). 이러한 결과는 ^FbioCLIP-seq 메서드의 신뢰성을 검증합니다.

프로토콜

1. 셀라인 건설

1. 관심 유전자를 PPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA 의 관심]-(히그로마이신 내성) 플라스미드로 복제하여 플래그-비오틴^{에피토프(13,21)를} 탑재하여 플래그-비오틴 태그 융합 RBP(FB RBP)를 발동한다.
2. PBase 벡터를 가진 벡터를 비라^{효소(22)를}발현하는 세포주로 ^의FBRBP 발현 벡터를 코트랜스펙트한다.
   참고: 본 연구에서, ^FBRBP 유전자는 통합BirA 발현^{벡터(21)를}운반하는 마우스 배아 줄기세포(mESC)로 전염되었다. 대안적으로, ^FBRBP 발현 벡터는 pBase 및 pPiggyBac-BirA-V5를 함께 세포로 결합할 수 있다.
3. 젤라틴화된 접시에 mESC에서 세포를 성장시키고 mES 배양배지(재료표)에서37°C에서 5%_CO2로 유지한다. 1주일 동안 히그로마이신 b(100 μg/mL)를 가진 감염된 세포를 선택한다.
4. 약물 선택 후, SDS 로딩버퍼(표 1)에의한 수확 세포를 수확하고, 각각 FLAG 항체 및 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 유전자의 태그 및 발현을 확인하기 위해 서양^{블롯(23)을} 사용한다.

2. 교차 연결

1. 플레이트 ~3 x 10⁶ mES 세포는 실험 1일 전에 10cm 플레이트에 있으므로 수확시 세포가 70-90%로 증가하도록 합니다(샘플당 5~1000만 세포).
2. 진공 상태에서 매체를 제거합니다. 실온(RT)에서 2분 동안 2mL의 트립신-EDTA를 2mL로 처리하고 신선한 mESC 배지의 4mL로 트립신을 담금질한다. 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 이송합니다. 4°C에서 3분 동안 300 x g에서 원심분리로 세포를 회전시키고 상체를 제거합니다.
3. 감기 PBS의 4mL로 세포를 중단하고 교차 연결을 위해 세포를 10cm 플레이트로 다시 플레이트로 플레이트한다. 254nm UV 광(400mJ/cm^2의파라미터로 UV 크로스 링커설정)을 방사선으로 교차 연결합니다.
   참고: 세포 단층의 경우, 세포는 트립신 치료 전에 플레이트에서 직접 UV 빛과 교차 연결할 수 있습니다.
4. 교차 연결된 셀을 15mL 튜브로 이송합니다. 4°C에서 3분 동안 300 x g에서 원심분리로 회전하고 상체를 제거합니다.
   참고: 교차 연결된 세포 펠릿은 사용 전까지 -80°C로 저장할 수 있습니다.

3. 세포 리자테 준비

1. 500 μL의 세척 버퍼 A(표 1)를가진 세포를 lyse 갓 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 프로테아제 억제제 칵테일, 400 U /mL RNase 억제제. 세포를 RNase 가 없는 1.5 mL 튜브로 전송합니다. 4°C에서 부드러운 회전을 가진 로터에 30-60 분 동안 세포를 배양하십시오.
2. 37°C에서 30 μL의 DNase I로 10분 동안 리세이트를 처리합니다. 0.5 M EDTA의 4 μL을 추가하여 반응을 중지합니다. 불용성 펠릿을 4°C에서 20분 동안 12,000x g로 회전시키고 상체를 새로운 프리킬드 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
   참고: 즉시 사용하십시오, 얼음에 보관하십시오. 상체가 즉시 사용되지 않으면 사용 전까지 -80 °C에 보관하십시오.

4. 플래그 비즈 준비

1. 샘플당 40 μL의 슬러리 플래그 비드를 신선한 1.5mL 튜브에 추가합니다.
2. 0.5mL의 얼음 냉세척 버퍼 A로 구슬을 빠르게 씻고 4°C에서 2분 동안 3,000xg씩 회전합니다.
3. 한 번 4.2 단계를 반복합니다. 4°C에서 2분 동안 3,000 x g로 구슬을 회전시합니다. 좁은 끝 파이펫 팁으로 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 구슬을 제거하지 마십시오.

5. 면역 침전

1. 셀 용양을 3.2 단계에서 미리 평형된 플래그 비즈로 옮기습니다. 롤러 셰이커의 모든 샘플을 4°C에서 부드럽게 회전시합니다. 2-4 h 또는 하룻밤 동안 lysate와 플래그 구슬을 배양.
2. 3,000 x g에서 2 분 동안 구슬을 원심 분리하고 상체를 제거합니다.
3. 4°C에서 회전기에서 5분 동안 배양하여 0.5mL의 미리 냉각된 세척 버퍼 A로 구슬을 씻고, 구슬을 3,000 x g로 2분 동안 스핀다운하고 상복부을 제거합니다. 세척을 1x반복합니다.
4. 전냉장 세척 버퍼B(표 1)의0.5mL로 5.3 단계에서 설명된 대로 세척 2x를 반복한다.

6. 3x 플래그 펩타이드를 장착한 용출

1. 3x 플래그 용출 용액을 3x 플래그 용출 용액을 5mL의 워시 버퍼 A로 1 mg의 3x 플래그 펩타이드를 용해하여 최종 농도200 ng/mL로 준비합니다.
2. 2 분 동안 3,000 x g로 5.4 단계에서 플래그 구슬을 회전합니다. 상체를 조심스럽게 제거합니다. 좁은 끝 파이펫 팁을 사용하여 대부분의 상체가 제거되었는지 확인합니다.
3. 각 샘플에 3x FLAG 용출 용액의 200 μL을 추가합니다. 4°C에서 30분 동안 부드러운 회전으로 샘플을 배양합니다. 3,000 x g에서2 분 동안 플래그 구슬을 아래로 회전합니다. 수퍼네티를 신선한 튜브로 옮기.
4. 6.2 및 6.3 단계에 설명된 대로 용출 2x를 반복하고 용출을 함께 풀을 놓습니다. 플래그 IP의 효율성을 확인하기 위해 서양 블롯 분석 또는 실버 염색용 용액의 5%를 저장합니다.

7. 스트렙타비딘 비즈 준비

1. 각 샘플에 대해 스트렙타비딘 비드 슬러리의 50 μL을 준비합니다. 30s용 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 파이펫 팁으로 상퍼를 제거합니다.
2. 0.5mL의 얼음 냉세척 버퍼 A로 구슬을 빠르게 씻고 30초간 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집합니다.
3. 세척을 1x반복합니다. 세척 후 상체를 제거합니다.

8. 비오틴 친화성 정화

1. 풀이 된 용용액을 6.4 단계에서 스트렙타비딘 구슬로 7.3 단계에서 옮기고 샘플을 4°C에서 1-3h 또는 하룻밤 동안 부드럽게 회전시로 옮기다.
2. 30s용 자기 스탠드로 구슬을 수집하고 상체를 제거합니다. 500 μL의 워시 버퍼 C(표 1)로구슬 2x를 5 분 동안 RT에서 부드러운 회전으로 씻으시다.
3. 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 상체를 제거합니다. 5 분 동안 RT에서 회전하여 워시 버퍼 D(표 1)의500 μL로 구슬 2x를 세척합니다.
4. 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 상체를 제거합니다. 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 μL(표 1)로구슬 2x를 빠르게 세척하십시오.

9. 부분 RNA 소화

1. MNase 반응 버퍼(표 1)와MNase의 10^-5배 희석을 합니다. 각 샘플에 100 μL의 MNase 솔루션을 추가합니다. 10분 동안 1,200rpm(5s run, 30s stop)으로 설정된 열 믹서로 37°C에서 구슬을 소용돌이시키고, 30초 동안 자기 스탠드로 구슬을 수집하고 상복부을 제거한다.
   참고: MNase의 농도는 다른 RNA 결합 단백질에 최적화되어야 합니다. 30-50 nt 단편으로 RNA를 소화할 수 있는 MNase 농도(최종 라이브러리의 삽입 크기에 의해 결정)가 최적입니다.
2. 얼음 차가운 PNK +EGTA 버퍼(표 1)의500 μL로 구슬 2x를 빠르게 씻으십시오. 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 각 세척 단계 사이의 상체를 제거합니다.
3. RT에서 5분 동안 부드러운 회전으로 500 μL의 워시 버퍼 C로 구슬 2x를 씻으실 수 있습니다. 그런 다음 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 μL로 구슬 2x를 빠르게 세척합니다.

10. RNA의 탈포시화

1. 10x CIP버퍼(재료표),CIP 효소 3μL, 물 69μL의 8μL과 종아리 내장 인산염(CIP) 반응 혼합을 만드십시오. 총 부피는 반응당 80 μL입니다.
2. 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 버퍼를 제거합니다. 구슬에 CIP 반응 믹스를 추가합니다. 10 분 동안 1,200 rpm (5 s run, 30 s stop)에서 설정된 열 믹서가있는 37 °C에서 구슬을 소용돌이.
3. 얼음 차가운 PNK+EGTA 버퍼 500 μL로 구슬 2x를 빠르게 세척합니다. 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 μL로 구슬 2x를 빠르게 세척하십시오.

11. 3' 링커 합리화

1. 20 μM 3' 링커 4μL, 10x T4 RNA 리구슬 완충제 4μL, 50% PEG8000의 4μL, T4 RNA 리개세 2(잘린) 2μL, 26 μL의 3'링커 믹스를 만듭니다. 총 부피는 반응당 40 μL입니다.
2. 마그네틱 스탠드로 10.3 단계에서 구슬을 수집하고 버퍼를 제거합니다. 3' 링커 계향 믹스의 40 μL을 비드에 추가합니다. 16°C에서 구슬을 1,200rpm(5s 런, 30s 스톱)에서 3시간 또는 1박동안 설정하여 구슬을 소용돌이시다.
3. 얼음 차가운 PNK+EGTA 버퍼 500 μL로 구슬 2x를 빠르게 세척합니다. 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 μL로 구슬 2x를 빠르게 세척하십시오.

12. PNK 치료

1. 10x PNK 버퍼 4μL, T4 PNK 효소 2μL, 10mM ATP 1μL, 33μL의 물과 함께 PNK 믹스를 만듭니다. 총 부피는 반응당 40 μL입니다.
2. 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 버퍼를 제거합니다. 비드에 PNK 믹스 40 μL을 추가합니다. 10 분 동안 1,200 rpm (5 s 실행, 30 s 스톱)에서 설정 된 열 믹서와 37 °C에서 부드럽게 구슬을 소용돌이.
3. 얼음 차가운 PNK+EGTA 버퍼 500 μL로 구슬을 빠르게 세척합니다.
4. 얼음-차가운 PNK 버퍼 500 μL로 구슬을 빠르게 씻으시면 됩니다. 면역 침전의 효율을 확인하기 위해 서양 또는 은 염색 분석을 위한 구슬의 5%를 저장합니다.

13. RNA 격리

1. 자기 스탠드로 12.4 단계에서 구슬을 수집하고 버퍼를 제거합니다. 단백질제 K 소화버퍼(표 1)의200 μL을 추가합니다. 1,200 rpm (5 s 실행, 30 s 정지)에서 설정 된 열 믹서와 37 °C에서 30 분 동안 구슬을 소용돌이. 구슬을 자기적으로 분리하고 실험을 위해 상체를 복용합니다.
2. RNA 격리 시약(재료표)의400μL을 13.1단계에서 상퍼에 넣고, 철저히 섞고, 얼음 위에서 5분 동안 배양한다. 80 μL의 클로로폼을 넣고 철저히 섞은 다음 얼음에 5분 동안 배양합니다. 10 분 4 °C에 대한 12,000 x g로 아래로 회전합니다.
   참고: 이 단계는 화학 적 후드에서 수행해야합니다.
3. 상체(~500 μL)를 복용하고 이소프로판올 믹스(1:1), 3M 나트륨 아세테이트의 1/10 부피(pH = 5.5), 글리코겐 1μL을 추가합니다. 2 시간 동안 -20 °C에서 동결하십시오. 4°C의 원심분리기와 12,000 x g의 20분.
4. 얼음 차가운 70 % 에탄올로 펠릿 2x를 씻으십시오. 펠릿을 4°C에서 5분 동안 12,000 x g로 회전시합니다. 상체를 제거하고 펠릿을 건조. RNA가 없는 H₂O의 5μL로 RNA를 용해하십시오.

14. 5' RNA 링커 합리화

1. 10x T4 RNA 리구효소 버퍼 1μL, BSA의 0.5 μL(1 μg/μL), 10mM ATP1 μL, RNase 억제제 1μL, T4 RNA 리게아제 0.5 μL의 RNA 결찰 혼합물을 만듭니다. 총 부피는 반응당 4μL입니다.
2. 5' 20 μM RNA 링커의 1μL을 1단계13.4에서 RNA에 추가하고, RNA를 70°C에서 2분 동안 가열하여 건조시키고, 얼음에 즉시 냉각한다.
3. 단계 14.2에서 RNA 결찰 믹스를 RNA에 추가합니다. 하룻밤 동안 16 °C에서 배양하십시오.

15. 역전사

1. 섹션 13에 설명된 대로 RNA를 정화하고 RNase 가 없는 물의 11.5 μL로 RNA를 용해한다.
2. 10 μM 역전사 프라이머의 1μL을 정제된 RNA에 넣고 70°C에서 2분 동안 가열하고 얼음에 즉시 식힙니다.
3. 역전사 혼합을 5배 역전사 버퍼 4개, μL 10mDNTP 1μL, 0.1M DTT 1μL, RNase 억제제 1μL, 역전사 0.5μL(재료표)로역전전사 믹스를 만듭니다. 총 부피는 반응당 7.5 μL입니다.
4. RNA에 역전사 믹스의 7.5 μL을 추가하고, 50°C에서 30분 동안 배양하고, 10분 동안 70°C에서 인큐베이션에 의한 반응을 중지한다. 4 °C에서 둡니다.

16. PCR 증폭

1. PCR 증폭 믹스는 2x PCR 마스터 믹스(재료표), 10μM 전방 프라이머 1(표 2), 0.6 μL 10μM 역프라이머1(표 2),H_2O의8.8 μL에서 15μL(재료표), 5μL의 cDNA를 15.4, 0.6 μL로 만듭니다. 총 부피는 30 μL입니다.
2. 다음 설정으로 cDNA를 증폭: 98°C 30, 98°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s(15-20 사이클에 대한 2-4반복 단계), 72°C 2분, 4°C에서 유지. PCR 제품을 2-3% 아가로즈 젤로 실행합니다. ~100-150 bp의 DNA를 잘라내고, 젤 추출키트(재료 표)로 DNA를추출하고, 20 μL의 물로 DNA를 엘루트합니다.
3. 정제된 PCR 제품의 3μL을 복용하고, 앞으로 프라이머2(표 2)및 역프라이머 2(인덱스 프라이머)로 증폭; 표 2) 인덱스 시퀀스를 도입하기 위해 5주기에 대해 16.2 단계에 설명된 바와 같이. 16.2 단계에서 설명된 대로 PCR 제품을 정화합니다.
4. 처리량이 높은 시퀀싱 플랫폼으로 라이브러리를 시퀀싱합니다.

17. 생물정보학 분석

1. 이전에 설명된^8과같이 상용 프로그램을 사용하여 데이터 분석을 수행합니다.

결과

^FbioCLIP-seq 절차의 회로도 표현은 그림 1에표시됩니다. 플래그 매개 또는 스트렙타비딘 매개 1단계 친화성 정화와 비교하여, FLAG-biotin 탠덤 정제는 거의 모든 코퓨화된 단백질을 제거하여 간접 단백질-RNA 상호작용의 오염을 피하였다(도2). LIN28 및 WDR43의 ^FbioCLIP-seq의 대표적인 결과는 그림 3과 그림 4에...

토론

여기서는 플래그-비오틴 이중 태깅 시스템을 활용하여 단백질-RNA 복합체의 탠덤 정제를 수행하기 위해 ^FbioCLIP-seq라는 수정된 CLIP-seq 방법을 소개합니다. FLAG-biotin 이중 태깅 시스템은 단백질 단백질 및 단백질-DNA 상호 작용^13,21을식별하는 데 강력한 것으로 나타났습니다. 여기서 우리는 단백질과 상호 작용하는 RNA를 식별하는 이 시스템의 높은 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
UV crosslinker	UVP	HL-2000 HybrilLinker
Affinity Purification Beads
ANTI-FLAG beads	Sigma-Aldrich	A2220
Streptavidin beads	Invitrogen	112.06D
Reagents
10x PBS	Gibco	70013032
3 M NaOAc	Ambion	AM9740
3 x FLAG peptide	Sigma-Aldrich	F4799
ATP	Sigma-Aldrich	A6559
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016
CIP	NEB	M0290S	CIP buffer is in the same package.
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Gel purification kit	QIAGEN	28704
Glycogen	Ambion	AM9510
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	449172
MNase	NEB	M0247S
NP-40	Amresco	M158-500ML
PMSF	Sigma-Aldrich	10837091001
Porteinase K	TAKARA	9033
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	NEB	0492S
reverse trancriptase (SupperScriptIII)	Invitrogen	18080093
RNA isolation reagent (Trizol)	Invitrogen	15596018
RNase Inhibitor	ThermoFisher	EO0381
RNaseOUT	Invitrogen	10777019
RQ1 Dnase	Promega	M6101
SDS	Sigma-Aldrich	1614363
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
T4 PNK	NEB	M0201S	PNK buffer is in the same package.
T4 RNA ligaes	ThermoFisher	EL0021	T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.
T4 RNA ligase2, truncated	NEB	M0242S	T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25200072
Urea	Sigma-Aldrich	208884
mESC culture medium
DMEM (80%)	Gibco	11965126
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
FCS (15%)	Hyclone
Glutamax (1%)	Gibco	35050061
LIF			purified recombinant protein; 10,000 fold dilution
NEAA (1%)	Gibco	11140050
Nucleoside mix (1%)	Millipore	ES-008-D
Penicillin-Streptomycin (1%)	Gibco	15140122
Kit
DNA gel extraction kit	QIAGEN	28704