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要約

本明細書では、共培養実験に使用できるオリゴデンドロサイトの精製およびオリゴデンドロサイト条件培地の製造のための効率的な方法を示す。

要約

中枢神経系では、オリゴデンドロサイトは軸索髄鞘の役割でよく知られており、塩基伝導を通じて作用電位の伝播を促進する。さらに、オリゴデンドロサイトが髄鞘を越えて、特に可溶性因子の分泌を通じてニューロンと相互作用することを示唆する報告が増えている。ここでは、アストロサイトやミクログリア細胞も含むグリア細胞培養物からオリゴデンドロイアル系統細胞を精製できる詳細なプロトコルを紹介する。この方法は、37°Cでの一晩の揺れに依存しており、上にあるオリゴデンドロア細胞とミクログリア細胞の選択的剥離、および微分接着によるミクログリアの排除を可能にする。次に、オリゴデンドロサイトの培養とオリゴデンドロサイトコンディショ化物(OCM)の生成について説明する。また、共同培養実験で精製された海馬ニューロンに加えてOCM治療またはオリゴデンドロサイトの動態を提供し、オリゴデンドロサイトとニューロンの相互作用を研究する。

概要

オリゴデンドロサイト(OLs)は、軸索の周りにミエリンを包む中枢神経系(CNS)のグリア細胞です。OLsは、オリゴデンドロビ細胞前駆体細胞(OPC)に由来し、胚性CNSの心室領域内で増殖し、完全に成熟したOL(すなわちミエリン形成細胞)1に移行して分化する。初期の発達中には多くのオペックが豊富であるが、成人の脳にも持続し、そこで主要な増殖細胞集団2を表す。単一のOLは、非興奮性セクション(すなわち、ノード間)で複数の軸索を包み込み、各ミエリンループの端は、ミエリン1、3の絶縁特性にとって重要である副線ドメインを形成する軸索に付着する。パラノードの間には、ランヴィエのノードと呼ばれる小さな髄を持たしない隙間があります。これらのノードは電圧ゲート付きナトリウムチャネル(Nav)が豊富で、塩基伝導4を介した作用電位の再生と急速な伝播を可能にする。この緊密な相互作用はまた、AL5、6からの乳酸の神経の取り込みを通じて軸索エネルギーサポートを可能にする。

オリゴデンドログリア系統細胞の成熟と髄鞘形成プロセスは、ニューロン7との相互作用によって厳しく調節される。実際、NG2細胞とも呼ばれるOLsおよびOPCは、神経伝達物質の受容体の配列を発現し、興奮性および抑制性ニューロンからの入力を受け取ることができ、ミエリネーション細胞への増殖および/または分化を引き起こす可能性のあるニューロン活性を感知することができる2。次に、OPC/ORLsは、単独または相乗的に神経調節および神経保護機能8、9、10、11、12を仲介する細胞外空間に微小胞およびタンパク質を分泌する。しかし、オリゴデンドロアリエンス系統細胞とニューロンとの間の相互作用の複数のモードを制御する分子メカニズムはまだ完全に解読されていません。

さらに、いくつかのCNS病理学的状態では、OLsは主に影響を受け、ニューロンとの相互作用を妨げる。例えば、多発性硬化症(MS)では、神経機能障害は、CNSの焦点脱髄によって引き起こされ、軸索損傷および関連する障害蓄積につながる可能性のあるAL喪失に二次的である。ほとんどの場合、13が不十分ですが、再髄鞘化が行われる可能性があります。過去10年間の進歩は、免疫療法の発達のために、再発率を低下させたが、再髄鞘化を促進することは、満たされていないニーズに残っている。そのため、幅広いCNS条件に対する新しい治療法の開発に特に関心のある、ロール、機能、影響についての理解が深まります。

ここでは、OLsの精製と培養の方法について説明します。これにより、その開発と生物学を調節する本質的なメカニズムを正確に調べられます。さらに、このような高度に富んだOLs培養は、オリゴデンドロサイトコンディショナリ培地(OCM)の産生を可能にし、精製ニューロン培養物に加えて、OLs分泌因子が神経細胞生理学および接続性に及ぼす影響を洞察することができる。さらに、精製されたオリゴデンドロサイトとニューロンを組み合わせて、髄鞘形成(re)形成を調節するメカニズムに対処できるインビトロ共培養システムを実装する方法について説明する。

プロトコル

この実験におけるラットのケアと使用は、制度的な方針とガイドライン(UPMC、INSERM、および欧州共同体理事会指令86/609/EEC)に準拠しています。次のプロトコルは、12個の子犬の標準的なごみのために確立されています。

1. フラスコの調製(約5分)

注:滅菌状態の場合、層流フードで解剖の前日に次の手順を実行します。

  1. ポリエチレンミンの5 mL(PEI、100 mg/L、補足ファイル1のプロトコルを参照)を使用して、フィルターキャップ(2つの子犬のための1フラスコ)で150 cm2フラスコ(T150)をコーティングします。
  2. フラスコを一晩4°Cで保管してください。
  3. 解剖の日に滅菌蒸留水で3回コーティングされたフラスコをすすすります。

2. メディアの準備(約10分)

注:無菌状態の場合は、層流フードの手順を実行します。

  1. 500 mLの培養培地を調製し、10%の胎児子牛血清(FCS)およびペニシリンストレプトマイシン(100 IU/mL)を添加したダルベッコの変性イーグル培地(DMEM)からなる。
  2. 50 mLのチューブに酵素消化液20.6mLを調製し、20mLのDMEM、200μLのDNase(50μg/mL)、パパイン200μL(30U/mL)、200μLのLシステイン(0.24mg/mL)からなる。
  3. 0.22 μm フィルターを使用して、メディアをフィルター滅菌します。
  4. 層流フードのメディアは、解剖されるまで室温(RT)に保ちます。

3. 解剖の準備(約10分)

注:無菌状態の場合は、層流フードの手順を実行します。

  1. カルシウムとマグネシウム(PBS;1x)を使用せずに100 mLのリン酸緩衝生理食塩水を調製する。0.22 μm フィルターを使用してフィルター滅菌します。
  2. 45%グルコースの750 μLを補った氷冷1x PBS溶液の50 mLを調製します。0.22 μm フィルターを使用してフィルター滅菌します。
  3. 100 mm ペトリ皿にクリーニング器具用の PBS 1x とティッシュ収穫用の氷冷 PBS-グルコースを使った 60 mm ペトリ皿 3 個を充填します。切除されるまでシャーレを氷の上に置きます。

4. 解剖

注:解剖は、出生後の日(P)2で雄および雌のウィスターラットの子犬から行われます。

  1. 滅菌環境を提供するために、100%エタノールでベンチをきれいにしてください。100%エタノールですべての外科用具を殺菌する。
  2. 子犬の首に70%エタノールをやさしくスプレーします。
  3. 大きな手術用はさみを使用して動物を切断し、氷冷PBSグルコースを含む100mmのペトリ皿に頭を置きます。
  4. 湾曲した鉗子を使用して、動物の頭を目の高さに維持します。小さな手術用はさみを使用して、頭蓋骨の基部に小さな切開を行い、脳の正中線に続いて頭蓋骨を切断します。
  5. 鉗子を使用して、正線から頭蓋骨の2つの部分を穏やかに剥がします。
  6. 小さな外科用スプーンを使用して、頭腔から脳を取り除きます。氷冷PBSグルコースを氷の上に含む60mmペトリ皿に脳を入れます。
  7. ステロ顕微鏡下で見ると、細かい鉗子を使って小脳、脳幹、嗅球を大脳半球から取り除きます。
  8. 2つの大脳半球を分離するために細かい鉗子を使用してください。細かい鉗子を使って髄を剥がしてください。氷の上の60ミリメートルシャーレに大脳皮質を入れます。
    注:氷冷PBSは、正しいメンリング除去のために重要です。

5. 組織解離

注:無菌状態の場合は、層流フードの手順を実行します。

  1. 鋭いメスを使って大脳皮質を細かく刻みます。ミンチ組織を酵素消化媒体を含む50mLチューブに移す。
  2. 5%CO2の下で37°Cの加湿インキュベーターで30分間インキュベートする。
  3. p1000マイクロピペットを使用して酵素消化媒体を穏やかに除去し、皮質組織が50mLチューブの底に残っていることを確認します。
  4. p1000マイクロピペットを使用して1 mLのDMEM-10%FCSを加え、組織を軽くトリチュレートします。
  5. 70 μm フィルターと 1 mL シリンジのピストンを使用して、皮質組織を 50 mL チューブにフィルターします。
    注:DMEM-10%FCSを使用すると、内管壁の残留組織を数回すすることができます。
  6. 50 mL チューブを DMEM-10%FCS で満たします。RTで423 x gで5分間遠心分離し、慎重に上清を取り除き、2 mLのDMEM-10%FCSで細胞ペレットを再栓します。
  7. p1000マイクロピペットで細胞ペレットを軽くトリチュレートし、p200マイクロピペットで軽くトリフラテレートします。細胞懸濁液を適切な量のDMEM-10%FCSで希釈します。
    注: 2 つの頭脳 = 1 つの T150 = 5 mL の DMEM-10%FCS。
  8. T150上の細胞懸濁液のプレート5 mLを1 x 105セル/cm2の密度で。各 T150 に 20 mL の暖かい DMEM-10%FCS を追加します。5%CO2の下で37°Cの加湿インキュベーターでインキュベートする。
  9. 6日間インビトロ(DIV)の後に培養培地の半分を温かいDMEM-10%FCSで更新します。

6. 振る準備

  1. 滅菌条件下で層流フードで揺れる前日に振盪準備を行ってください。
  2. フラスコに新鮮な温かい培養培地を加えて半分の培養培地を更新し、5%CO2の下で37°Cでインキュベートする。

7. 揺れ

  1. PEIで3つの100mmペトリ料理をコーティングします。一晩4°Cで保管してください。
  2. フラスコキャップをパラフィンフィルムで覆い、フラスコをビニール袋に入れます。グリア細胞を含むフラスコを37°Cで250rpmで一晩振る。
    注: 最初の揺れは 8 DIV で実行され、1 つは最大 3 つの異なる揺れを実行できます(タイミングについては図 1を参照)。

8. OL系統細胞の採取と培養

注:これらのステップは、無菌条件下で層流フードで実行する必要があります。

  1. 振盪の翌日に、表1に従ってボッテンシュタイン・サト(BS)培地を準備する。
  2. 無菌蒸留水でペトリ皿を3回塗り付けた洗い流し。
  3. 収穫フラスコの上清は、主にOL系統細胞だけでなく、いくつかのミクログリア細胞を含み、非コーティングされた100mmペトリ皿にそれをプレートする。
    注:このステップは皿表面の差動速付着によってミクログリア細胞の除去を可能にする。
  4. 5%CO2の下で37 °Cの加湿インキュベーターで15分間ペトリ皿をインキュベートします。
  5. 各T150フラスコに25mLの温かい培養液を充填し、2回目の振とれまで5%CO2の下で37°Cの加湿インキュベーターにインキュベートします。
  6. ペトリ皿から上清を新しい非コーティングされた100mmペトリ皿に移し、残留ミクログリア細胞の接着を可能にする。
  7. 5%CO2の下で37 °Cの加湿インキュベーターで15分間ペトリ皿をインキュベートします。
  8. 非付着性OL系統細胞を含む上清を取り除き、50mLチューブ(50mLチューブの2ペトリ皿から上清)に移します。ミクログリアでメッキされたペトリ皿を捨てます。
  9. 423 x gで5分間上清を遠心分離します。慎重に上清を除去し、BS培地の1 mLで細胞ペレットを再サスペンドします。すべてのペレットを一般的な50 mLチューブにプールし、BS培地で10 mLに調整します。
  10. 顕微鏡で細胞密度計数細胞を決定します。
    注: 3 x 10 5 /mL と5x 105/mL の間のセル密度を取得する必要があります。
  11. セル密度が 4 x 105/mL 以上の場合は 20 mL の BS を追加して最終体積を 30 mL にし、セル密度が 4 x 105/mL 未満の場合は 10 mL の BS のみを追加して、最終体積を 20 mL にします。
  12. 10 mLの細胞懸濁液を備えた2つか3つのプレコーティングされた100 mmペトリ皿を皿に盛る。5%CO2の下で37°Cの加湿インキュベーターでインキュベートする。
  13. 後でBS培地2時間のすべてをリフレッシュすることにより、ペトリ皿から破片をクリアします。
    注:クリアの前後に顕微鏡で培養を調べ、細胞密度と破片除去の効率を確認します。
  14. 5%CO2の下で37°Cの加湿インキュベーターでBS培地で2日間インキュベートする。
    注:顕微鏡下で培養を調べます。合流率は70%〜80%でなければなりません。

9. OCM生産

注:滅菌条件下で層流フードでこれらの手順を実行します。

  1. 表2に従ってNB-B27low培地を準備する。
  2. 温かいNB-B27低培地を10mLで培養液を更新します。5%CO2の下で37°Cで加湿インキュベーターで2日間インキュベートする。
  3. OCMを収穫し、すなわち、OL分泌因子を含む上清を有する。0.22 μm フィルタを使用して OCM をフィルター滅菌します。
    注:OCMは4°Cで最大2ヶ月間保存してください。

10. OCM追加

注:ステップは、滅菌条件下で層流フードで行う必要があります。OCMは、以下のプロトコル14に従って調製した精製された海馬ニューロン培養物に加えることができ、そして、24時間を加えて得た、ウリジンおよび5-フルオロデオキシウリジン(5μM)を36時間添加した。

  1. 3 DIVで、抗有糸剤を含むすべてのニューロン培養培地を取り除き、500μLの新鮮な温かいOCMを加えます。
  2. 作りたての温かいNB-B27で3日ごとに半分の培地を更新します。
    注: このようなカルチャは、最大 21 の DIV を維持できます。

11. 精製された海馬ニューロン培養へのOLの添加

注:滅菌条件下で層流フードで次の手順を実行します。ALは、上記と同様に得られた精製された海馬培養物に添加することができる。

  1. 表3に従って共培養培地を準備する。
  2. 70% ~ 80% の合流率で OL 培養を取得します。温かい1x PBSの2 mLでリンス。
  3. 細胞を取り外すには、100mmペトリ皿に0.25%トリプシンの2 mLを加えます。
  4. 5%CO2の下で37°Cの加湿インキュベーターで5分間インキュベートする。
  5. 酵素反応をブロックするためにDMEM-10%FCSの2 mLを加えます。OL系統細胞を含む上清を収穫する。
  6. RTで423 x gで5分間の遠心分離器を慎重に除去し、温かい共培養培地で細胞ペレットを再懸濁し、1.25 x 105細胞/mLの濃度を得た。
  7. 200 μLのニューロン培養液を除去し、24ウェルプレートの細胞懸濁液1ウェルあたり200μL(2.5 x 104細胞/ウェル)を加えることによって、精製された海馬ニューロン培養にOLを加える。
  8. 2~3日ごとに共培養培地の半分をリフレッシュします。
    注: 共カルチャは、最大 24 の DIV を維持できます。

結果

このプロトコルでは、OL系統細胞は、アストロサイトおよびミクログリアを振り払うことによってグリア培養物から精製される。OL培養物の純度および風変わりに関する検査は、グリアマーカー15による免疫染色によって評価することができる。異なるマーカーの発現の分析は、OL培養が主にO4+細胞の90%±4%、85%±7%NG2+細胞、およびPLP

ディスカッション

ここでは、混合グリア培養物から高度に濃縮されたオリゴデンドログリア系細胞培養物を得るための詳細なプロトコルを提供し、先に公表した方法16から適応し、その後のOL条件培地の製造を行う。この振れ技術は高価ではないが、3回繰り返し、また、PDGFαを含むボッテンシュタイン・サト(BS)培地で培養した細胞が増殖するように、高量の精製オールを得るのに最適である?...

開示事項

著者の誰も競合する利益や相反する利益を持っていません。

謝辞

著者らは、レミ・ロンツァーノの原稿編集における賢明なアドバイスに感謝したいと思います。この作品は、ICM、INSERM、NSFへのARSEP財団助成金、ブーヴェ・ラブリュイエールの価格によって資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
5-fluorodeoxyuridineSigmaF0503
B27 supplementThermoFisher17504044
D-(+)-Glucose solutionSigmaG8769
DNase (Deoxyribonuclease I)WorthingtonLS002139
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
Ethanol 100%Sigma32221-M
Ethanol 70%VWR Chemicals83801.360
Fetal Calf SerumThermoFisher10082147
L-cysteineSigmaC7352
NeurobasalThermoFisher21103049
PapainWorthingtonLS003126
Penicillin-StreptomycinThermoFisher15140122
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesiumThermoFisherA1285601
Polyethylenimine(PEI)SigmaP3143
Tetraborate decahydrateSigmaB9876
TrypsinSigmaSigma
UridineSigmaU3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferrin humanSigmaT1147
BSA (Bovine Serum Albumin)SigmaA4161
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
InsulinSigmaI5500
PDGFPeprotechAF-100-13A
Penicillin-StreptomycinThermoFisher15140122
ProgesteroneSigmaP8783
Putrescine dihydrochlorideSigmaP5780
Sodium seleniteSigmaS5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)SigmaT6397
T4 (L-Thyroxine)SigmaT1775
Co-culture media
apo-Transferrin humanSigmaT1147
B27 supplementThermoFisher17504044
BiotinSigmaB4639
BSA (Bovine Serum Albumin)SigmaA4161
CeruloplasminSigma239799
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
HydrocortisoneSigmaH4001
InsulinSigmaI5500
N-Acetyl-L-cysteineSigmaA8199
NeurobasalThermoFisher21103049
Penicillin-StreptomycinThermoFisher15140122
ProgesteroneSigmaP8783
PutrescinSigmaP5780
Recombinant Human CNTFSigma450-13
Sodium seleniteSigmaS5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)SigmaT6397
Vitamin B12SigmaV6629
Tools
0.22 µm filterSartorius514-7010
1 mL syringeTerumo1611127
100 mm Petri dishDutscher193100
15 mL tubeCorning Life Science734-1867
50 mL tubeCorning Life Science734-1869
60 mm Petri dishDutscher067003
70 µm filterMiltenyi Biotec130-095-823
Binocular microscopeOlympusSZX7
Curved forcepsFine Science Tools11152-10
Fine forcepsFine Science Tools91150-20
Large surgical scissorsFine Science Tools14008-14
ScalpelSwann-morton233-5528
ShakerInfors HT
Small surgical scissorsFine Science Tools91460-11
Small surgical spoonBar Naor LtdBN2706
T150 cm2 flask with filter capDutscher190151
Animal
P2 Wistar ratJanvierRjHAn:WI

参考文献

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