Geração de Oligodendrocytes e Oligodendrocyte-Conditioned Medium para Experimentos de Cocultura

Resumo

Aqui, apresentamos um método eficiente para a purificação de oligodendrocytes e produção de meio condicioso oligodendrocyte que pode ser usado para experimentos de cocultura.

Resumo

No sistema nervoso central, os oligodendrocytes são bem conhecidos por seu papel na mielinação de axon, que acelera a propagação de potenciais de ação através da condução saltatória. Além disso, um número crescente de relatórios sugere que os oligodendrocitos interagem com neurônios além da mielinização, notadamente através da secreção de fatores solúveis. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que permite a purificação de células de linhagem oligodendroglial de culturas células gliais também contendo astrócitos e células microgliais. O método conta com tremores noturnos a 37 °C, o que permite o desprendimento seletivo das células oligodendrólais e células microgliais, e a eliminação da microglia por adesão diferencial. Descrevemos então a cultura dos oligodendrocytes e a produção de meio climatizado pelo oligodendrocyte (OCM). Também fornecemos as cinéticas do tratamento oCM ou oligodendrocytes, além de neurônios hipocampais purificados em experimentos de cocultura, estudando interações oligodendrocyte-neurônio.

Introdução

Oligodendrocytes (OLs) são células gliais do sistema nervoso central (CNS) que geram embalagem de mielina em torno de axônios. Os OLs são originários de células precursoras de oligodendrocyte (OPCs) que proliferam dentro das zonas ventriculares do CNS embrionário e depois migram e se diferenciam em OLs totalmente maduros (ou seja, células formadoras de mielina)¹. Os OPCs são abundantes durante o desenvolvimento precoce, mas também persistem no cérebro adulto, onde representam a maior população de células proliferativas². Um único OL enshea vários axônios em seções não excitáveis (ou seja, internodes), e a borda de cada alça de mielina se conecta ao axônio formando o domínio paranodal que é crucial para as propriedades isolantes da mielina^1,3. Entre os desfiles estão pequenas lacunas immielinizadas chamadas os nós de Ranvier. Esses nós são ricos em canais de sódio fechados por tensão (Nav), permitindo a regeneração e rápida propagação de potenciais de ação através da condução saltatória⁴. Essa interação apertada também permite o suporte à energia axonal através da captação neuronal de lactato de OLs^5,6.

O amadurecimento das células de linhagem oligodendroglial e o processo de mielinação são fortemente regulados por suas interações com neurônios⁷. De fato, OLs e OPCs, também chamados de células NG2, expressam uma série de receptores para neurotransmissores, e podem receber entrada de neurônios excitatórios e inibitórios, permitindo que eles detectem atividade neuronal que pode desencadear sua proliferação e/ou diferenciação em células mielinantes². Por sua vez, opcs/OLs secretam microvesicles e proteínas no espaço extracelular que sozinho ou sinergicamente mediam funções neuromodulativas e neuroprotetoras^8,9,10,11,12. No entanto, os mecanismos moleculares que controlam os múltiplos modos de interações entre células de linhagem oligodendroglial e neurônios ainda não foram totalmente decifrados.

Além disso, em várias condições patológicas do CNS, os OLs são afetados principalmente, perturbando assim sua interação com os neurônios. Por exemplo, na Esclerose Múltipla (EM), a disfunção neurológica é causada pela desmistelinação focal no CNS, secundária à perda de OLs que pode levar a danos axonais e acúmulo de incapacidade relacionada. A remielinização pode ocorrer, embora insuficientemente na maioria dos casos¹³. O progresso na última década, devido ao desenvolvimento de imunoterapias, reduziram a taxa de recaída, mas promover a remielinização permanece até o momento uma necessidade não atendida. Como tal, uma melhor compreensão do papel, funções e influências das OLs é de particular interesse para o desenvolvimento de novas terapias para um amplo espectro de condições de CNS.

Aqui, descrevemos os métodos de purificação e cultura das OLs. Isso permite o exame preciso de mecanismos intrínsecos que regulam seu desenvolvimento e biologia. Além disso, tais culturas altamente enriquecidas de OLs permitem a produção de meio com condições de oligodendrocito (OCM), que pode ser adicionado às culturas de neurônios purificados para obter uma visão do impacto de fatores secretos do OLs na fisiologia neuronal e conectividade. Além disso, descrevemos como implementar um sistema de co-cultura in vitro onde oligodendrocitos purificados e neurônios são combinados, permitindo abordar os mecanismos que regulam (re)mielinação.

Protocolo

O cuidado e o uso de ratos neste experimento estão em conformidade com políticas e diretrizes institucionais (UPMC, INSERM e Diretiva do Conselho Comunitário Europeu 86/609/CEE). O seguinte protocolo é estabelecido para uma ninhada padrão de 12 filhotes.

1. Preparação dos frascos (~5 min)

NOTA: Realize as seguintes etapas no dia anterior à dissecção em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.

1. Cubra os frascos de 150 cm² (T150) com tampa de filtro (1 frasco para 2 filhotes) utilizando 5 mL de polietileimina (PEI, 100 mg/L, consulte protocolo no Arquivo Complementar 1).
2. Armazene os frascos a 4 °C durante a noite.
3. Frascos revestidos de enxágue 3 vezes com água destilada estéril no dia da dissecção.

2. Preparação da mídia (~10 min)

NOTA: Realize os passos em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.

1. Prepare 500 mL de meio cultural, composto pelo meio de Águia modificado (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% do soro fetal de bezerro (FCS) e penicilina-estreptomicina (100 UI/mL).
2. Prepare 20,6 mL do meio de digestão enzimática em um tubo de 50 mL, composto por 20 mL de DMEM, 200 μL de DNase (50 μg/mL), 200 μL de mamão (30 U/mL) e 200 μL de L-cysteine (0,24 mg/mL).
3. Filtrar-esterilizar a mídia usando um filtro de 0,22 μm.
4. Mantenha a mídia no capô de fluxo laminar à temperatura ambiente (RT) até dissecção.

3. Preparação para dissecção (~10 min)

NOTA: Realize os passos em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.

1. Prepare 100 mL de sálina tampão de fosfato sem cálcio e magnésio (PBS; 1x). Esterilizar o filtro usando um filtro de 0,22 μm.
2. Prepare 50 mL de solução PBS gelada 1x complementada com 750 μL de 45% de glicose. Esterilizar o filtro usando um filtro de 0,22 μm.
3. Encha uma placa de petri de 100 mm com 1x PBS para instrumentos de limpeza e três pratos petri de 60 mm com pbs-glicose gelada para colheita de tecidos. Coloque as placas de petri no gelo até dissecar.

4. Dissecção

NOTA: A dissecação é realizada entre filhotes de rato Wistar masculino e feminino no dia pós-natal (P) 2.

1. Para proporcionar um ambiente estéril, certifique-se de limpar o banco com 100% de etanol. Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas com 100% de etanol.
2. Pulverizar suavemente o pescoço do filhote com 70% de etanol.
3. Use uma tesoura cirúrgica grande para decapitar o animal e colocar a cabeça em uma placa de Petri de 100 mm contendo pbs-glicose gelada.
4. Use fórceps curvos para manter a cabeça do animal no nível dos olhos. Use uma pequena tesoura cirúrgica para fazer uma pequena incisão na base do crânio e corte o crânio seguindo a linha média cerebral.
5. Use fórceps para retirar suavemente as duas partes do crânio da linha média.
6. Use uma pequena colher cirúrgica para remover o cérebro da cavidade da cabeça. Coloque o cérebro em uma placa de Petri de 60 mm contendo pbs-glicose gelada no gelo.
7. Visualizando um steromicroscópio, use fórceps finos para remover o cerebelo, o tronco cerebral e lâmpadas olfativas dos hemisférios cerebrais.
8. Use fórceps finos para separar os dois hemisférios cerebrais. Use fórceps finos para descascar as meninges. Coloque os cortices cerebrais em uma placa de petri de 60 mm no gelo.
   NOTA: O PBS gelado é fundamental para a remoção correta de meninges.

5. Dissociação tecidual

NOTA: Realize os passos em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.

1. Use um bisturi afiado para cortar finamente os cortices cerebrais. Transfira o tecido picado para um tubo de 50 mL contendo meio de digestão enzimática.
2. Incubar por 30 min em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO₂.
3. Use uma micropipeta p1000 para remover suavemente o meio de digestão da enzima, certificando-se de que o tecido cortical permanece na parte inferior do tubo de 50 mL.
4. Use uma micropipette p1000 para adicionar 1 mL de DMEM-10% FCS e triturar suavemente o tecido.
5. Use um filtro de 70 μm e um pistão de uma seringa de 1 mL para filtrar o tecido cortical em um tubo de 50 mL.
   NOTA: Pode-se enxaguar tecido residual na parede interna do tubo várias vezes com DMEM-10% FCS.
6. Encha o tubo de 50 mL com DMEM-10%FCS. Centrífuga a 423 x g por 5 min na RT. Remova cuidadosamente a supernatant e resuspenda a pelota celular com 2 mL de DMEM-10%FCS.
7. Triturar suavemente a pelota celular com uma micropipeta p1000 e, em seguida, com uma micropipeta p200. Diluir a suspensão celular com o volume apropriado de DMEM-10%FCS.
   NOTA: Dois cérebros = um T150 = 5 mL de DMEM-10%FCS.
8. Placa 5 mL da suspensão celular em um T150 a uma densidade de 1 x 10⁵ células/cm². Adicione 20 mL de DMEM-10%FCS quente a cada T150. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO₂.
9. Renovar metade do meio cultural após 6 dias in vitro (DIV) com DMEM-10%FCS quente.

6. Preparação de agitação

1. Realize a preparação agitada no dia anterior ao tremor em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.
2. Renovar metade do meio cultural adicionando meio de cultura quente fresca ao frasco e incubaa a 37 °C abaixo de 5% de CO₂.

7. Tremendo

1. Cubra três pratos petri de 100 mm com PEI. Guarde-os a 4 °C durante a noite.
2. Cubra o boné com filme de parafina e coloque os frascos em um saco plástico. Frascos de shake contendo células gliais durante a noite a 250 rpm a 37 °C.
   NOTA: Primeiro tremor é realizado em 8 DIV e pode-se realizar até três tremores diferentes (ver Figura 1 para cronometragem).

8. Colagem de células de linhagem e cultura

NOTA: Essas etapas devem ser realizadas em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.

1. No dia seguinte ao tremor, prepare o meio Bottenstein-Sato (BS) de acordo com a Tabela 1.
2. Enxágüe pratos de Petri revestidos 3 vezes com água destilada estéril.
3. O supernatante de frascos de colheita contendo principalmente células de linhaGem OL, mas também algumas células microgliais e emplaca-o em pratos petri não revestidos de 100 mm.
   NOTA: Esta etapa permite a remoção de células microgliais através de adesão rápida diferencial na superfície do prato.
4. Incubar as placas de Petri por 15 min em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO₂.
5. Encha cada frasco T150 com 25 mL de meio de cultura quente e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO₂ até o segundo tremor.
6. Transfira o supernatante das placas de Petri para novas placas de Petri não revestidas de 100 mm para permitir a adesão de células microgliais residuais.
7. Incubar as placas de Petri por 15 min em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO₂.
8. Remova o supernatant, que contém células de linha OL não aderentes, e transfira-o para tubos de 50 mL (supernatante de 2 pratos petri para um tubo de 50 mL). Descarte pratos petri banhados com microglia.
9. Centrífuga o supernatante por 5 min a 423 x g. Remova cuidadosamente a pelota de célula e resuspenda a pelota celular com 1 mL de meio BS. Pool todas as pelotas em um tubo comum de 50 mL e ajuste o volume para 10 mL com meio BS.
10. Determine a densidade celular contando células um microscópio.
    NOTA: Deve ser obtida uma densidade celular entre 3 x 10⁵/mL e 5 x 10⁵/mL.
11. Adicione 20 mL de BS se a densidade celular for maior ou igual a 4 x 10⁵/mL para obter um volume final de 30 mL, ou adicionar apenas 10 mL de BS se a densidade celular for inferior a 4 x 10⁵/mL para obter um volume final de 20 mL.
12. Placa de dois ou três pratos de petri pré-revestidos de 100 mm com 10 mL de suspensão celular. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO₂.
13. Limpe os detritos das placas de Petri refrescando todo o meio BS 2 h depois.
    NOTA: Examine a cultura o microscópio antes e depois da limpeza para verificar a densidade celular e a eficiência da remoção dos detritos.
14. Incubar por 2 dias em meio BS em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO₂.
    NOTA: Examine a cultura o microscópio. A confluência deve ser de 70% a 80%.

9. Produção de OCM

NOTA: Realize estas etapas em um capô de fluxo laminar em condições estéreis.

1. Prepare nb-B27low médio de acordo com a Tabela 2.
2. Renovar o meio cultural com 10 mL de meio NB-B27low quente. Incubar por 2 dias em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO₂.
3. Colher o OCM, ou seja, supernatante contendo fatores secretos oL. Filtrar o CM-esterilizador usando um filtro de 0,22 μm.
   NOTA: Armazene OCM a 4 °C por máxima de 2 meses.

10. Adição de OCM

NOTA: As etapas devem ser realizadas em um capô de fluxo laminar em condições estéreis. O CM pode ser adicionado às culturas de neurôniohipocampais purificadas preparadas de acordo com o seguinte protocolo¹⁴, e obtidas adicionando, 24 h após o isolamento, os agentes anti-mitocóticos uridine e 5-fluorodeoxyuridina (5 μM) por 36 h.

1. A 3 DIV, remova todo o meio de cultura do neurônio contendo agentes antimitóticos e adicione 500 μL de OCM fresco quente.
2. Renovar metade do meio a cada 3 dias com RN-B27 recém-feito quente.
   NOTA: Tais culturas podem ser mantidas até 21 DIV.

11. Adição de OL à cultura purificada do neurônio hipocampal

NOTA: Realize as seguintes etapas em um capô de fluxo laminar em condições estéreis. OLs podem ser adicionados às culturas hipocampais purificadas obtidas da mesma forma descrita acima.

1. Prepare o meio de cocultura de acordo com a Tabela 3.
2. Recupere a cultura OL em 70% a 80% de confluência. Enxágüe com 2 mL de PBS quente 1x.
3. Para separar as células, adicione 2 mL de 0,25% de trypsin a uma placa de Petri de 100 mm.
4. Incubar por 5 min em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO₂.
5. Adicione 2 mL de DMEM-10% FCS para bloquear a reação enzimática. Colher o supernatante contendo células de linhagem OL.
6. Centrífuga a 423 x g por 5 min na RT. Remova cuidadosamente o supernatant e resuspenda a pelota celular em meio de cocultura quente para obter uma concentração de 1,25 x 10⁵ células/mL.
7. Adicione OL à cultura purificada dos neurônios hipocampais removendo 200 μL do meio de cultura do neurônio e adicionando 200 μL de suspensão celular por poço (2,5 x 10⁴ células/poço) de uma placa de 24 poços.
8. Refrescar metade do meio de cocultura a cada 2-3 dias.
   NOTA: As coculturas podem ser mantidas até 24 DIV.

Resultados

Neste protocolo, as células de linhagem OL são purificadas das culturas gliais, sacudindo astrócitos e microglia. Pureza e exame adesivo das culturas OL podem ser avaliados por imunomanchas com marcadores gliais¹⁵. A análise da expressão de diferentes marcadores indicou que as culturas ol eram principalmente pré-OLs com 90% ± 4% das células O4^+, 85% ± 7% NG2⁺ células, e 4,7% ± 2,1% das células PLP^+, enquanto 7,2% ± 2,5%...

Discussão

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para obter culturas de linhagem oligodendroglial altamente enriquecidas a partir de culturas gliais mistas, adaptadas de um método¹⁶publicado anteriormente , e a produção subsequente de meio sedél condicionado. Esta técnica de agitação não é cara, pode ser repetida três vezes e é ideal para obter alta quantidade de OLs purificados, como células cultivadas em bottenstein-Sato (BS) meio contendo PDGFα proliferam. As células gliais são preparadas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
B27 supplement	ThermoFisher	17504044
D-(+)-Glucose solution	Sigma	G8769
DNase (Deoxyribonuclease I)	Worthington	LS002139
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher	31966021
Ethanol 100%	Sigma	32221-M
Ethanol 70%	VWR Chemicals	83801.360
Fetal Calf Serum	ThermoFisher	10082147
L-cysteine	Sigma	C7352
Neurobasal	ThermoFisher	21103049
Papain	Worthington	LS003126
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium	ThermoFisher	A1285601
Polyethylenimine(PEI)	Sigma	P3143
Tetraborate decahydrate	Sigma	B9876
Trypsin	Sigma	Sigma
Uridine	Sigma	U3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferrin human	Sigma	T1147
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	A4161
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher	31966021
Insulin	Sigma	I5500
PDGF	Peprotech	AF-100-13A
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
Progesterone	Sigma	P8783
Putrescine dihydrochloride	Sigma	P5780
Sodium selenite	Sigma	S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)	Sigma	T6397
T4 (L-Thyroxine)	Sigma	T1775
Co-culture media
apo-Transferrin human	Sigma	T1147
B27 supplement	ThermoFisher	17504044
Biotin	Sigma	B4639
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	A4161
Ceruloplasmin	Sigma	239799
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher	31966021
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Insulin	Sigma	I5500
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A8199
Neurobasal	ThermoFisher	21103049
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
Progesterone	Sigma	P8783
Putrescin	Sigma	P5780
Recombinant Human CNTF	Sigma	450-13
Sodium selenite	Sigma	S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)	Sigma	T6397
Vitamin B12	Sigma	V6629
Tools
0.22 µm filter	Sartorius	514-7010
1 mL syringe	Terumo	1611127
100 mm Petri dish	Dutscher	193100
15 mL tube	Corning Life Science	734-1867
50 mL tube	Corning Life Science	734-1869
60 mm Petri dish	Dutscher	067003
70 µm filter	Miltenyi Biotec	130-095-823
Binocular microscope	Olympus	SZX7
Curved forceps	Fine Science Tools	11152-10
Fine forceps	Fine Science Tools	91150-20
Large surgical scissors	Fine Science Tools	14008-14
Scalpel	Swann-morton	233-5528
Shaker	Infors HT
Small surgical scissors	Fine Science Tools	91460-11
Small surgical spoon	Bar Naor Ltd	BN2706
T150 cm2 flask with filter cap	Dutscher	190151
Animal
P2 Wistar rat	Janvier	RjHAn:WI