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요약

본 명세서에서, 우리는 올리고엔드로시트의 정제 및 공동 배양 실험에 사용될 수 있는 올리고엔드로시테 컨디셔닝 배지의 생산을 위한 효율적인 방법을 전시한다.

초록

중추 신경계에서 올리고엔드로시트는 축삭 수초화에서 자신의 역할로 잘 알려져 있으며, 이는 염전을 통해 행동 잠재력의 전파를 가속화합니다. 더욱이, 보고의 증가 수는 oligodendrocytes가 특히 가용성 요인의 분비를 통해, myelination를 넘어 뉴런과 상호 작용한다는 것을 건의합니다. 여기에서, 우리는 또한 성상 세포 및 microglial 세포를 포함하는 신경교 세포 배양에서 oligodendroglial 계보 세포의 정제를 허용하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 37 °C에서 하룻밤 흔들림에 의존, 이는 오버 리올리고겐드로글리알 세포와 미세 교만 세포의 선택적 분리를 허용, 차등 접착에 의해 미세 글리아의 제거. 그런 다음 올리고엔드로시트의 문화와 올리고엔드로시테(oligodendrocyte) 조절 배지(OCM)의 생산을 설명합니다. 우리는 또한 공동 문화 실험에서 정제 된 해마 뉴런에 추가 된 OCM 치료 또는 올리고 덴 드 로시테의 역학을 제공, 올리고 덴 드 로시테 - 뉴런 상호 작용을 연구.

서문

올리고엔드로시트(OLs)는 축삭 주위의 미엘린을 생성하는 중추신경계(CNS)의 신경교 세포이다. 올Ls는 배아 CNS의 심실 영역 내에서 증식한 후 완전히 성숙한 올(즉, 미엘린 형성 세포)로 이동하고 분화하는 올리고엔드로시테 전구체 세포(OPCs)에서 유래합니다1. OPCs는 초기 발달 도중 풍부합니다, 그러나 또한 중요한 증식 세포 인구를 대표하는 성인 두뇌에서 지속합니다2. 하나의 OL은 흥분되지 않는 단면(즉, 인터노드)에서 다중 축삭을 ensheathes하고, 각 myelin 루프의 가장자리는 미엘린1,3의절연 특성에 중요한 편집증 도메인을 형성하는 축삭에 부착된다. 파라노드 사이에는 Ranvier의 노드라고 불리는 작은 미수화 된 간격이 있습니다. 이러한 노드는 전압 게이트 나트륨 채널 (Nav)이 풍부하여 염전도4를통해 작용 전위를 재생하고 신속하게 전파 할 수 있습니다. 이 단단한 상호 작용은 또한 OLs5,6에서젖산의 신경 관내 섭취를 통해 축축한 에너지 지원을 가능하게 합니다.

올리고드로글리알 혈통 세포와 수레화 과정의 성숙은 뉴런과의 상호 작용에 의해 엄격하게 조절된다7. 실제로, NG2 세포라고도 불리는 OPC와 OPCs는 신경 전달 물질에 대한 수용체의 배열을 발현하고, 흥분성 및 억제 뉴런으로부터 입력을 수신할 수 있어, 이들의 증식 및/또는 분화 세포를 분화시킬 수 있는 뉴런 활동을 감지할 수 있도록2. 차례로, OPCs/OLs는 마이크로소포스와 단백질을 세포외 공간으로 분비하며 이는 단독으로 또는 상승적으로 신경조절 및 신경보호 기능을8,9,10,11,12. 그러나, oligodendroglial 혈통 세포와 뉴런 사이 상호 작용의 다중 모드를 통제하는 분자 기계장치는 아직 완전히 해독될 수 있습니다.

더욱이, 몇몇 CNS 병리학 적인 조건에서, 올은 주로 영향을 받습니다, 따라서 뉴런과의 상호 작용을 방해하. 예를 들면, 다발성 경화증에서 (MS), 신경 기능 장애는 축삭 손상 및 관련 무력 축적으로 이끌어 낼 수 있는 CNC에 있는 초점 탈수아비, 이차 적인 OLs 손실에 기인합니다. 레미엘리네이션은 대부분의 경우13. 면역 요법의 발달로 인해 지난 10 년 동안의 진전은 재발률을 감소시키지만 재수elination을 촉진하는 것은 충족되지 않은 필요성으로 남아 있습니다. 이와 같이, OLs 역할, 기능 및 영향의 더 나은 이해는 CNS 조건의 넓은 스펙트럼을 위한 새로운 치료의 발달에 특히 관심있습니다.

여기서, 우리는 올스 정제 및 배양의 방법을 설명합니다. 이를 통해 개발 및 생물학을 규제하는 본질적인 메커니즘을 정밀하게 검사할 수 있습니다. 또한, 이러한 고농축 된 올스 배양은 뉴런 생리학 및 연결에 대한 OLs 분비 요인의 영향에 대한 통찰력을 얻기 위해 정제 된 뉴런 문화에 추가 할 수있는 oligodendrocyte 컨디셔닝 배지 (OCM)의 생산을 허용합니다. 또한, 우리는 정제 된 올리고 엔드 로시테와 뉴런이 함께 결합되어 조절 되는 메커니즘을 해결할 수있는 체외 공동 배양 시스템을 구현하는 방법을 설명합니다 (재)myelination.

프로토콜

이 실험에서 쥐의 관리 및 사용은 기관 정책 및 지침 (UPMC, INSERM 및 유럽 공동체 위원회 지침 86/609/EEC)을 준수합니다. 다음 프로토콜은 12 개의 새끼의 표준 쓰레기에 대해 설정됩니다.

1. 플라스크 준비 (~5 분)

참고: 멸균 조건하에서 층류 후드에서 해부 전날 다음 단계를 수행하십시오.

  1. 폴리에틸렌민 5 mL(PEI, 100 mg/L, 보충 파일 1의프로토콜 참조)을 사용하여 필터 캡(2개 새끼용 플라스크 1개)으로 150 cm2 플라스크(T150)를 코팅합니다.
  2. 플라스크를 밤새 4°C에서 보관합니다.
  3. 해부 당일 멸균 증류수로 플라스크를 3회 헹구어 줍니다.

2. 미디어 준비 (~10분)

참고: 멸균 조건에서 층류 후드에서 단계를 수행합니다.

  1. 500 mL의 배양 배지를 준비, DULbecco의 수정 된 독수리 매체로 구성 (DMEM) 보충 10% 태아 송아지 혈 청의 (FCS) 그리고 페니실린-스트렙토 마이신 (100 IU/mL).
  2. DMEM 20 mL, DNase 200 μL (50 μg/mL), 파페인 200 μL (30 U/mL) 및 L-시스테인 200 μL (0.24 mg/mL)으로 구성된 50 mL 튜브에서 효소 소화 배지 20.6 mL을 준비하십시오.
  3. 0.22 μm 필터를 사용하여 매체를 필터 살균합니다.
  4. 해부 될 때까지 상층 부류 후드에 매체를 실온 (RT)에서 유지합니다.

3. 해부 준비 (~10 분)

참고: 멸균 조건에서 층류 후드에서 단계를 수행합니다.

  1. 칼슘과 마그네슘 (PBS; 1x)없이 인산염 완충 식염수 100 mL를 준비하십시오. 0.22 μm 필터를 사용하여 필터 살균.
  2. 45% 포도당의 750 μL로 보충된 얼음-차가운 1x PBS 용액 50 mL을 준비합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 필터 살균.
  3. 100mm 페트리 접시에 청소 용 1x PBS와 3 개의 60mm 페트리 접시와 얼음차가운 PBS-포도당을 채취하십시오. 해부될 때까지 페트리 접시를 얼음위에 올려 놓습니다.

4. 해부

참고 : 해부는 출생 후 날 (P) 2에서 남성과 여성의 위스타 쥐 새끼에서 수행됩니다.

  1. 멸균 환경을 제공하기 위해 100 % 에탄올로 벤치를 청소하십시오. 100 % 에탄올로 모든 수술 도구를 살균하십시오.
  2. 70% 에탄올로 강아지의 목을 부드럽게 스프레이하세요.
  3. 큰 수술 용 가위를 사용하여 동물을 참수하고 얼음 차가운 PBS -포도당이 들어있는 100mm 페트리 접시에 머리를 놓습니다.
  4. 구부러진 집게를 사용하여 동물의 머리를 눈 높이에서 유지합니다. 작은 수술 가위를 사용하여 두개골 의 기지에서 작은 절개를하고 뇌 중간선을 따라 두개골을 잘라냅니다.
  5. 집게를 사용하여 중간선에서 두개골의 두 부분을 부드럽게 벗깁니다.
  6. 작은 수술 용 숟가락을 사용하여 머리 구멍에서 뇌를 제거하십시오. 얼음에 얼음 차가운 PBS-포도당을 포함하는 60mm 페트리 접시에 뇌를 넣습니다.
  7. 스테로 현미경의 밑에 보기, 뇌반구에서 소뇌, 뇌간 및 후각 전구를 제거하기 위하여 정밀한 집게를 이용하십시오.
  8. 미세 한 집게를 사용 하 여 두 대뇌 반구를 분리 합니다. 수막껍질을 벗기기 위해 미세한 포셉을 사용하십시오. 대뇌 피질 을 얼음에 60mm 페트리 접시에 넣습니다.
    참고: 얼음으로 차가운 PBS는 올바른 수막 제거에 매우 중요합니다.

5. 조직 해리

참고: 멸균 조건에서 층류 후드에서 단계를 수행합니다.

  1. 날카로운 메스를 사용하여 대뇌 피신도를 잘게 자릅니다. 다진 조직을 효소 소화 배지를 함유하는 50 mL 튜브로 옮김.
  2. 37°C에서 5%CO2미만에서 가습된 인큐베이터에서 30분 동안 배양한다.
  3. p1000 마이크로파이펫을 사용하여 피질 조직이 50 mL 튜브의 바닥에 남아 있는지 확인하면서 효소 소화 매체를 부드럽게 제거하십시오.
  4. p1000 마이크로파이펫을 사용하여 DMEM-10% FCS 1mL를 추가하고 조직을 부드럽게 삼분화하십시오.
  5. 70 μm 필터와 1 mL 주사기의 피스톤을 사용하여 피질 조직을 50 mL 튜브로 필터링하십시오.
    참고 : 하나는 DMEM-10 % FCS로 내부 튜브 벽에 잔류 조직을 여러 번 헹구을 수 있습니다.
  6. DMEM-10% FCS로 50 mL 튜브를 채웁니다. RT에서 5분 동안 423 x g의 원심분리기를 조심스럽게 제거하고 DMEM-10% FCS 2 mL로 세포 펠릿을 다시 놓습니다.
  7. p1000 마이크로파이펫으로 세포 펠릿을 부드럽게 삼각측량한 다음 p200 마이크로파이펫을 사용하십시오. DMEM-10% FCS의 적절한 부피로 셀 현탁액을 희석합니다.
    참고: 두 개의 뇌 = 하나의 T150 = DMEM-10% FCS의 5mL.
  8. 1 x 105 셀 /cm2의밀도에서 T150에 셀 현탁액의 플레이트 5 mL. 각 T150에 따뜻한 DMEM-10% FCS 20mL를 추가합니다. 37°C에서 5%CO2미만의 가습 인큐베이터에서 배양한다.
  9. 따뜻한 DMEM-10% FCS로 6일 간 체외(DIV) 후 배양 배지의 절반을 갱신한다.

6. 떨기 준비

  1. 멸균 조건하에서 층류 후드에서 흔들기 전에 하루에 흔들리는 준비를 수행하십시오.
  2. 신선한 따뜻한 배양 배지를 플라스크에 첨가하여 배양 배지의 절반을 갱신하고 5%CO2미만에서 37°C에서 배양한다.

7. 흔들림

  1. PEI와 세 100mm 페트리 접시를 코트. 밤새 4°C에서 보관하십시오.
  2. 플라스크 캡을 파라핀 필름으로 덮고 플라스크를 비닐 봉지에 넣습니다. 37°C에서 250 rpm에서 밤새 신경교 세포를 함유한 플라스크를 흔들어 주세요.
    참고: 첫 번째 흔들림은 8 DIV에서 수행되며, 하나는 최대 세 개의 서로 다른 흔들림을 수행할 수 있습니다(타이밍은 그림 1 참조).

8. OL 혈통 세포 수확 및 배양

참고: 이러한 단계는 멸균 조건하에서 층류 후드에서 수행해야 합니다.

  1. 흔들은 다음 날, 표 1에따라 보텐슈타인-사토(BS) 배지를 준비한다.
  2. 멸균 증류수로 페트리 접시를 3회 헹구어 줍니다.
  3. 수확 플라스크의 상급은 주로 OL 혈통 세포뿐만 아니라 일부 미세 교세포를 함유하고 코팅되지 않은 100mm 페트리 접시에 접시.
    참고 : 이 단계는 접시 표면에 차동 빠른 접착을 통해 미세 교세포의 제거를 할 수 있습니다.
  4. 5%CO2하에서 37°C에서 가습 된 인큐베이터에서 15 분 동안 페트리 접시를 배양한다.
  5. 각 T150 플라스크를 25 mL의 따뜻한 신선하게 제조된 배양 배지로 채우고 2차 흔들림까지 5%CO2 미만의 37°C에서 가습된 인큐베이터에 인큐베이터를 배양한다.
  6. 페트리 접시에서 상류감을 새로운 코팅되지 않은 100mm 페트리 접시로 옮겨 잔류 미세 교만 세포의 부착을 허용합니다.
  7. 5%CO2하에서 37°C에서 가습 된 인큐베이터에서 15 분 동안 페트리 접시를 배양한다.
  8. 부착되지 않은 OL 혈통 세포를 포함하는 상급체를 제거하고 50 mL 튜브로 옮김 (50 mL 튜브의 경우 2 페트리 접시에서 상판)으로 옮니다. 마이크로글리아로 도금된 페트리 접시를 버리십시오.
  9. 423 x g에서5 분 동안 상급을 원심 분리기 . 조심스럽게 상류를 제거하고 BS 배지 1 mL로 세포 펠릿을 다시 놓습니다. 일반적인 50 mL 튜브에 모든 펠릿을 풀하고 BS 배지로 볼륨을 10 mL로 조정합니다.
  10. 현미경으로 세포 밀도 계수 세포를 결정합니다.
    참고: 3 x 105/mL과 5 x 105/mL사이의 셀 밀도를 얻어야 합니다.
  11. 셀 밀도가 4 x 10 5/mL보다 높거나30 mL의 최종 부피를 얻으려면 BS의 20 mL를 추가하거나 셀 밀도가 4 x 105/mL 미만인 경우 BS의 10 mL만 추가하여 최종 부피를 20 mL로 얻습니다.
  12. 10 mL의 셀 서스펜션으로 미리 코팅 된 100mm 페트리 접시 2 개 또는 3 개 접시. 37°C에서 5%CO2미만의 가습 인큐베이터에서 배양한다.
  13. 나중에 BS 매체 2 시간 모두 를 상쾌하게하여 페트리 요리의 파편을 지웁히.
    참고 : 세포 밀도와 파편 제거의 효율성을 확인하기 위해 클리어 전후 현미경으로 배양을 검사하십시오.
  14. BS 배지에서 37°C에서 5%CO2미만에서 2일 동안 배양한다.
    참고 : 현미경으로 배양을 검사하십시오. 합류는 70 %에서 80 %여야합니다.

9. OCM 생산

참고: 멸균 조건하에서 층류 후드에서 이러한 단계를 수행합니다.

  1. 표 2에따라 NB-B27low 배지를 준비합니다.
  2. 따뜻한 NB-B27low 배지 10 mL로 배양 배지를 리뉴얼합니다. 37°C에서 5%CO2미만의 가습 된 인큐베이터에서 2 일 동안 배양하십시오.
  3. OCM, 즉 OL 분비 인자를 포함하는 상급자를 수확합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 OCM을 필터 살균합니다.
    참고: OCM을 4°C에서 최대 2개월 동안 보관하십시오.

10. OCM 추가

참고: 단계는 멸균 조건하에서 층류 후드에서 수행해야 합니다. OCM은 다음프로토콜(14)에따라 제조된 정제된 해마 뉴런 배양물을 첨가할 수 있으며, 격리 후 24시간, 항-미소토액제 uridine 및 5-플루오로데옥시우리딘(5 μM)을 36시간 동안 첨가하여 수득하였다.

  1. 3 DIV에서, 항 유사분열제를 함유하는 모든 뉴런 배양 배지를 제거하고 신선한 따뜻한 OCM 500 μL을 첨가한다.
  2. 3일마다 중간 크기의 절반을 신선하게 만든 따뜻한 NB-B27로 리뉴얼합니다.
    참고: 이러한 문화권은 최대 21DIV까지 유지할 수 있습니다.

11. 정제된 해마 뉴런 배양에 OL 첨가

참고: 멸균 조건하에서 층류 후드에서 다음 단계를 수행합니다. 올Ls는 전술한 바와 같은 방식으로 수득된 정제된 해마 배양물을 첨가할 수 있다.

  1. 표 3에따라 공동 배양 배지를 준비한다.
  2. 70% ~ 80% 합류에서 OL 배양을 검색합니다. 따뜻한 1x PBS 2 mL로 헹굽니다.
  3. 세포를 분리하려면 0.25% 트립신 2mL를 100mm 페트리 접시에 넣습니다.
  4. 37°C에서 5%CO2미만의 가습 된 인큐베이터에서 5 분 동안 배양하십시오.
  5. 효소 반응을 차단하기 위해 DMEM-10% FCS 2mL를 추가합니다. OL 혈통 세포를 포함하는 상급체를 수확합니다.
  6. RT에서 5 분 동안 423 x g의 원심 분리기를 조심스럽게 상류를 제거하고 따뜻한 공동 배양 배지에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하여 1.25 x 105 세포 / mL의 농도를 얻습니다.
  7. 24웰 플레이트의 200 μL의 뉴런 배양 배지를 제거하고 웰당 200 μL의 세포 현탁액(2.5 x 104 세포/웰)을 추가하여 정제된 해마 뉴런 배양에 OL을 첨가하였다.
  8. 2-3일마다 공동 배양 배지의 절반을 새로 고칩니다.
    참고: 공동 문화권은 최대 24DIV까지 유지할 수 있습니다.

결과

이 프로토콜에서, OL 혈통 세포는 성상 세포 및 마이크로 글리아를 흔들어 신경교 배양물로부터 정제된다. OL 배양물의 순도 및 자형질 검사는 신경교 마커15로면역 염색함으로써 평가될 수 있다. 상이한 마커의 발현을 분석한 결과, OL 배양액은O4+세포의 90% ±4%, 85% ±7%NG2+ 세포, 4.7% ±2.1%PLP+ 세포의 경우, 7.2% ±2.5%의 세포가GFAP+

토론

여기서, 우리는 혼합 신경교 배양으로부터 고도로 농축된 올리고덴드로글리알 계보 세포 배양체를 얻기 위한 상세한 프로토콜을 제공하며, 이전에 발표된 방법16으로부터적응하고, OL-컨디셔닝 배지의 후속 생산을 제공한다. 이러한 흔들림 기술은 비용이 많이 들이지 않고, 3회 반복될 수 있으며, PDGFα를 함유하는 보텐슈타인-사토(BS) 배지에서 배양된 세포로서 다량의 정제된 올?...

공개

저자 들 중 어느 누구도 경쟁적인 이해관계나 상충하는 이해관계가 없습니다.

감사의 말

저자는 원고 편집에 대한 그의 현명한 조언에 대한 레미 론자노에게 감사드립니다. 이 작품은 ICM, INSERM, NSF에 ARSEP 재단 보조금, 부베 라브루예르 가격에 의해 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
5-fluorodeoxyuridineSigmaF0503
B27 supplementThermoFisher17504044
D-(+)-Glucose solutionSigmaG8769
DNase (Deoxyribonuclease I)WorthingtonLS002139
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
Ethanol 100%Sigma32221-M
Ethanol 70%VWR Chemicals83801.360
Fetal Calf SerumThermoFisher10082147
L-cysteineSigmaC7352
NeurobasalThermoFisher21103049
PapainWorthingtonLS003126
Penicillin-StreptomycinThermoFisher15140122
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesiumThermoFisherA1285601
Polyethylenimine(PEI)SigmaP3143
Tetraborate decahydrateSigmaB9876
TrypsinSigmaSigma
UridineSigmaU3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferrin humanSigmaT1147
BSA (Bovine Serum Albumin)SigmaA4161
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
InsulinSigmaI5500
PDGFPeprotechAF-100-13A
Penicillin-StreptomycinThermoFisher15140122
ProgesteroneSigmaP8783
Putrescine dihydrochlorideSigmaP5780
Sodium seleniteSigmaS5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)SigmaT6397
T4 (L-Thyroxine)SigmaT1775
Co-culture media
apo-Transferrin humanSigmaT1147
B27 supplementThermoFisher17504044
BiotinSigmaB4639
BSA (Bovine Serum Albumin)SigmaA4161
CeruloplasminSigma239799
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
HydrocortisoneSigmaH4001
InsulinSigmaI5500
N-Acetyl-L-cysteineSigmaA8199
NeurobasalThermoFisher21103049
Penicillin-StreptomycinThermoFisher15140122
ProgesteroneSigmaP8783
PutrescinSigmaP5780
Recombinant Human CNTFSigma450-13
Sodium seleniteSigmaS5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)SigmaT6397
Vitamin B12SigmaV6629
Tools
0.22 µm filterSartorius514-7010
1 mL syringeTerumo1611127
100 mm Petri dishDutscher193100
15 mL tubeCorning Life Science734-1867
50 mL tubeCorning Life Science734-1869
60 mm Petri dishDutscher067003
70 µm filterMiltenyi Biotec130-095-823
Binocular microscopeOlympusSZX7
Curved forcepsFine Science Tools11152-10
Fine forcepsFine Science Tools91150-20
Large surgical scissorsFine Science Tools14008-14
ScalpelSwann-morton233-5528
ShakerInfors HT
Small surgical scissorsFine Science Tools91460-11
Small surgical spoonBar Naor LtdBN2706
T150 cm2 flask with filter capDutscher190151
Animal
P2 Wistar ratJanvierRjHAn:WI

참고문헌

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