Génération d’Oligodendrocytes et de médium conditionné par oligodendrocyte s’est conditionné pour les expériences de co-culture

Résumé

Ici, nous affichons une méthode efficace pour la purification des oligodendrocytes et la production de milieu conditionné par oligodendrocyte s’il peut être utilisé pour des expériences de co-culture.

Résumé

Dans le système nerveux central, les oligodendrocytes sont bien connus pour leur rôle dans la myélinisation des axones, qui accélère la propagation des potentiels d’action par conduction saltatoire. En outre, un nombre croissant de rapports suggèrent que les oligodendrocytes interagissent avec les neurones au-delà de la myélinisation, notamment par la sécrétion de facteurs solubles. Ici, nous présentons un protocole détaillé permettant la purification des cellules de lignée oligodendroglial des cultures gliales de cellules contenant également des astrocytes et des cellules microgliales. La méthode repose sur des secousses de nuit à 37 oC, ce qui permet le détachement sélectif des cellules oligodendroglial et des cellules microgliales sus-jacentes, et l’élimination des microglies par adhérence différentielle. Nous décrivons ensuite la culture des oligodendrocytes et la production du milieu oligodendrocyte-conditionné (OCM). Nous fournissons également la cinétique du traitement d’OCM ou des oligodendrocytes s’ajoutent aux neurones hippocampiques purifiés dans des expériences de co-culture, étudiant des interactions oligodendrocyte-neuron.

Introduction

Les oligodendrocytes (OL) sont des cellules gliales du système nerveux central (SNC) qui génèrent de la myéline enveloppant autour des axones. Les OL proviennent de cellules précurseurs oligodendrocytes (OPC) qui prolifèrent dans les zones ventriculaires du SNC embryonnaire, puis migrent et se différencient en OL sœurs entièrement matures (c.-à-d. cellules formant la myéline)¹. Les CPVP sont abondants au début du développement, mais persistent également dans le cerveau adulte où ils représentent la population principale de cellules proliérantes². Un seul OL ensheathes plusieurs axones dans des sections non-excitables (c.-à-d., internodes), et le bord de chaque boucle de myéline se fixe à l’axone formant le domaine paranoïaque qui est crucial pour les propriétés isolantes de la myéline^1,3. Entre les paranoïdes se trouvent de petites lacunes non myélinistielles appelées les nœuds de Ranvier. Ces nœuds sont riches en canaux de sodium à rayons de tension (Nav), permettant la régénération et la propagation rapide des potentiels d’action par conduction saltatoire⁴. Cette interaction étroite permet également le soutien de l’énergie axonale par l’apprisesage neuronal du lactate des LO^5,6.

La maturation des cellules de lignée oligodendroglial et le processus de myélinisation sont étroitement réglementés par leurs interactions avec les neurones⁷. En effet, les OL et les CPVP, également appelés cellules NG2, expriment un éventail de récepteurs pour les neurotransmetteurs, et peuvent recevoir l’entrée des neurones excitateurs et inhibiteurs, leur permettant de sentir l’activité neuronale qui peut déclencher leur prolifération et/ou différenciation en cellules myélinisantes². À leur tour, les CPVP/OL sécrètent des microvésicules et des protéines dans l’espace extracellulaire qui seul ou synergiquement médiateur fonctions neuromodulative et neuroprotectrice^8,9,10,11,12. Cependant, les mécanismes moléculaires contrôlant les multiples modes d’interactions entre les cellules de lignée oligodendroglial et les neurones n’ont pas encore été entièrement déchiffrés.

De plus, dans plusieurs conditions pathologiques du SNC, les OL sont principalement affectés, perturbant ainsi leur interaction avec les neurones. Par exemple, dans la sclérose en plaques (SEP), le dysfonctionnement neurologique est causé par la démyélinisation focale dans le SNC, secondaire à la perte de LD qui peut mener aux dommages axonaux et à l’accumulation connexe d’incapacité. La remyélinisation peut avoir lieu, bien qu’insuffisamment dans la plupart des cas¹³. Les progrès de la dernière décennie, dus au développement d’immunothérapies, ont réduit le taux de rechute, mais la promotion de la remyélinisation demeure à ce jour un besoin non satisfait. En tant que tel, une meilleure compréhension du rôle, des fonctions et des influences des CLO est particulièrement intéressante pour le développement de nouvelles thérapies pour un large éventail de maladies du SNC.

Ici, nous décrivons les méthodes de purification et de culture des OL. Cela permet un examen précis des mécanismes intrinsèques régulant leur développement et leur biologie. En outre, ces cultures d’OL fortement enrichies permettent la production de milieu conditionné par oligodendrocyte (OCM), qui peut être ajouté aux cultures de neurones purifiés pour avoir un aperçu de l’impact des facteurs sécrétés par les OL sur la physiologie neuronale et la connectivité. En outre, nous décrivons comment mettre en œuvre un système de co-culture in vitro où les oligodendrocytes purifiés et les neurones sont combinés ensemble, permettant d’aborder les mécanismes de régulation (re)myélinisation.

Protocole

Le soin et l’utilisation des rats dans cette expérience sont conformes aux politiques et directives institutionnelles (DIRECTIVE 86/609/CEE de l’UPMC, de l’INSERM et du Conseil communautaire européen). Le protocole suivant est établi pour une portée standard de 12 chiots.

1. Préparation des flacons (5 min)

REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes la veille de la dissection dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.

1. Enrober les flacons de 150 cm² (T150) d’un bouchon de filtre (1 flacon pour 2 chiots) à l’aide de 5 ml de polyéthylèneinmine (PEI, 100 mg/L, voir protocole dans le fichier supplémentaire 1).
2. Conserver les flacons à 4 oC pendant la nuit.
3. Rincer les flacons enduits 3 fois avec de l’eau distillée stérile le jour de la dissection.

2. Préparation des médias (10 min)

REMARQUE : Effectuez les étapes dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.

1. Préparer 500 ml de milieu de culture, composé du milieu eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété de 10 % de sérum fœtal de veau (FCS) et de pénicilline-streptomycine (100 UI/mL).
2. Préparer 20,6 ml du milieu de digestion enzymatique dans un tube de 50 ml, composé de 20 ml de DMEM, de 200 l de DNase (50 g/mL), de 200 oL de papaïne (30 U/mL) et de 200 l de L-cystéine (0,24 mg/mL).
3. Filtrer-stériliser le support à l’aide d’un filtre de 0,22 m.
4. Gardez le support dans le capot à débit laminaire à température ambiante (RT) jusqu’à la dissection.

3. Préparation à la dissection (10 min)

REMARQUE : Effectuez les étapes dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.

1. Préparer 100 ml de salin tamponné par le phosphate sans calcium et magnésium (PBS; 1x). Filtrer-stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 m.
2. Préparer 50 ml de solution 1x PBS glacée complétée par 750 ll de 45 % de glucose. Filtrer-stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 m.
3. Remplissez un plat Petri de 100 mm avec 1x PBS pour les instruments de nettoyage et trois plats Petri de 60 mm avec du PBS-glucose glacé pour la récolte des tissus. Mettre les boîtes de Pétri sur la glace jusqu’à la dissection.

4. Dissection

REMARQUE : La dissection est effectuée à partir de chiots mâles et femelles de rat Wistar au jour postnatal (P) 2.

1. Afin de fournir un environnement stérile, assurez-vous de nettoyer le banc avec 100% d’éthanol. Stériliser tous les outils chirurgicaux avec 100% d’éthanol.
2. Vaporiser délicatement le cou du chiot avec 70% d’éthanol.
3. Utilisez de gros ciseaux chirurgicaux pour décapiter l’animal et placez la tête dans un plat Petri de 100 mm contenant du PBS-glucose glacé.
4. Utilisez des forceps incurvés pour maintenir la tête de l’animal au niveau des yeux. Utilisez de petits ciseaux chirurgicaux pour faire une petite incision à la base du crâne et couper le crâne en suivant la ligne médiane du cerveau.
5. Utilisez des forceps pour décoller délicatement les deux parties du crâne de la ligne médiane.
6. Utilisez une petite cuillère chirurgicale pour enlever le cerveau de la cavité de la tête. Placez le cerveau dans un plat Petri de 60 mm contenant du PBS-glucose glacé sur la glace.
7. En regardant sous un stéréomicroscope, utiliser des forceps fins pour enlever le cervelet, le tronc cérébral et les ampoules olfactives des hémisphères cérébraux.
8. Utilisez des forceps fins pour séparer les deux hémisphères cérébraux. Utilisez des pinces fines pour décoller les méninges. Mettre les cortices cérébraux dans un plat de 60 mm-petri sur la glace.
   REMARQUE : Le PBS glacé est essentiel pour corriger l’élimination des méninges.

5. Dissociation tissulaire

REMARQUE : Effectuez les étapes dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.

1. Utilisez un scalpel pointu pour hacher finement les cortices cérébraux. Transférer le tissu haché dans un tube de 50 ml contenant un milieu de digestion enzymatique.
2. Incuber pendant 30 min dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO₂.
3. Utilisez une micropipette p1000 pour enlever doucement le milieu de digestion enzymatique tout en vous assurant que le tissu cortical reste au fond du tube de 50 ml.
4. Utilisez une micropipette p1000 pour ajouter 1 ml de DMEM-10% FCS et triturate doucement le tissu.
5. Utilisez un filtre de 70 m et un piston d’une seringue de 1 ml pour filtrer le tissu cortical dans un tube de 50 ml.
   REMARQUE: On peut rincer le tissu résiduel sur la paroi du tube intérieur à plusieurs reprises avec DMEM-10% FCS.
6. Remplissez le tube de 50 ml avec DMEM-10%FCS. Centrifugeuse à 423 x g pendant 5 min à RT. Retirez soigneusement le supernatant et resuspendez le granule de cellules avec 2 mL de DMEM-10%FCS.
7. Triturate doucement le granule de cellules avec une micropipette p1000, puis avec une micropipette p200. Diluer la suspension cellulaire avec le volume approprié de DMEM-10%FCS.
   REMARQUE : Deux cerveaux, un T150 et 5 ml de DMEM-10 %FCS.
8. Plaque 5 ml de la suspension cellulaire sur un T150 à une densité de 1 x 10⁵ cellules/cm². Ajouter 20 ml de DMEM-10%FCS chaud à chaque T150. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO₂.
9. Renouveler la moitié du milieu de culture après 6 jours in vitro (DIV) avec dMEM-10%FCS chaud.

6. Préparation de secousses

1. Effectuer la préparation de secousses le jour avant de secouer dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles.
2. Renouveler la moitié du milieu de culture en ajoutant un milieu de culture frais et chaud dans le flacon et incuber à 37 oC sous 5 % co₂.

7. Secouer

1. Enrober trois plats Petri de 100 mm avec pei. Conservez-les à 4 oC pendant la nuit.
2. Couvrir le bouchon de flacons de film de paraffine et mettre les flacons dans un sac en plastique. Secouer les flacons contenant des cellules gliales pendant la nuit à 250 tr/min à 37 oC.
   REMARQUE : Les premières secousses sont effectuées à 8 DIV et on peut effectuer jusqu’à trois secousses différentes (voir la figure 1 pour le moment).

8. Récolte et culture des cellules de lignée d’OL

REMARQUE : Ces étapes doivent être exécutées dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles.

1. Le lendemain de la secousse, préparer Bottenstein-Sato (BS) moyen selon le tableau 1.
2. Rincer les plats Petri enrobés 3 fois avec de l’eau distillée stérile.
3. Récolte des flacons supernatant contenant principalement des cellules de lignée d’OL mais aussi quelques cellules microgliales et l’aplatons sur des plats Petri non enrobés de 100 mm.
   REMARQUE : Cette étape permet d’enlever les cellules microgliales par l’adhérence rapide différentielle sur la surface du plat.
4. Incuber les plats Petri pendant 15 min dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO₂.
5. Remplir chaque flacon T150 de 25 ml de milieu de culture chaud fraîchement préparé et couver dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % de CO₂ jusqu’à la deuxième secousse.
6. Transférer le supernatant des plats Petri dans de nouveaux plats Petri non enrobés de 100 mm pour permettre l’adhérence des cellules microgliales résiduelles.
7. Incuber les plats Petri pendant 15 min dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO₂.
8. Retirez le supernatant, qui contient des cellules de lignée OL non adhérentes, et transférez-le en tubes de 50 ml (supernatant de 2 plats Petri pour un tube de 50 ml). Jeter les plats Petri plaqués de microglies.
9. Centrifugeuse le supernatant pendant 5 min à 423 x g. Retirez soigneusement le supernatant et resuspendre le granule de cellules avec 1 ml de milieu BS. Mettre toutes les pastilles dans un tube commun de 50 ml et ajuster le volume à 10 ml avec le milieu BS.
10. Déterminer la densité cellulaire en comptant les cellules au microscope.
    REMARQUE : Il faut obtenir une densité cellulaire comprise entre 3 x 10⁵/mL et 5 x 10⁵/mL.
11. Ajouter 20 ml de BS si la densité cellulaire est supérieure ou égale à 4 x 10⁵/mL pour obtenir un volume final de 30 ml, ou ajouter seulement 10 ml de BS si la densité cellulaire est inférieure à 4 x 10⁵/mL pour obtenir un volume final de 20 ml.
12. Assiette deux ou trois plats Petri pré-enduits de 100 mm avec 10 ml de suspension cellulaire. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO₂.
13. Effacer les débris de la vaisselle Petri en rafraîchissant tous les BS moyen 2 h plus tard.
    REMARQUE : Examiner la culture au microscope avant et après le déblaiement pour vérifier la densité cellulaire et l’efficacité de l’enlèvement des débris.
14. Incuber pendant 2 jours en milieu BS dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO₂.
    REMARQUE : Examinez la culture au microscope. La confluence devrait être de 70% à 80%.

9. Production d’OCM

REMARQUE : Effectuez ces étapes dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.

1. Préparer nb-B27low medium selon le tableau 2.
2. Renouveler le milieu de culture avec 10 ml de milieu chaud NB-B27low. Incuber pendant 2 jours dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO₂.
3. Récoltez l’OCM, c’est-à-- c’est-à-d. le supernatant contenant des facteurs sécrétés par les OL. Filtrer-stériliser OCM à l’aide d’un filtre de 0,22 m.
   REMARQUE : Conserver l’OCM à 4 oC pendant un maximum de 2 mois.

10. Ajout d’OCM

REMARQUE : Les étapes doivent être effectuées dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles. L’OCM peut être ajouté aux cultures purifiées de neurones hippocampiques préparées selon le protocole suivant^14,et obtenues en ajoutant, 24 h après l’isolement, l’uridine des agents antimitotiques et 5- fluorodeoxyuridine (5 M) pour 36 h.

1. À 3 DIV, retirez tous les milieux de culture neuronale contenant des agents anti-mitotiques et ajoutez 500 L d’OCM chaud frais.
2. Renouveler la moitié du milieu tous les 3 jours avec nb-B27 chaud fraîchement préparé.
   REMARQUE: De telles cultures peuvent être maintenues jusqu’à 21 DIV.

11. Ajout de l’OL à la culture des neurones hippocampiques purifiés

REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles. Les OL peuvent être ajoutés aux cultures hippocampales purifiées obtenues de la même manière que décrite ci-dessus.

1. Préparer le milieu de la co-culture selon le tableau 3.
2. Récupérez la culture des OL à 70% à 80% de confluence. Rincer à 2 ml de 1x PBS chaud.
3. Pour détacher les cellules, ajouter 2 ml de trypsine de 0,25 % à un plat Petri de 100 mm.
4. Incuber 5 min dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO₂.
5. Ajouter 2 mL de DMEM-10% FCS pour bloquer la réaction enzymatique. Récoltez le supernatant contenant des cellules de lignée d’OL.
6. Centrifugeuse à 423 x g pendant 5 min à RT. Retirez soigneusement le supernatant et suspendez le granule cellulaire dans un milieu de co-culture chaud pour obtenir une concentration de 1,25 x 10⁵ cellules/mL.
7. Ajouter l’OL à la culture des neurones hippocampes purifiés en supprimant 200 L du milieu de culture neuronale et en ajoutant 200 ll de suspension cellulaire par puits (2,5 x 10⁴ cellules/puits) d’une plaque de 24 puits.
8. Rafraîchir la moitié du milieu de co-culture tous les 2-3 jours.
   REMARQUE : Les co-cultures peuvent être maintenues jusqu’à 24 DIV.

Résultats

Dans ce protocole, les cellules de lignée d’OL sont purifiées des cultures gliales en secouant des astrocytes et des microglies. L’examen de pureté et phénotypique des cultures d’OL peut être évalué par immunostaining avec des marqueurs glial^15. L’analyse de l’expression de différents marqueurs a indiqué que les cultures d’OL étaient pour la plupart des pré-OL avec 90 % - 4 % des cellules^O4, 85 % et 7 % de^cellules NG2, e...

Discussion

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour obtenir des cultures cellulaires oligodendroglial hautement enrichies de cellules de lignée de glial, adapté d’une méthode précédemment éditée¹⁶, et la production suivante du milieu OL-conditionné. Cette technique de secousse n’est pas coûteuse, peut être répétée trois fois et est optimale pour obtenir une grande quantité d’OL purifiés, comme les cellules cultivées dans Bottenstein-Sato (BS) milieu contenant PDGF prolifèrent...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
B27 supplement	ThermoFisher	17504044
D-(+)-Glucose solution	Sigma	G8769
DNase (Deoxyribonuclease I)	Worthington	LS002139
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher	31966021
Ethanol 100%	Sigma	32221-M
Ethanol 70%	VWR Chemicals	83801.360
Fetal Calf Serum	ThermoFisher	10082147
L-cysteine	Sigma	C7352
Neurobasal	ThermoFisher	21103049
Papain	Worthington	LS003126
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium	ThermoFisher	A1285601
Polyethylenimine(PEI)	Sigma	P3143
Tetraborate decahydrate	Sigma	B9876
Trypsin	Sigma	Sigma
Uridine	Sigma	U3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferrin human	Sigma	T1147
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	A4161
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher	31966021
Insulin	Sigma	I5500
PDGF	Peprotech	AF-100-13A
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
Progesterone	Sigma	P8783
Putrescine dihydrochloride	Sigma	P5780
Sodium selenite	Sigma	S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)	Sigma	T6397
T4 (L-Thyroxine)	Sigma	T1775
Co-culture media
apo-Transferrin human	Sigma	T1147
B27 supplement	ThermoFisher	17504044
Biotin	Sigma	B4639
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	A4161
Ceruloplasmin	Sigma	239799
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher	31966021
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Insulin	Sigma	I5500
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A8199
Neurobasal	ThermoFisher	21103049
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
Progesterone	Sigma	P8783
Putrescin	Sigma	P5780
Recombinant Human CNTF	Sigma	450-13
Sodium selenite	Sigma	S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)	Sigma	T6397
Vitamin B12	Sigma	V6629
Tools
0.22 µm filter	Sartorius	514-7010
1 mL syringe	Terumo	1611127
100 mm Petri dish	Dutscher	193100
15 mL tube	Corning Life Science	734-1867
50 mL tube	Corning Life Science	734-1869
60 mm Petri dish	Dutscher	067003
70 µm filter	Miltenyi Biotec	130-095-823
Binocular microscope	Olympus	SZX7
Curved forceps	Fine Science Tools	11152-10
Fine forceps	Fine Science Tools	91150-20
Large surgical scissors	Fine Science Tools	14008-14
Scalpel	Swann-morton	233-5528
Shaker	Infors HT
Small surgical scissors	Fine Science Tools	91460-11
Small surgical spoon	Bar Naor Ltd	BN2706
T150 cm2 flask with filter cap	Dutscher	190151
Animal
P2 Wistar rat	Janvier	RjHAn:WI