静脈移植を用いた血管形成術を模したウサギ静脈間位置モデルによる動脈血圧下の内膜過形成の評価

要約

本プロトコルは、静脈移植片を用いた血管形成手術後の静脈内膜過形成を減衰させる戦略を開発するための動脈血圧に静脈を与えることによって、静脈内膜過形成を実験的に作り出すことを目的とする。

要約

静脈移植片は虚血性疾患の再血管形成手術で一般的に自己移植片として使用されてきたが、動脈血圧への暴露による腸内過形成の加速のために、長期の開腸は依然として貧弱である。本プロトコルは、ウサギ頸静脈を周頸動脈に介在させることにより実験的静脈内膜過形成を確立するために設計されている。このプロトコルは、体幹の深部に外科的処置を必要とせず、切開の程度は限られており、これは動物にとって侵襲性が低く、移植後の長期観察を可能にする。この簡単な手順は、研究者が移植された静脈移植片の内膜過形成の進行を減衰するための戦略を調査することを可能にする。このプロトコルを用いて、増殖から収縮状態への血管平滑筋細胞(VSMC)の表現型を制御し、採取した静脈移植片に及ぼすマイクロRNA-145(miR-145)の効果を報告した。VSMCsの表現型変化を通じて移植手術前にmiR-145をトランスデューシングすることにより、静脈移植片の内膜過形成の減衰を確認した。ここでは、血管新生手術における静脈移植片の内膜過形成を減衰させるために使用できる戦略を調査するための、より侵襲性の低い実験プラットフォームを報告する。

概要

アテローム性動脈硬化症による虚血性疾患を経験する患者の数は、世界的に増加しています¹.心血管疾患に対する医学的および外科的療法における現在の進歩にもかかわらず、心筋梗塞などの虚血性心疾患は、罹患率および死亡率の主な原因^{である2。}さらに、四肢への血流の減少を特徴とする末梢動脈疾患は、重篤な四肢虚血を誘発し、患者の約40%が診断後6ヶ月以内に足を失い、死亡率は20%3まで³である。

冠動脈バイパス移植(CABG)や末梢動脈バイパス手術などの再血管形成手術は、虚血性疾患の主要な治療選択肢です。これらの手術の目的は、アテローム硬化性動脈のステノスティックまたは閉塞性病変の遠位部位に向かう十分な血流を提供する新しい血液経路を提供することにある。CABGの内部胸部動脈のような静脈動脈移植片では、より長い開存性が予想されるためバイパス移植片として好ましいが、自家伏状静脈のような静脈移植片は、より高いアクセシビリティおよび入手可能性のために一般的に使用される^4。静脈移植片の弱点は、動脈圧を受けると動脈移植片5の加速による動脈移植片⁵に比べて貧しい開腸率であり、これは静脈移植片疾患⁶に至る。

静脈移植性疾患は、次の3つのステップを経て発症する:1)血栓症;2)内皮過形成;そして3)アテローム性動脈硬化症^7.静脈移植性疾患に対処するために、多くの基礎研究が^{行われている。}これまでのところ、最近の^,ガイドライン^{,99、10、11、12}では、冠動脈または末梢血管新生手術後の二次予防のために、抗血小板および脂質低下療法以外の薬理学的戦略は推奨されていない。^,1112したがって、静脈移植症、特にインティマル過形成を克服するためには、さらなる研究のための関連実験プラットフォームの確立が必要である。

インティタル過形成は、血管平滑筋細胞(VSMC)が増殖し、蓄積し、インティマで細胞外マトリックスを生成する周囲の変化に応じて起こる適応現象である。その結果、移植片アテローム⁷の基礎を提示する。超塑性インティマでは、VSMCは増殖を有し、収縮ではなく生産を「形ノチの変化^」8と呼んだ。静脈移植片病を予防するために静脈移植片のVSMCの表現型を制御する主要な研究目標であり、このトピック⁸に関して数多くの基礎研究が行われている。しかし、VSMC表現型の薬理学的制御を達成することを目的とした無作為化制御臨床研究は、限定的な結果^{を示した13.}さらに、内膜過形成を予防するための標準化された治療法はありません。動物モデル研究を含む、より多くの基礎研究が必要である。

この分野の研究を進めるためには、動脈血圧下で静脈移植片を再現し、長期の術後観察を可能にする動物モデルを確立することが重要です。Carrelら. 頸動脈¹⁴に外部頸静脈を移植するイヌモデルを確立した。この後、胸部または腹部大動脈に生着した下胸部カバ、または大腿動脈^15、16、17に生まれた下胸静脈を含む動脈血圧の変化の生理学的および病理学的影響を調べるため^、16,17種々の静脈移植片が採用されている。これらのモデルは、臨床症例における静脈移植性疾患を模倣するのに適した豚や犬などのより大きな動物で構築された。しかし、特別な外科技術なしで、より低コストで調製できる動物モデルの確立は、生体内のVSMC表現型制御を通じて内膜過形成を減衰するための新しい治療戦略を開発しようとする研究者にとって理想的であろう。当初、ウサギの頸動脈への頸静脈の介入が脳神経外科^18,19,19の分野で導入された。その後、内皮過形成^20,21,21に関する研究に応用した。初期モデルは静脈間の差付けだけで構成されているため、時間を節約できます。さらに、その後の研究は、静脈移植片の調製が内膜過形成²²にも影響を及ら示したことを実証した。Davies et al. ウサギ静脈間位モデル^23,24,24における気球カテーテル損傷が内皮過形成に及ぼす影響を評価した。静脈間付きに加えてバルーンカテーテル損傷は臨床現場に対してより関連性が高かったが、より再現性のあるモデルも望まれていた。このように、江ららは、微分流動環境が内膜過形成に及ぼす影響を調べ、再現可能なモデル²⁵として遠位枝結紮手順を確立した。しかし、彼らは臨床現場で手縫い吻合とは異なるように見える静脈移植片の介在時にカフ技術を採用した。本プロトコルでは、動脈血圧下での内膜過形成を評価するためのウサギ静脈間質モデルの調製に関する再現性、臨床的に関連する、広く利用可能な手順を報告する。

プロトコル

注:動物に対して行われるすべての外科的処置は、実験動物のケアと使用ガイド(www.nap.edu/catalog/5140.html)またはその他の適切な倫理指針に従って行われるべきである。議定書は、先に進む前に、適切な機関で動物福祉委員会によって承認されるべきです。

1. 動物の準備

1. 2.7~3.0kgの雄の白いウサギ(または体の大きさのウサギ)を購入してください。
2. 12時間の明暗サイクルで1週間ウサギを順応させ、手順の前に定期的なウサギのチャウダイエットを与えます。

2. 麻酔と動物の設定

注: 以降の手順はすべて無菌条件下で行う必要があります。手術分野および装置は、使用前に10%ポビドネ-ヨウ素溶液、70%アルコール、または第四級アンモニウム化合物で解毒する必要があります。

1. 耳介静脈を介してペントバルビタールナトリウム(25mg/kg)の静脈投与でウサギを麻酔します。
2. ウサギが強度を失ったことを確認した後、手術台に移し、それをサピーヌの位置に設定します。麻酔マスクで鼻と口を覆います。0.7~1.0%のイソファラン-酸素混合で全身麻酔の投与を開始します。
   注:ウサギが動き始めると、イオブルランの一時的なサージが最大2%有効になります。
3. 電動ヘアクリッパーを使用して、首と肩の毛皮をトリミングします。70%エタノールまたは別の消毒液を噴霧して表面を消毒した後、子宮頸部の残りの毛髪をカミソリで剃る。10%ポビドネヨウ素で外科分野を消毒し、局所麻酔として皮下に塩酸リドカイン(3mg/kg)を投与する。
   注: 気管の繰り返しの動きを調べてください。頸静脈と頸動脈の脈動を観察する。呼吸器および拍動率が低下した場合、麻酔投与の一時的な減少を考慮する。経皮的な酸素飽和度と脈拍数をモニタリングすることも有用である。
   注: プロトコルはここで一時停止することができます。

3. 頸静脈の収穫

注意:局所麻酔薬(リドカインなど)は、皮膚切開を行う前に使用する必要があります。

1. 皮膚切開前に、予防的なエンロフロキサシン(5mg/kg)を皮下に投与する。鎮痛の場合は、0.05mg/kgのブプレノルフィンを1日2回3日間投与する。
   注:体温の低下を避けるために、切開部位の外科スクラブを使用して、動物の体に70%エタノールを吹き付ける代わりに使用することができます。
2. 子宮頸部領域の50〜60mmを縦方向に外科的メスで切開する。皮下組織と筋膜を鈍く解剖し、頸静脈の20〜30mmのセグメントを露出させる。露出した静脈のすべての枝を4-0シルク縫合糸でリゲートします。
3. 内部および外部の頸静脈の周りに2-0シルク縫合糸を置き、次のステップで頸静脈を切開した直後に結紮を行う。
4. 静脈の遠位側の静脈壁(約1mm)を切開します。切り傷から静脈の近位側に向かって2フランス風のバルーンカテーテルを挿入します。頸静脈の遠位部位に2-0シルク縫合糸をリゲートします。
5. 気球を0.2 mLの空気で膨らませる。内皮剥離のためにカテーテルの3つの通路を使用して静脈のインティマを否定する。
   注:この手順は、内皮剥離を引き起こすヒト血管新生手術におけるサフェヌス静脈移植片の不全と同等であると考えられる。
6. 静脈の近位端をリゲートします。収穫するために静脈をカットします。
   注:収穫された静脈の遠位および近位の端を慎重に区別します,動脈への吻合は逆に行われるべきであるので(すなわち、静脈の遠位端は動脈の近位端まで吻合されるべきである)。例えば、ある側からの静脈内カテーテルの挿入はマーカーとして働くだろう。
7. 収穫された頸静脈の治療的操作のために、収穫された静脈を各研究問題のために設計された方法で処置する(例えば、エレクトロポレーション²⁶またはマイクロRNAを静脈に移調するための溶液²⁷で直接浸漬)。
   注:このプロトコルでは、静脈移植片はリン酸緩衝生理食塩分、制御マイクロRNA、およびマイクロRNA-145に浸漬した。プロトコルはここで一時停止することができます。

4. 収穫された頸静脈によって頸動脈を介在させる

1. 20~30mmの角頸動脈を露出させます。動脈を近くの静脈と神経から慎重に分離します。露出した静脈のすべての枝を4-0シルク縫合糸でリゲートします。
2. ヘパリンナトリウムを静脈内投与(200 IU/kg)。3~4分待ちます。
3. 外科的クランプで動脈の近位および遠位端をクランプします。中央の動脈をクランプの間に切ります。切開頸動脈に正常な生理液を近位に注入し、遠位で動脈を遠位に注入する。
   注意:ウサギの頸動脈は収縮する傾向があります。アナストモシスサイトとしてよく歪んだサイトを選択してください。
4. 逆エンドツーエンドの方法で動脈に収穫された静脈を吻合.
   1. 遠位吻合の間に静脈内腔を開いたままにするために遠位から近位方向に収穫された静脈に20G静脈内カテーテルを挿入する。
   2. 8-0を使用して動脈の遠位端に静脈の近位端を吻当ポリプロピレンは縫合糸を中断した。サイトと反対側のサイトに2つのアンカースチを置きます。アンカースチの間の吻合線の上側にスチを追加します。
   3. 動脈と静脈の移植片を逆さまにします。吻合線の残りの部分にスチを追加します。
   4. 静脈から静脈内カテーテルを取り除く。静脈移植片を近位にクランプし、頸動脈を遠位に落とす。静脈移植片が徐々に拡大していることを確認する。
   5. 8-0を使用して動脈の近位端に静脈の遠位端を吻当ポリプロピレンは縫合糸を中断した。動脈を取り除き、吻診部位からの出血を確認する。必要に応じて、止止めのための縫合糸を追加します。
      注:ガーゼと待っている出血部位の穏やかな圧縮は止血のために十分かもしれません。近位脱クランプ後の静脈移植片の即時膨張および強い脈動を確認してください。それが観察されない場合は、手順 4.4.2 ~ 4.4.3 を繰り返す必要があります。
5. 4-0シルク縫合糸で内部頸動脈をリゲートして、不十分な流出状態をシミュレートし、内膜過形成を促進します。
6. 生理傷を生理できれいにしなさい。3-0ポリグラクチン910を用いて創傷を閉じる、層によって。

5. 術後の手順

1. 麻酔を終了し、動物の自発的な呼吸を確認した後、麻酔マスクを削除します。麻酔から回復するまで、動物の状態を頻繁に確認してください。
2. 呼吸機能が完全に回復するまで、動物を他の動物から分離してください。必要に応じて、手動で呼吸をサポートします。完全に回復するまで、動物を大きなグループに戻さない。
3. 麻酔からの回復後の食物と水の摂取量を確認し、適切な栄養サポートを提供します。鎮痛薬(例えば、ブプレノルフィン0.05〜0.2mg/kg)を1日2回3日間投与し、不快感や痛みの徴候がないか確認します。

結果

図1Aは静脈間間術後2週での正常な内膜過形成の代表的な画像(上パネル)を示す。下側のパネルは、内膜過形成を減衰させたマイクロRNA-145装填ポリ(乳酸-コグリコール酸)ナノ粒子(下部パネル)の治療効果を示す。図1Bは、リン酸緩衝食塩水制御(PBS)、コントロールマイクロRNA(Cont-miR)、およびマイクロRNA-145(miR-145)群を用いた対照群間の内皮過形成の比?...

ディスカッション

本プロトコルは、VSMCが増殖から収縮状態に至る表現型を制御し、その後生体内における静脈内外皮過形成の進行を減衰させる様々な分子または遺伝的介入を試験する実験プラットフォームを提供するように設計されている。このモデルを用いて、手術後2週間(図1A)での内膜過形成の調製に成功し、VSMC表現型^26,27を制御するマイクロRNA-145の治療可能性を...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Povidone-iodine solution	Nakakita	872612	Surgical expendables
2-0 VICRYL Plus	Johnson and Johnson	VCP316H	Surgical expendables
4-0 Silk suture	Alfresa pharma	GA04SB	Surgical expendables
8-0 polypropylene suture	Ethicon	8741H	Surgical expendables
Cefazorin sodium	Nichi-Iko Pharmaceutical	6132401D3196	Antibiotics
Fogarty Catheter (2Fr)	Edwards Lifesciences LLC	E-060-2F	Surgical expendables
Heparin	Nipro	873334	Anticoagulant
Intravenous catheter (20G)	Terumo	SR-OT2051C	Surgical expendables
Isoflurane	Fujifilm	095-06573	Anesthesia
Lidocaine hydrochloride	MP Biomedicals	193917	Anesthesia
Pentobarbital sodium	Tokyo Chemical Industry	P0776	Anesthesia