A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arteriellen Blutdruck

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, experimentell venöse Intimhyperplasie zu erzeugen, indem Venen arteriellen Blutdruck für die Entwicklung von Strategien zur Abschwächung venöser Intimhyperplasie nach Revaskularisationsoperationen mit Venentransplantaten ausgesetzt werden.

Zusammenfassung

Obwohl Venentransplantate häufig als autologe Transplantate bei Revaskularisationsoperationen bei ischämischen Erkrankungen verwendet wurden, bleibt die langfristige Durchgängigkeit aufgrund der Beschleunigung der intimalen Hyperplasie aufgrund der Exposition gegenüber arteriellem Blutdruck schlecht. Das vorliegende Protokoll ist für die Etablierung einer experimentellen venösen Intimhyperplasie konzipiert, indem Kaninchenjugularvenen in die ipsilateralen Karotisarterien eingebracht werden. Das Protokoll erfordert keine chirurgischen Eingriffe tief im Körperstamm und das Ausmaß des Schnittes ist begrenzt, was für die Tiere weniger invasiv ist, was eine Langzeitbeobachtung nach der Implantation ermöglicht. Dieses einfache Verfahren ermöglicht es Forschern, Strategien zu untersuchen, um das Fortschreiten der intimalen Hyperplasie der implantierten Venentransplantate abzumildern. Mit diesem Protokoll berichteten wir die Effekte Transduktion von microRNA-145 (miR-145), die bekannt ist, um den Phänotyp der vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) von der proliferativen in den kontraktilen Zustand, in geerntete Venentransplantate zu kontrollieren. Wir bestätigten die Dämpfung der intimalen Hyperplasie von Venentransplantaten durch die Transducing miR-145 vor der Implantationsoperation durch die Phänotypänderung der VSMCs. Hier berichten wir über eine weniger invasive experimentelle Plattform, um die Strategien zu untersuchen, die verwendet werden können, um die intimale Hyperplasie von Venentransplantaten in Revaskularisationsoperationen zu dämpfen.

Einleitung

Die Zahl der Patienten, die aufgrund von Arteriosklerose an ischämischen Erkrankungen leiden, steigt weltweit^{um 1}. Trotz der aktuellen Fortschritte in medizinischen und chirurgischen Therapien für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, ischämische Herzerkrankungen, wie Myokardinfarkt, bleiben eine Hauptursache für Morbidität und Mortalität². Darüber hinaus induziert periphere arterielle Erkrankungen, die durch einen verminderten Blutfluss zu den Gliedmaßen gekennzeichnet sind, eine kritische Gliedmaßen-Ischämie, wobei etwa 40% der Patienten ihre Beine innerhalb von 6 Monaten nach der Diagnose verlieren und die Sterblichkeitsrate bis zu 20%³beträgt.

Revaskularisationsoperationen, wie koronare Bypass-Transplantation (CABG) und Bypass-Chirurgie für periphere Arterien, sind wichtige therapeutische Optionen für ischämische Erkrankungen. Der Zweck dieser Operationen ist es, einen neuen Blutweg zur Verfügung zu stellen, um ausreichend Blutfluss in Richtung der distalen Stelle der stenotischen oder okklutischen Läsionen der atherosklerotischen Arterien zur Verfügung zu stellen. Obwohl in situ arterielle Transplantate, wie interne Brustarterien für CABG, aufgrund der erwarteten längeren Durchgängigkeit als Bypasstransplantate bevorzugt werden, werden Venentransplantate, wie autologe saphenous Venen, aufgrund der höheren Zugänglichkeit und Verfügbarkeit häufig verwendet⁴. Der Schwachpunkt der Venentransplantate ist die schlechte Durchgängigkeitsrate im Vergleich zu arteriellen Transplantaten⁵ aufgrund einer beschleunigten Intimhyperplasie, wenn sie arteriellem Druck ausgesetzt ist, was zu einer Venentransplantaterkrankung führt⁶.

Venentransplantat-Krankheit entwickelt sich durch die folgenden drei Schritte: 1) Thrombose; 2) intimale Hyperplasie; und 3) Arteriosklerose⁷. Um die Venentransplantatskrankheit zu bekämpfen, wurde eine Menge Grundlagenforschung durchgeführt⁸. Bisher wird keine andere pharmakologische Strategie als thrombozyslösende und lipidsenkende Therapien zur sekundären Prävention nach koronaren oder peripheren Revaskularisationsoperationen in den jüngsten Richtlinien^9,10,11,12empfohlen. Um die Venentransplantatskrankheit, insbesondere die intimale Hyperplasie, zu überwinden, ist daher die Einrichtung einer relevanten experimentellen Plattform für weitere Studien erforderlich.

Intimhyperplasie ist ein adaptives Phänomen, das als Reaktion auf die Veränderung in der Umgebung auftritt, wo vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) sich vermehren, akkumulieren und extrazelluläre Matrix in der Intima erzeugen. Folglich stellt es eine Grundlage für Transplantatatherom⁷dar. In der hyperplastischen Intima, VSMCs tragen Proliferation, und Produktion statt Kontraktion, genannt "phänotypische Veränderung"⁸. Es ist ein wichtiges Forschungsziel, um den Phänotyp der VSMCs der Venentransplantate zu kontrollieren, um Venentransplantat-Krankheit zu verhindern, und zahlreiche grundlegende Studien wurden zu diesem^Thema8 durchgeführt. Jedoch, eine randomisierte kontrollierte klinische Studie, die darauf abzielte, pharmakologische Kontrolle des VSMC-Phänotyps zu erreichen, zeigte begrenzte Ergebnisse¹³. Darüber hinaus gibt es keine standardisierten Therapien, um intimale Hyperplasie zu verhindern. Weitere Grundlagenforschung, einschließlich Tiermodellstudien, ist notwendig.

Um die Forschung auf diesem Gebiet zu fördern, ist es entscheidend, ein Tiermodell zu etablieren, das Venentransplantate unter arteriellem Blutdruck rekapituliert und eine langfristige, postoperative Beobachtung ermöglicht. Carrel et al. erstellten ein Canine-Modell der Implantation der äußeren Jugularvene in die Halsschlagader¹⁴. Danach wurden eine Vielzahl von Venentransplantaten eingesetzt, um die physiologischen und pathologischen Wirkungen von Veränderungen des arteriellen Blutdrucks zu untersuchen, einschließlich der unteren Venenhöhle, die in die Brust- oder Bauchaorta eingepfropft wurde, oder die in die Femoralarterie^15,,16,,17eingepfropfte Saphenovene. Diese Modelle wurden in größeren Tieren wie Schweinen oder Hunden gebaut, die für die Nachahmung einer Venentransplantatkrankheit in einem klinischen Fall geeignet sind. Die Etablierung eines Tiermodells, das ohne spezielle chirurgische Techniken und zu geringeren Kosten hergestellt werden kann, wäre jedoch ideal für Forscher, die versuchen, eine neue therapeutische Strategie zur Abschwächung der intimalen Hyperplasie durch VSMC-Phänotypkontrolle in vivo zu entwickeln. Zunächst wurde die Einlagerung der Jugularvene in die Halsschlagader bei einem Kaninchen im Bereich der Neurochirurgie^18,19eingeführt. Danach wurde es auf die Forschung über intimale Hyperplasie^{angewendet 20,21}. Das ursprüngliche Modell besteht allein aus venöser Interposition, was Zeit spart. Darüber hinaus zeigte eine nachfolgende Studie, dass die Präparation eines Venentransplantats auch die intimale Hyperplasie^{beeinflusste 22}. Davies et al. bewerteten die Wirkung einer Ballonkatheterverletzung auf die intimale Hyperplasie in einem Kaninchen venous Interposition Modell^23,24. Obwohl ballonkatheterverletzungen zusätzlich zur Venenverzinposition für eine klinische Umgebung relevanter waren, war auch ein reproduzierbareres Modell wünschenswert. So untersuchten Jiang et al. die Auswirkungen von Differentialflussumgebungen auf die intimale Hyperplasie und etablierten ein distales Zweigligationsverfahren als reproduzierbares Modell²⁵. Allerdings verwendeten sie eine Manschettentechnik zum Zeitpunkt der Venentransplantat-Interposition, die sich von handgenähter Anastomose im klinischen Umfeld unterscheidet. Im vorliegenden Protokoll berichten wir über ein reproduzierbares, klinisch relevantes und breit verfügbares Verfahren zur Herstellung eines venösen Mischpositionsmodells für Kaninchen zur Beurteilung der intimalen Hyperplasie unter arteriellem Blutdruck.

Protokoll

HINWEIS: Alle chirurgischen Eingriffe an Tieren sollten in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (www.nap.edu/catalog/5140.html) oder anderen geeigneten ethischen Richtlinien durchgeführt werden. Die Protokolle sollten vom Tierschutzausschuss der zuständigen Institution genehmigt werden, bevor sie fortfahren.

1. Zubereitung von Tieren

1. Kaufen Sie männliche japanische weiße Kaninchen (oder Kaninchen mit entsprechender Körpergröße) mit einem Gewicht von 2,7–3,0 kg.
2. Akklimatisieren Sie die Kaninchen für 1 Woche in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und füttern Sie eine regelmäßige Kaninchen-Chow-Diät vor dem Eingriff.

2. Anästhesie und Tierhaltung

HINWEIS: Alle nachfolgenden Verfahren müssen unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Das chirurgische Feld und die Geräte sollten vor der Anwendung mit 10% Povidon-Jod-Lösung, 70% Alkohol oder einer quaternären Ammoniumverbindung desinfiziert werden.

1. Anästhetisieren Sie ein Kaninchen mit intravenöser Verabreichung von Pentobarbital-Natrium (25 mg/kg) über die auriculare Vene.
2. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass das Kaninchen seine Kraft verloren hat, übertragen Sie es auf einen Operationstisch und stellen Sie es in die Supine-Position. Bedecken Sie Nase und Mund mit einer Anästhesiemaske. Beginnen Sie die Verabreichung der Vollnarkose mit der Inhalation von 0,7–1,0% Isofluran-Sauerstoff-Mix.
   HINWEIS: Wenn sich das Kaninchen zu bewegen beginnt, ist ein zeitlicher Anstieg von Isofluran bis zu 2% wirksam.
3. Trimmen Sie das Fell am Hals und an der Schulter mit einem elektrischen Haarschneider. Nach der Desinfektion der Oberfläche durch Sprühen von 70% Ethanol oder einer anderen antiseptischen Lösung, rasieren Sie den Rest des Haares im Zervixbereich mit einem Rasiermesser. Desinfizieren Sie das Operationsfeld mit 10% Povidon-Jod und verabreichen Lidocainhydrochlorid (3 mg/kg) subkutan als Lokalanästhesie.
   HINWEIS: Untersuchen Sie die sich wiederholende Bewegung der Luftröhre. Beobachten Sie die Pulsation der Jugularvene und der Halsschlagader. Wenn die Atemwegs- und Pulsatilraten abnehmen, sollten Sie eine vorübergehende Verringerung der Anästhesieverabreichung in Betracht ziehen. Die Überwachung der perkutanen Sauerstoffsättigung und Pulsfrequenz ist ebenfalls hilfreich.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

3. Ernte der Jugularvene

HINWEIS: Lokale Anästhetika (wie Lidocain) sollten vor dem Hautschnitt verwendet werden.

1. Vor dem Hautschnitt prophylaktisches Enrofloxacin (5 mg/kg) subkutan verabreichen. Bei Analgesie 0,05 mg/kg Buprenorphin zweimal täglich für 3 Tage verabreichen.
   HINWEIS: Um einen Rückgang der Körpertemperatur zu vermeiden, kann ein chirurgisches Peeling der Einschnittstelle verwendet werden, anstatt den Körper des Tieres mit 70% Ethanol zu besprühen.
2. Incise 50–60 mm des Zervikals mit chirurgischem Skalpell längs. Sezieren Sie die subkutanen Gewebe und Faszien unverblümt, um ein 20–30 mm Segment der Jugularvene freizulegen. Ligate alle Zweige der exponierten Vene mit 4-0 Seidennähten.
3. Legen Sie eine 2-0 Seidennaht um die inneren und äußeren Jugularvenen, um Ligation sofort nach dem Einschneiden der jugularen Vene im nächsten Schritt durchzuführen.
4. Die Venenwand (ca. 1 mm) der distalen Seite der Vene. Legen Sie einen 2-französischen Ballonkatheter vom Schnitt in Richtung der proximalen Seite der Vene ein. Ligate die 2-0 Seidennaht an den distalen Stellen der Jugularvenen.
5. Aufblasen Sie den Ballon mit 0,2 ml Luft. Denude die Intima der Vene mit drei Passagen des Katheters für endotheliale Peeling.
   HINWEIS: Dieses Verfahren gilt als gleichwertig mit der Distension einer saphänous Venentransplantation bei menschlichen Revaskularisationsoperationen, die endotheliale Peeling verursacht.
6. Ligate das proximale Ende der Vene. Schneiden Sie die Vene, um zu ernten.
   ANMERKUNG: Unterscheiden Sie sorgfältig das distale und proximale Ende der geernteten Vene, da die Anastomose an der Arterie in umgekehrter Weise durchgeführt werden sollte (d. h. das distale Ende der Vene sollte an das proximale Ende der Arterie anastomosed werden). Beispielsweise würde das Einsetzen eines intravenösen Katheters von einer bestimmten Seite als Marker funktionieren.
7. Behandeln Sie für therapeutische Manipulationen für die geerntete Jugularvene die geerntete Vene mit Methoden, die für jede Forschungsfrage entwickelt wurden (z. B. Elektroporation²⁶ oder direktes Eintauchen mit Lösungen²⁷ zur Transducing von microRNAs in die Venen).
   HINWEIS: Für dieses Protokoll wurden die Venentransplantate in phosphatgepufferter Saline, Kontroll-microRNA und microRNA-145 eingeweicht. Das Protokoll kann hier angehalten werden.

4. Verriegelung der Halsschlagader durch die geerntete Jugularvene

1. Stellen Sie ein 20–30 mm Segment der ipsilateralen Halsschlagader aus. Trennen Sie die Arterie vorsichtig von der Vene und Demnerv in der Nähe. Ligate alle Zweige der exponierten Vene mit 4-0 Seidennaht.
2. Heparin-Natrium intravenös verabreichen (200 I.E./kg). Warten Sie auf 3-4 min.
3. Klemmen Sie die proximalen und distalen Enden der Arterie mit chirurgischen Klemmen. Schneiden Sie die Arterie in der Mitte, zwischen den Klemmen. Injizieren Sie normale Saline in die eingeschnittene Karotisarterie proximal und distally, um die Arterie zu distend.
   HINWEIS: Eine Halsschlagader neigt dazu, zu schrumpfen. Wählen Sie eine gut bedachte Seite als Anastomose-Website.
4. Anastomose die geerntete Vene zur Arterie in umgekehrter End-to-End-Manier.
   1. Legen Sie einen 20 G intravenösen Katheter in die geerntete Vene von der distalen in die proximale Richtung, um das venöse Lumen während der distalen Anastomose offen zu halten.
   2. Anastomose das proximale Ende der Vene bis zum distalen Ende der Arterie mit 8-0 Polypropylen unterbrochene Nähte. Platzieren Sie zwei Ankerstiche an der Stelle und der gegenüberliegenden Stelle. Fügen Sie Stiche die Oberseite der Anastomose-Linie zwischen den Ankerstichen hinzu.
   3. Drehen Sie die Arterie und die Venentransplantation auf den Kopf. Fügen Sie Stiche auf dem verbleibenden Teil der Anastomoselinie hinzu.
   4. Entfernen Sie den intravenösen Katheter aus der Vene. Klemmen Sie die Venentransplantat proximal und deklemmen Sie die Halsschlagader distal. Stellen Sie sicher, dass sich die Venentransplantation allmählich ausdehnt.
   5. Anastomose das distale Ende der Vene an das proximale Ende der Arterie mit 8-0 Polypropylen unterbrochene Nähte. Deklemmen Sie die Arterie, um die Blutung von den Anastomosestellen zu überprüfen. Fügen Sie Nähte für Hämostase hinzu, falls erforderlich.
      HINWEIS: Eine sanfte Kompression der Blutungsstelle mit Gaze und Warten kann für hämostasis ausreichen. Überprüfen Sie die sofortige Ausdehnung und starke Pulsation der Venentransplantation nach der proximalen Declamping. Wenn dies nicht beachtet wird, sollten Sie die Schritte 4.4.2–4.4.3 wiederholen.
5. Ligate die interne Halsschlagader mit einer 4-0 Seidennaht, um einen schlechten Ablaufzeitzustand zu simulieren und intimale Hyperplasie zu erleichtern.
6. Reinigen Sie die Wunde mit Einer Saline. Schließen Sie die Wunde mit 3-0 Polyglactin 910, Schicht für Schicht.

5. Postoperative Verfahren

1. Beenden Sie die Anästhesie und entfernen Sie die Anästhesiemaske, nachdem Sie die spontane Atmung des Tieres überprüft haben. Überprüfen Sie die Bedingungen des Tieres häufig, bis es sich von der Anästhesie erholt.
2. Halten Sie das Tier von anderen Tieren getrennt, bis die Atemfunktion vollständig wiederhergestellt ist. Unterstützen Sie die Atmung manuell, falls erforderlich. Bringen Sie das Tier erst nach vollständiger Genesung an eine größere Gruppe zurück.
3. Überprüfen Sie die Nahrungs- und Wasseraufnahme nach der Genesung von der Anästhesie und bieten sie eine angemessene Ernährungsunterstützung. Analgetika (z. B. Buprenorphin 0,05–0,2 mg/kg subkutan 2x pro Tag für 3 Tage) verabreichen und auf Anzeichen von Beschwerden oder Schmerzen überprüfen.

Ergebnisse

Abbildung 1A zeigt ein repräsentatives Bild der erfolgreichen intimalen Hyperplasie nach 2 Wochen nach venöser Interpositionsoperation (Obere Platte). Das untere Panel zeigt die therapeutischen Wirkungen von microRNA-145-geladenen Poly-Nanopartikeln (Milch-Co-Glykolsäure), die die intime Hyperplasie (unteres Panel) dämmen. Abbildung 1B zeigt den Vergleich der intimalen Hyperplasie zwischen der Kontrollgruppe mit Phosphatgepufferten Kochsaline-Kontrollgruppen...

Diskussion

Das vorliegende Protokoll soll eine experimentelle Plattform bieten, um verschiedene molekulare oder genetische Interventionen für VSMCs zu testen, um den Phänotyp vom proliferativen zum kontraktilen Zustand zu kontrollieren und anschließend das Fortschreiten der venösen intimen Hyperplasie in vivo zu dämpfen. Mit diesem Modell haben wir die intimale Hyperplasie 2 Wochen nach der Operation erfolgreich vorbereitet (Abbildung 1A) und das therapeutische Potenzial von microRNA-145 zur Kontr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Povidone-iodine solution	Nakakita	872612	Surgical expendables
2-0 VICRYL Plus	Johnson and Johnson	VCP316H	Surgical expendables
4-0 Silk suture	Alfresa pharma	GA04SB	Surgical expendables
8-0 polypropylene suture	Ethicon	8741H	Surgical expendables
Cefazorin sodium	Nichi-Iko Pharmaceutical	6132401D3196	Antibiotics
Fogarty Catheter (2Fr)	Edwards Lifesciences LLC	E-060-2F	Surgical expendables
Heparin	Nipro	873334	Anticoagulant
Intravenous catheter (20G)	Terumo	SR-OT2051C	Surgical expendables
Isoflurane	Fujifilm	095-06573	Anesthesia
Lidocaine hydrochloride	MP Biomedicals	193917	Anesthesia
Pentobarbital sodium	Tokyo Chemical Industry	P0776	Anesthesia