Un modello di interposizione venosa di coniglio che imita la chirurgia di rivascolarizzazione usando grafts di venina per valutare l'iperplasia intima sotto la pressione sanguigna arteriosa

Riepilogo

Il presente protocollo mira a creare sperimentalmente iperplasia intima venosa sottoponendo le vene alla pressione arteriosa per lo sviluppo di strategie per attenuare l'iperplasia intimave venosa a seguito di chirurgia di rivascolazione utilizzando innesti vena.

Abstract

Anche se gli innesti venosi sono stati comunemente utilizzati come innesti autologi in interventi chirurgici di rivascolarizzazione per malattie ischemiche, la patenza a lungo termine rimane scarsa a causa dell'accelerazione dell'iperplasia intimale a causa dell'esposizione alla pressione arteriosa. Il presente protocollo è progettato per la creazione di iperplasia intima venosa sperimentale interponendo le vene giugulare del coniglio alle arterie carotidee ipsilaterali. Il protocollo non richiede procedure chirurgiche in profondità nel tronco del corpo e l'estensione dell'incisione è limitata, il che è meno invasivo per gli animali, consentendo l'osservazione a lungo termine dopo l'impianto. Questa semplice procedura consente ai ricercatori di studiare strategie per attenuare la progressione dell'iperplasia intima degli innesti vena impiantati. Utilizzando questo protocollo, abbiamo segnalato gli effetti di trasduzione del microRNA-145 (miR-145), che è noto per controllare il fenotipo delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) dalla proliferazione allo stato contrattile, in innesti di vena raccolti. Abbiamo confermato l'attenuazione dell'iperplasia intima degli innesti venosi trasducendo miR-145 prima dell'intervento di impianto attraverso il cambiamento del fenotipo delle VSMC. Qui segnaliamo una piattaforma sperimentale meno invasiva per studiare le strategie che possono essere utilizzate per attenuare l'iperplasia intima di innesti venosi negli interventi chirurgici di vascolarizzazione.

Introduzione

Il numero di pazienti affetti da malattie ischemiche a causa dell'aterosclerosi è in aumento in tutto il mondo¹. Nonostante gli attuali progressi nelle terapie mediche e chirurgiche per le malattie cardiovascolari, le malattie cardiache ischemiche, come l'infarto miocardico, rimangono una delle principali cause di morbilità e mortalità². Inoltre, le malattie arteriose periferiche caratterizzate da un ridotto flusso sanguigno agli arti provocano un'ischemia critica degli arti, in cui circa il 40% dei pazienti perde le gambe entro 6 mesi dalla diagnosi e il tasso di mortalità è fino al 20%³.

Gli interventi chirurgici di rivascolarizzazione, come l'innesto di bypass coronarico (CABG) e la chirurgia di bypass per le arterie periferiche, sono le principali opzioni terapeutiche per le malattie ischemiche. Lo scopo di questi interventi chirurgici è quello di fornire un nuovo percorso sanguigno per fornire sufficiente flusso sanguigno verso il sito distale delle lesioni stenotiche o occluse delle arterie aterosclerotiche. Anche se negli innesti arteriosi situ, come le arterie toraciche interne per CABG, sono preferiti come gli innesti di bypass a causa della patenza più lunga prevista, gli innesti di vene, come le vene sapheno autologhe, sono comunemente utilizzati a causa della maggiore accessibilità e disponibilità⁴. Il punto debole degli innesti venosi è il tasso di patenza povero rispetto a quello degli innesti delle arterie⁵ a causa dell'iperplasia intimale accelerata quando sottoposta a pressione arteriosa, che porta alla malattia dell'innesto delle vene⁶.

La malattia dell'innesto di vena si sviluppa attraverso i seguenti tre passaggi: 1) trombosi; 2) iperplasia intima; e 3) aterosclerosi⁷. Al fine di affrontare la malattia dell'innesto della vena, sono state condotte molte ricerche di base⁸. Finora, nessuna strategia farmacologica diversa dalle terapie antiplatletine e lipidi-abbassamento sono raccomandate per la prevenzione secondaria dopo interventi chirurgici di vascolarizzazione coronarica o periferica nelle recenti linee guida^9,10,11,12. Pertanto, per superare la malattia dell'innesto venoso, in particolare l'iperplasia intima, è necessaria la creazione di una piattaforma sperimentale rilevante per ulteriori studi.

L'iperplasia intima è un fenomeno adattivo che si verifica in risposta al cambiamento nell'ambiente circostante, dove le cellule muscolari limpiche (VSMC) proliferano, accumulano e generano matrice extracellulare nell'intima. Di conseguenza, presenta una base per l'innesto atheroma⁷. Nell'intimaica iperplastica, le VSMC sorregono la proliferazione, e la produzione piuttosto che la contrazione, definita "cambiamento fenotipico"⁸. Si tratta di un obiettivo chiave di ricerca per controllare il fenotipo dei VSMC degli innesti vena per prevenire la malattia di innesto vena, e numerosi studi di base sono stati condotti su questo argomento⁸. Tuttavia, uno studio clinico controllato randomizzato che mirava a ottenere il controllo farmacologico del fenotipo VSMC ha mostrato risultati limitati¹³. Inoltre, non ci sono terapie standardizzate per prevenire l'iperplasia intima. Sono necessarie ulteriori ricerche di base, compresi gli studi sui modelli animali.

Per promuovere la ricerca in questo campo, è fondamentale stabilire un modello animale che riassume gli innesti vena sotto la pressione arteriosa, consentendo un'osservazione postoperatoria a lungo termine. Carrel et al. ha stabilito un modello canino di impianto della vena giugulare esterna nell'arteria carotide¹⁴. Inseguito, una varietà di innesti vena sono stati impiegati per studiare gli effetti fisiologici e patologici delle alterazioni della pressione arteriosa, tra cui la vena cava inferiore innestata nell'aorta toracica o addominale, o la vena sapiente innestata nell'arte sia artemorale^15,16,17. Questi modelli sono stati costruiti in animali più grandi, come maiali o cani, che sono adatti per imitare una malattia di innesto venoso in un caso clinico. Tuttavia, la creazione di un modello animale che può essere preparato senza tecniche chirurgiche speciali e a un costo inferiore sarebbe l'ideale per i ricercatori che cercano di sviluppare una nuova strategia terapeutica per attenuare l'iperplasia intima attraverso il controllo del fenotipo VSMC in vivo. Inizialmente, l'interposizione della vena giugulare nell'arteria carotide in un coniglio è stata introdotta nel campo della neurochirurgia^18,19. Successivamente, è stato applicato alla ricerca sull'iperplasia intima^20,21. Il modello iniziale è costituito da un'interposizione venosa da solo, risparmiando così tempo. Inoltre, uno studio successivo ha dimostrato che la preparazione di un innesto veno sopitto ha interessato anche l'iperplasia intima²². Ha valutato l'effetto della lesione del catetere a palloncino sull'iperplasia intima in un coniglio venoso modello di interposizione^23,24. Anche se la lesione del catetere a palloncino oltre all'interposizione della vena era più rilevante per un ambiente clinico, era anche desiderato un modello più riproducibile. Così, Jiang e altri hanno esaminato l'impatto degli ambienti di flusso differenziale sull'iperplasia intima e hanno stabilito una procedura di legatura dirami distale come modello riproducibile²⁵. Tuttavia, hanno impiegato una tecnica di polsino al momento dell'interposizione dell'innesto venoso che sembra diverso dagli anastomosi cuciti a mano nell'ambiente clinico. Nel presente protocollo, riportiamo una procedura riproducibile, clinicamente rilevante e ampiamente disponibile per la preparazione di un modello di interposizione venosa del coniglio per valutare l'iperplasia intima sotto pressione arteriosa.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure chirurgiche eseguite sugli animali devono essere eseguite in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (www.nap.edu/catalog/5140.html) o altre linee guida etiche appropriate. I protocolli devono essere approvati dal comitato per il benessere degli animali presso l'istituto competente prima di procedere.

1. Preparazione degli animali

1. Acquistare conigli bianchi giapponesi maschi (o conigli con dimensioni corporee equivalenti) del peso di 2,7–3,0 kg.
2. Acclimatare i conigli per 1 settimana in un ciclo di 12 ore luce-scuro e nutrire una dieta di chow coniglio regolare prima della procedura.

2. Anestesia e ambiente animale

NOTA: tutte le procedure successive devono essere eseguite in condizioni asettiche. Il campo chirurgico e i dispositivi devono essere disinfettati con 10% soluzione povidone-iodio, 70% alcol, o un composto di ammonio quaternario prima dell'uso.

1. Anestesizzare un coniglio con somministrazione endovenosa di sodio pentobarbitale (25 mg/kg) attraverso la vena auricolare.
2. Dopo aver assicurato che il coniglio ha perso la sua forza, trasferirlo in un tavolo operatorio, e metterlo in posizione supina. Coprire il naso e la bocca con una maschera anestetica. Iniziare la somministrazione di anestesia generale con l'inalazione di 0.7–1.0% miscela di isoflurane-ossigeno.
   NOTA: Se il coniglio inizia a muoversi, un aumento temporale dell'isoflurane fino al 2% sarà efficace.
3. Tagliare la pelliccia sul collo e sulla spalla utilizzando un tagliacapelli elettrico. Dopo aver disinfettato la superficie spruzzando 70% etanolo o un'altra soluzione antisettica, radere il resto dei capelli nella regione cervicale con un rasoio. Disinfettare il campo chirurgico con il 10% di povidone-iodio e somministrare l'idrocloruro lidocaino (3 mg/kg) sottocutaneamente come anestesia locale.
   NOTA: Esaminare il movimento ripetitivo della trachea. Osservare la pulsazione della vena giugulare e l'arteria carotidea. Quando i tassi respiratori e pulsatili diminuiscono, considerare una riduzione temporanea della somministrazione di anestesia. Anche il monitoraggio della saturazione percutanea dell'ossigeno e della frequenza cardiaca.
   NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

3. Raccolta della vena giugulare

NOTA: Gli anestetici locali (come la lidocaina) devono essere utilizzati prima di effettuare l'incisione cutanea.

1. Prima dell'incisione cutanea, somministrare l'enrofloxacina profilattica (5 mg/kg) sottocutaneamente. Per l'analgesia, somministrare 0,05 mg/kg di buprenorphine sottocutaneamente due volte al giorno per 3 giorni.
   NOTA: Per evitare un calo della temperatura corporea, è possibile utilizzare uno scrub chirurgico del sito di incisione invece di spruzzare il corpo dell'animale con il 70% di etanolo.
2. Incise 50-60 mm della regione cervicale con bisturi chirurgico longitudinalmente. Sezionano con franchezza i tessuti sottocutanei e la fascia per esporre un segmento di 20-30 mm della vena giugulare. Ligate tutti i rami della vena esposta con suture di seta 4-0.
3. Posizionare una sutura di seta 2-0 intorno alle vene giugulare interne ed esterne per eseguire la legatura subito dopo aver incitato la vena giugulare nella fase successiva.
4. Incise la parete venosa (circa 1 mm) del lato disfattore della vena. Inserire un catetere a palloncino 2-francese dal taglio verso il lato prossimale della vena. Ligate la sutura di seta 2-0 nei siti disaldi delle vene giugulare.
5. Gonfiare il palloncino con 0,2 mL d'aria. Denude l'intima della vena utilizzando tre passaggi del catetere per l'esfoliazione endoteliale.
   NOTA: Questa procedura è considerata equivalente alla distensione di un innesto vena saphenous negli interventi chirurgici di vascolarizzazione umana, che provoca esfoliazione endoteliale.
6. Ridurre l'estremità prossimale della vena. Tagliare la vena per raccogliere.
   NOTA: distinguere con attenzione l'estremità distale e prossimale della vena raccolta, poiché l'anastomosi all'arteria deve essere eseguita in modo invertito (cioè, l'estremità distale della vena deve essere anastomosed all'estremità prossimale dell'arteria). Ad esempio, l'inserimento di un catetere per via endovenosa da un determinato lato funzionerebbe come marcatore.
7. Per le manipolazioni terapeutiche per la vena giugulare raccolta, trattare la vena raccolta con metodi progettati per ogni domanda di ricerca (ad esempio, elettroporazione²⁶ o immersione diretta con soluzioni²⁷ per trasduzione di microRNA nelle vene).
   NOTA: per questo protocollo, gli innesti di vene sono stati immersi in salina tamponata di fosfati, microRNA di controllo e microRNA-145. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. Interposizione dell'arteria carotide dalla vena giugulare raccolta

1. Esporre un segmento di 20-30 mm dell'arteria carotide ipsilaterale. Separare l'arteria con attenzione dalla vena e dal nervo nelle vicinanze. Ligate tutti i rami della vena esposta con sutura di seta 4-0.
2. Somministrato l'eparina di sodio per via endovenosa (200 IU/kg). Attendere 3-4 min.
3. Bloccare le estremità prossimali e discrepanze dell'arteria con morsetti chirurgici. Tagliare l'arteria nel mezzo, tra i morsetti. Iniettare normale salina nell'arteria carotide incisa prossimiae e distally per distendere l'arteria.
   NOTA: Un'arteria carotide del coniglio tende a ridursi. Scegli un sito ben disteso come sito di anastomosi.
4. Anastomose la vena raccolta per l'arteria in modo invertito end-to-end.
   1. Inserire un catetere intravenoso da 20 G nella vena raccolta dal distale alla direzione prossimale per mantenere aperto il lumen venoso durante gli anastomosi distale.
   2. Anastomosi l'estremità prossimale della vena all'estremità dissalare dell'arteria utilizzando 8-0 suture interrotte in polipropilene. Posizionare due stiches di ancoraggio sul sito e sul sito opposto. Aggiungere stiches la parte superiore della linea anastomosis tra gli stiches di ancoraggio.
   3. Capovolgere l'arteria e l'innesto venoso a testa in giù. Aggiungere stiches sulla parte restante della linea anastomosis.
   4. Rimuovere il catetere per via endovenosa dalla vena. Bloccare la vena innesto proximally e declampadare l'arteria carotide distay. Assicurarsi che l'innesto venosi si stia espandendo gradualmente.
   5. Anastomose l'estremità dissalare della vena all'estremità prossimale dell'arteria utilizzando 8-0 suture interrotte in polipropilene. Decasiamo l'arteria per controllare l'emorragia dai siti di anastomosi. Aggiungere suture per l'emostasis, se necessario.
      NOTA: Una leggera compressione del sito sanguinante con garza e attesa può essere sufficiente per l'emostasi. Controllare l'espansione immediata e la forte pulsazione dell'innesto venoso dopo il declamping prossimale. Se ciò non viene osservato, è consigliabile ripetere i passaggi 4.4.2– 4.4.3
5. Ligate l'arteria carotide interna con una sutura di seta 4-0 per simulare una condizione di deflusso scadente e per facilitare l'iperplasia intima.
6. Pulire la ferita con la salina. Chiudere la ferita utilizzando 3-0 polyglactin 910, strato dopo strato.

5. Procedure postoperatorie

1. Terminare l'anestesia e rimuovere la maschera di anestesia dopo aver controllato la respirazione spontanea dell'animale. Controllare frequentemente le condizioni dell'animale fino a quando non si riprende dall'anestesia.
2. Tenere l'animale separato dagli altri animali fino a quando la funzione respiratoria non è completamente ripristinata. Supportare la respirazione manualmente, se necessario. Non riportare l'animale a un gruppo più grande fino al pieno recupero.
3. Controllare l'assunzione di cibo e acqua dopo il recupero dall'anestesia e fornire un adeguato supporto nutrizionale. Somministrare analgesici (ad esempio, buprenorfina 0,05–0,2 mg/kg sottocutaneamente 2 volte al giorno per 3 giorni) e verificare la presenza di segni di disagio o dolore.

Risultati

Figura 1A mostra un'immagine rappresentativa di iperplasia intima di successo a 2 settimane dopo la chirurgia di interposizione venosa (pannello superiore). Il pannello inferiore mostra gli effetti terapeutici delle nanoparticelle poliscientifiche caricate a microRNA-145 (acido lattico-co-colico) che attenuavano l'iperplasia intima (pannello inferiore). La figura 1B mostra il confronto tra l'iperplasia intima tra il gruppo di controllo utilizzando il controllo s...

Discussione

Il protocollo attuale è progettato per fornire una piattaforma sperimentale per testare vari interventi molecolari o genetici per le VSMC per controllare il fenotipo dal proliferare allo stato contrattile e successivamente attenuare la progressione dell'iperplasia intima venosa in vivo. Utilizzando questo modello, abbiamo preparato con successo l'iperplasia intima a 2 settimane dopo l'intervento chirurgico (Figura 1A) e indicato il potenziale terapeutico del microRNA-145 per controllare il ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Povidone-iodine solution	Nakakita	872612	Surgical expendables
2-0 VICRYL Plus	Johnson and Johnson	VCP316H	Surgical expendables
4-0 Silk suture	Alfresa pharma	GA04SB	Surgical expendables
8-0 polypropylene suture	Ethicon	8741H	Surgical expendables
Cefazorin sodium	Nichi-Iko Pharmaceutical	6132401D3196	Antibiotics
Fogarty Catheter (2Fr)	Edwards Lifesciences LLC	E-060-2F	Surgical expendables
Heparin	Nipro	873334	Anticoagulant
Intravenous catheter (20G)	Terumo	SR-OT2051C	Surgical expendables
Isoflurane	Fujifilm	095-06573	Anesthesia
Lidocaine hydrochloride	MP Biomedicals	193917	Anesthesia
Pentobarbital sodium	Tokyo Chemical Industry	P0776	Anesthesia