細胞体カルシウム測定とカルシウムイメージング研究のための脳毛細血管培養

要約

脳毛細血管のペリサイトは、血液脳関門の特性と血流の調節に不可欠なプレーヤーです。このプロトコルは、脳の毛細血管のペリサイトを、細胞型に関してどのように分離し、培養し、蛍光プローブを用いた細胞内カルシウムシグナル伝達の調査に適用できるかを説明する。

要約

血管細胞は、神経血管ユニット(NVU)として知られている構造で内皮細胞および占星細胞のエンドフィートに関連付けられている。脳毛細血管ペリサイト機能は完全には知られていない。ペリサイトは、毛細血管の発達、内皮バリアの圧迫性および経月活性の調節、毛細血管の調節、および特定の脳病理において重要な役割を果たすことが示唆されている。

ペリサイトは、脳のパレンチマのプロセスを視覚化するのが困難であり、NVUの他の細胞との近接性のために、無傷の脳で調査することは困難です。本プロトコルは、脳シグナル伝達および病理に関与するアゴニストの影響を調査することができるカルシウムイメージング研究における主要なウシ脳毛細血管の分離および培養法およびそれらの次の使用法を記述する。皮質毛細管フラグメントは培養フラスコの底部に付着させ、6日後に、内皮細胞および側皮細胞が毛細管断片から成長した。内皮細胞は、穏やかなトリプシン法によって除去され、そして、過菌体は、通過する前に5日間培養される。

孤立したペリサイトは96ウェル培養プレートに播種され、プレートリーダーのセットアップで細胞内カルシウムレベルの測定を可能にするためにカルシウムインジケータ色素(Fura-2アセトキシメチル(AM))をロードします。あるいは、ペリサイトはカバースリップに播種され、細胞室に取り付けられる。カルシウムインジケーター(Cal-520 AM)を使用した負荷に続いて、カルシウムライブイメージングは、励起波長488nm、発光波長510~520nmの共焦点顕微鏡を使用して行うことができます。

ここで説明する方法は、初代脳毛細血管の第1の測定を得るために使用され、PERicytesがATPを介して刺激され、インビトロで収縮できることを実証した。

概要

脳毛細血管のペリサイトは、内皮細胞およびアストロサイトと共に、NVU^1、2、3を構成する。毛細血管の構造基盤を形成する内皮細胞は、直径5~8μmの長い円筒状のチューブを形成します。内皮細胞は、散発的に周皮細胞で覆われ、アストロサイトからの突起に囲まれています。アストロサイトの端足。

脳の毛細血管に位置する血液脳関門(BBB)は、脳と血液の間の栄養素、ガス、廃棄物の交換の主要な場所です。BBBはまた、内因性および外因性神経毒から脳を保護し、多数の薬物化合物の送達のための障壁として機能します。バリア機能は、中枢神経系(CNS)医薬品を開発している製薬会社にとって、焦点領域であり、障害です。これは、培養4におけるNVUの細胞の調査に大きな関心を駆り^{立ててきた}。脳の占星細胞と内皮細胞は、培養され、多くの研究で特徴づけられてきたが、ペリサイト培養の研究とプロトコルはまばらである。

以前に公開されたプロトコルは、イムノパンニング^5、高グルコース培地^6、蛍光活性化細胞選別^7、密度勾配遠心分離^8、等のようなさまざまなアプローチを用いて、ある程度脳毛細血管系の培養物の生成を記述している。これらの方法は、ペリサイトの培養を得るのに十分に思えるが、一部は時間がかかり、コストが高く、そして得られるペリサイトは、9の^{ペリサイトを}分化解除できる培養通路の数のために理想的ではないかもしれない。さらに、インビトロシグナル伝達研究における培養されたペリサイトの可能性は、これまでかなり未踏であった。

本研究では、孤立した牛の脳毛細血管からのpericyte培養の生成と、その後の細胞内カルシウムの変化の測定およびイメージング研究のセットアップに焦点を当てています。皮質灰色物質からの毛細血管の分離(詳細についてはHelmsら¹⁰参照)と、内皮細胞またはグリア細胞を汚染することなく純粋な単一培養における回膜細胞の単離および培養について簡単に説明する。次に、96ウェルプレートにペリサイトを播種し、カルシウムプローブFura-2 AM用の負荷プロトコルを使用するプロトコルを提供します。最後に、顕微鏡培養チャンバーでリアルタイムの共焦点イメージングでペリサイトがどのように使用できるかを示し、そのためのプロトコルについて説明します。

プロトコル

細胞培養用バッファーおよび溶液の調製

1. ヒト胎盤から5mgのコラーゲンIVを4°Cで一晩PBS50mLに溶解してコラーゲンストック液を調製する。 5 mLの部分にストック液をアリコートし、-20°Cで保存します。
2. フィブロネクチンの5 mgを一晩で5 mLの無菌水に溶解してフィブロネクチンストック溶液を調製する。フィブロネクチンの在庫は-20°Cで500μLのアリコートで保管してください。 解凍する場合は、50 mLの最終容積にPBSを加えて、作業溶液を準備し、4°Cで保存します。
3. 50mの胎児ウシ血清(FBS)、5mLの非必須アミノ酸および5 mLのペニシリン/ストレプトマイシン(0.1 g/Lストレプトマイシン硫酸および100,000 U/LペニシンG)を加えることによって、ダルベックコの修飾イーグル培地(DMEM)完全培地を調製します。
4. PBSにヘパリンナトリウム塩を溶解して5mg/mLヘパリンストック溶液を調製し、滅菌のために0.2 μmフィルターを通過させます。ストック液を4°Cに保存してください。
5. 使用直前に成長培地(GM)を準備します。DMEM-コンプ10 mLと250 μLのヘパリンストック溶液をT75フラスコごとに混合します。

2. 新鮮な牛の脳からの毛細血管の分離

注:牛の脳の毛細血管は、先に説明したように分離され、培養されます(Helmsら^10)。

1. 生後12ヶ月以下の子牛から脳を採取し、食肉処理場から直接氷の上の実験室に持ち込む。
2. 髄を取り除き、メスを使用して脳からすべての灰色物質を収集します。髄膜を、その灰色の色で脳と灰色物質を覆うフィルムとして識別します。
3. ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)の灰色物質を均質化するために40 mL Dounceティッシュグラインダーを使用してください。ティッシュグラインダーのスリム部分をグレーの物質の懸濁液で1/5充填し、スリムな部分が充填されるまでDMEMを追加します。
4. 160 μmナイロンネットフィルターを介してホモゲネートを濾過することにより、キャピラリーを遊離細胞と小さな組織片から分離します。DMEM-comp でフィルタをフラッシュします。毛細血管を取り出し、50 mL遠心チューブに懸濁液をプールします。
5. DMEM-compで毛細血管を再中断し、DNase I(170 U/mL)、コラゲナーゼIII型(200 U/mL)、トリプシン(90 U/mL)の酵素ミックスを加えます。毛細血管の消化のため、37°Cの水浴に1時間の懸濁液を残します。
6. 200 μm メッシュフィルターを介してサスペンションを実行し、10% ジメチルスルホキシド (DMSO) を使用して FBS で再中断します。キャピラリーを-80°Cで一晩凍結し、長期間保存するために翌日に液体窒素に移動します。
   注: プロトコルはここで一時停止することができます。

3. 牛毛細血管の播種と培養

1. 0日目: 0.7 mLのコラーゲンIVストックを6.3mLのPBSと混ぜます。溶液をT75フラスコに加え、フラスコを室温(RT)で2時間放置するか、4°Cで一晩放置します。
2. フラスコからコラーゲン溶液を取り出し、PBSで3回洗います。
3. フィブロネクチン作業溶液の7 mLを追加し、RTで30分間フラスコを残します。次いで、フィブロネクチン溶液を除去し、直後に毛細血管を播種する。
4. 30分の待ち時間の間に、37°Cの水浴で毛細血管の1バイアルを解凍します。
5. 毛細血管が解凍されたら、500 x g で5分間DMEM-compと遠心分離機の30 mLを備えた遠心チューブに直ちに移し、チューブからDMEM-コンプを取り除き、新鮮なDMEM-compの10 mLでキャピラリーペレットを再び懸濁します。
6. 10 mL懸濁液をコーティングされたT75フラスコに移し、10%CO2で37°Cインキュベーターでフラスコの底部に4〜6時間付着するようにキャラシーを残します。
   注:細胞の増殖率は、従来の_5%CO2よりも10%CO2で高くなっています。
7. 4〜6時間のインキュベーション後、軽顕微鏡下でフラスコを検査する。キャピラの端数をフラスコの底部に取り付ける必要があります(図1、0日目)。
8. GMを準備し、毛細血管から非常に慎重にDMEN-コンプ培地を吸引し、作りたてのGMの10 mLに置き換えます。
9. 2日目: 毛細血管からGMを取り除き、作りたてのGMの10 mLに置き換えます。毛細血管からの細胞の成長は、この時点で軽顕微鏡で見えるはずです(図1、2-3)。

4. 牛の脳毛細血管からの原発性ペリサイトの分離

1. 4日目: 軽い顕微鏡で毛細血管を点検しなさい。
   注:フラスコは、適切な量のペリサイトを提供するために約60〜70%のコンフルエントであるはずです(図1、4日目)。これが当てはまらない場合。新鮮な培地の10 mLでGMを交換し、別の日のためにインキュベーターにフラスコを残します。
2. 培地を吸引し、PBSで細胞を穏やかに洗います。
3. 内皮細胞に2mLの解凍トリプシン-EDTAを加え、フラスコをインキュベーターに1〜3分間放置します。フラスコを頻繁に取り出し、この期間中に顕微鏡で観察します。
   注意:内皮細胞はフラスコから切り上げて取り外す必要があります。ペリサイトは、"ゴースト"形態を有する細胞として見ることができ、フラスコの表面にまだ付着している必要があります。 これはトリッキーで重要なステップです。 多くの内皮細胞を除去して、単培養の汚染を避けることが不可欠であるが、トリプシンの長期化は、また、包皮を剥離することができる。トリプシン化時間は時々多少異なる場合があり、そのため治療中に顕微鏡でフラスコを頻繁に観察することが最も重要です。
4. フラスコを軽くタップし、内皮細胞が切り上げ始めたら、緩んだ内皮細胞を剥離する。
5. トリプシンを止めるには、フラスコにDMEM-コンプを10 mL加えます。内皮細胞を除去するために培地でフラスコを慎重に数回洗い流す。フラスコから内皮細胞懸濁液を吸引する。内皮細胞は現在、他の目的のために使用することができます。
6. フラスコにDMEMコンプの10 mLを加えます。光顕微鏡の下を見て、ペリサイトがまだ存在し、底に取り付けられていることを確認します。フラスコをインキュベーターに戻して、ペリサイトを豊かにした培養物を成長させます。
   注:次の日に文化を観察することが重要です。まだかなりの量の内皮細胞が成長している場合は、別のトリプシン処理を行うことができる。
7. DMEM-compの変化に伴ってペリサイト単一培養が成長することを可能にする。2日おきに媒体。軽顕微鏡下での細胞の成長を確認します(図1、5-8)。

5. 牛の一次熟細胞の単一培養の生成と保存

1. 8-9日目: 軽い顕微鏡で毛細血管を点検する
   注意:現在、海中球は70~80%の合流率に達し、フラスコの島々で成長するはずです(図1、9日目)。包皮細胞の合流率が70%未満の場合、細胞が別の日に増殖することを可能にする。この包皮細胞は、内皮細胞のように完全な単層を形成しない。
2. DMEM-コンプを吸引し、7 mLのPBSでペリサイトを洗浄します。
3. フラスコにトリプシン-EDTAの2 mLを加え、2〜3分間インキュベーターに入れます。フラスコを頻繁に光顕微鏡の下に置き、周皮が切り上がり、フラスコから切り離されたときに観察します。周皮が切り上がり始めると、フラスコを軽く叩いて細胞を取り外すことができます。
4. フラスコを軽くタップし、周皮細胞が切り上がり始めたら、細胞を取り外します。
5. トリプシンプロセスを停止するためにフラスコにDMEM-コンプの10 mLを加えます。最後のペリサイトを取り外すために媒体でフラスコを数回洗い流します。
6. 12 mLのセル懸濁液を50 mL遠心チューブに移し、最大30 mLにDMEM-compを充填します。
7. 500 x g で5分間の細胞懸濁液を遠心分離し、DMEM-コンプを吸引します。細胞ペレットに触れることなく慎重に。10%DMSOでFBSの3 mLで細胞ペレットを再懸濁します。
8. 細胞懸濁液を凍結細胞に移す。それぞれに1 mLを加えるため、T75フラスコあたり合計3バイアルが存在します。一晩で-80°Cでペリサイトを凍結し、長期保存のために翌日液体窒素に移動します。
   注: セルは、生存率の後の推定のために凍結する前にカウントすることができます。プロトコルはここで一時停止することができます。

6. 実験用のペリサイト単一培養の設定

1. T75フラスコにコラーゲンIVとフィブロネクチンをコーティングし、セクション3.1-3.4で述べたのと同じ手順を使用します。
2. フラスコがフィブロネクチンでコーティングされている間、37°Cの水浴で1バイアルのペリサイトを解凍します。
3. DMEM-compの30 mLで、凍結から遠心チューブに今解凍されたペリシテを移します。500xgで5分間の細胞懸濁液を遠心分離し、RT。
4. 慎重に培地を吸引し、細胞ペレットをチューブの底に残す。ペレットを10 mL DMEM-コンプに再懸濁します。
5. 細胞懸濁液を回収し、コーティングされたフラスコに移します。フラスコを包皮細胞で放置して、37°Cインキュベーターで10%CO2で成長させます。
6. 1日ごとに、新鮮なDMEM-コンプの10 mLでメディアをリフレッシュしてください。
   注:5日間の成長の後、ペリサイトは約80%の合流に達しているはずです。合流度が低い場合は、細胞を別の日または2日成長させます。細胞は、さらなる実験のために播種する準備ができているはずです。

7. コーティングされた96ウェルプレートにペリサイトを播種する

1. ステップ3.1に記載のよう、コラーゲンIVを希釈する。96ウェルプレートに各ウェルに100 μLを加え、RTで2時間または4°Cで一晩インキュベートします。
2. 溶液を吸引し、PBSでウェルを3回洗浄する。
3. 各ウェルに100μLの希釈フィブロネクチンを加え、RTで30分間インキュベートします。フィブロネクチン溶液を取り除き、すぐにプレートを使用してください。
   注:ペリサイトバッチがどれだけ成長しているかを考慮して、2つのプレートを播種するのに十分なセルが必要です。
4. 培養器から海中海に入り、培地を吸引します。PBSで細胞を洗います。
5. ペリシシンEDTAの2 mLをペリサイトに加え、ステップ5.3-5.6と同じ手順に従います。
6. 培地を吸引し、細胞ペレットに害を与えることなく、新鮮なDMEM-コンプの1mLでペレットを再懸濁する。
7. 細胞懸濁液の12 μLを取り出し、計数チャンバーに加えます。軽顕微鏡では、3x3グリッドの少なくとも3をカウントし、グリッドあたりの平均セル数を使用します。
8. 以下の式を使用して、96ウェルプレートでウェルあたり10.000細胞をシードするために各ウェルに追加する必要がある細胞懸濁液の体積を計算します。
   
9. DMEM-compと計算されたセルサスペンションの量を各ウェルに追加して、最終容積200 μLに到達します。
10. 96ウェルプレートを37°Cインキュベーターの10%CO2に入れる。2日後に培地の変化で4日間成長する細胞を残します。

8. Ca²⁺イメージング用のバッファとソリューションの調製

1. オートクレーブカバースリップセルチャンバーとカバーリップ。
2. アッセイバッファー: 1.19 gの HEPES を HBSS バッファーの 500 mL に加え、最終濃度の 10 mM HEPES を使用します。pH を 7.4 に調整します。
3. 20%(w/v)プルロニックF127 +1%(v/v)ポリエチシル化ヒマシ油溶液を2.5 mLの無水DMSOに2.5mLのガラスバイアルに溶解して、ポリエチシル化ヒマシ油分液を調製します。約30分間、または溶解し、渦まで40°Cに加熱します。25 μLのポリエチオキシ化ヒマ油を添加し、RTに保管します。フリーズしないでください。
4. 無水DMSOの500 μLに1mgを溶解することにより、2 mM Fura-2 AMストックを調製します。光から保護された-20°Cで20 μLのアリコートで保管してください。
5. 20%Pluronic F-127 + 1% ポリエトロキシル化ヒマシ油ストック溶液を2mM Fura-2 AMアリコの20 μLと混合して、5 μM Fura-2 AMローディング液を調製します。500 μLのアッセイバッファーと渦を加えます。8 mLの最終容積にアッセイバッファーを追加します。溶液は使用直前に準備し、光から保護する必要があります。
6. 226.7 μLの無水DMSOを1mg溶解して、4 mM Cal-520 AMを調製します。光から保護された-20°Cで20 μLのアリコートで保管してください。
7. 20 μL 4 mM Cal-520 アリコートを使用して、20 μM Cal-520 AM ローディング溶液を 20% Pluronic F-127 + 1% ポリエトロキシル化ヒマシ油ストック溶液に混合して準備します。500 μLのアッセイバッファーと渦を加えます。最終容積4 mLにアッセイバッファーを追加します。溶液は使用直前に準備し、光から保護する必要があります。

9. フラ-2 AMカルシウムインジケーター染料を用いたプレートリーダーの設定でのペリサイトのロード

注: 実験を開始する前に、すべてのソリューションを RT にする必要があります。

1. インキュベーターから細胞を含む96ウェルプレートを取り出し、ウェルから培地を吸引します。細胞をアッセイバッファーで2回洗浄します。
2. 100 μLの荷重溶液を各ウェルに加え、プレートをtinfoilで包み、写真の漂白を避けます。RTで30rpmの揺れで45分間インキュベートします。
   メモ:内部コンパートメントをロードする可能性があるため、37°CでFura-2 AMをロードしないでください。バッファーをロードするのではなく、アッセイ バッファー内のセルを持つウェルを残すことを忘れないでください。これらは、バックグラウンド蛍光を測定するために使用される「ブランク」です。
3. ローディングバッファーを吸引し、細胞をアッセイバッファーで 2 回洗浄します。新鮮なアッセイバッファーを100 μL加え、細胞を残してRTで30分間インキュベートします。これにより、AM-エステルの連続的な切断が可能になり、それによって、細胞内でのFura-2 AMを捕捉することができます。
4. Ca²⁺イメージングの前に、バッファーを洗浄して100 μLの新鮮なアッセイバッファーに交換してください。

10. プレートリーダーのセットアップでのペリサイトのウェルプレート蛍光読み取り

1. プレートリーダーの温度を37°Cに設定し、96ウェルプレートをセルと共に サンプルプレート 位置に移します。試薬プレート の位置に アゴニストを入れる。
2. すべてのウェルでのFura-2 AMの等しい負荷を確保するために細胞の負荷を測定することによって開始します。
3. 励起蛍光波長340 nm/380 nm、発光波長を510 nmで測定します。試薬プレートから50 μLのアゴニストを、 サンプル プレート位置のセルを持つ各ウェルに150 μL/秒の速度で加えます。
4. データを保存し、さらに分析するために xlsx ファイルとしてエクスポートします。 図2 は、経時の2つの励起波長間の比として測定された細胞ソリック^Ca2+応答を示し、そこで背景蛍光が減算される。
   注:プレートリーダーは、「セルトレイ」と「サンプルトレイ」と統合ピペッタシステムのためのスペースを備えたデュアルマイクロプレートリーダーである必要があります。

11. ライブイメージング用コーティングされた細胞室でのペリサイトの播種

注:カバースリップはまた、培養井戸の底部に配置され、上述のようにコーティングされ、ペリサイトで播種され、実験前にチャンバーに取り付けられる。

1. カバースリップをセルチャンバーに取り付け、漏れを避けるためにしっかりとします。
2. ステップ3.1に記載のよう、コラーゲンIVを希釈する。各セルチャンバーに500μLを加え、RTで2時間、または4°Cで一晩インキュベートする。
3. コラーゲン溶液を吸引し、500 μLのPBSでチャンバーを3回洗浄します。
4. 希釈したフィブロネクチンを500μLずつウェルに加え、RTで30分間インキュベートします。フィブロネクチン溶液を取り除き、その後、細胞チャンバーをまっすぐに使用します。
5. その間、コンフルエントペリサイトでフラスコを取り出し、7 mLのPBSで洗います。
6. ペリシシンEDTAの2 mLをペリサイトに加え、ステップ5.3-5.6と同じ手順に従います。
7. 手順 8.6~ 8.7 と同じ手順に従って進めます。
8. 以下の方程式を使用して、各チャンバに添加する必要があるセル懸濁液の体積を計算し、チャンバあたり90.000個の細胞をシードします。
   
9. DMEM-compと計算されたセルサスペンションの体積を各チャンバに加え、500 μLの最終容積に到達します。
10. 細胞チャンバーをインキュベーターに37°C、10%CO2に入れる。細胞は6日間(またはコンフルエントまで)成長する。
    注:ペリサイトはプラスチックに比べてガラススライドで遅く成長します。成長のより多くの日が必要です。

12. ライブイメージング用 Cal-520 AM カルシウムインジケーター色素によるペリサイトのロード

注: 実験を開始する前に、すべてのソリューションを RT にする必要があります。

1. 20 μM Cal-520 AMローディングバッファを準備する:20 μL 4 mM Cal-520 アリコと20 μM の 20% Pluronic F-127 + 1% ポリエチル化ヒマシ油ストック溶液を混合します。μLアッセイバッファーと渦を500個加えます。最終容積4 mLにアッセイバッファーを追加します。溶液は使用直前に準備し、光から保護する必要があります。
   注:光の露出からCal-520 AMを含むソリューションを保護します。
2. インキュベーターから細胞室を取り出し、培地を吸引する。細胞をアッセイバッファーで2回洗浄します。
3. 各チャンバに500 μLのローディングバッファを加え、RTで45分間インキュベートします。
4. ローディングバッファーを吸引し、細胞をアッセイバッファーで 2 回洗浄します。
5. 各チャンバーに500 μLの新鮮なアッセイバッファーを加え、RTで30分間インキュベートし、AMエステルの切断を可能にします。
6. 共焦点顕微鏡でライブイメージングを行う前に、バッファーを500 μLの新鮮なアッセイバッファーに交換してください。

13. 細胞内Ca²⁺レベルのライブイメージング

メモ:イメージングには様々な種類の顕微鏡を使用できます。直立または反転した従来の蛍光顕微鏡、ならびに適切な励起源(488 nm)および発光フィルター(510-520 nm)を有する直立または反転型共焦点レーザー走査顕微鏡を使用することができる。目的は蛍光に適しており、高品質で高い開口(NA)を有する。

1. 細胞の乱れを避けるために、コンフォーカル顕微鏡のステージ上にできるだけ穏やかにセルチャンバーを取り付けます。
2. 励起波長488nm、515nmでの発光、5秒間隔の順次画像取得、512 x 512ピクセルのXY画像サイズを選択し、2分間測定してベースラインカルシウム信号を測定します。
3. ピペットを使用してセルチャンバに100 mM ATPの3μLを加え、連続画像取得を継続します。準備を妨げないようにゆっくりと穏やかに添加を行い、細胞を焦点から外します。
4. 変化の程度を観察し、さらに形態変化が示されなくなるまで約18分間、必要に応じて時間間隔を長くする(図3)。
5. タイムラプス画像を保存し、TIFFやAVIファイルとしてエクスポートして、さらに分析します。
   注:ペリサイトの1バイアルは、1-2 96ウェルプレートといくつかのカバーリップに播種するのに十分な細胞を与えるべきであり、両方のタイプのカルシウム測定のために細胞を準備することができます。

結果

牛の脳毛細血管は新鮮な脳組織から隔離され、 図1 は数日にわたる毛細血管播種および細胞の成長とその後のpericytesの精製を提示する。毛細血管は1日目にフラスコに完全に付着し、2日目に内皮発芽が見えるようになりました(図1、2日目)。4日後、細胞の成長は非常に特徴的であり(図1、4a)、内皮細胞?...

ディスカッション

本研究では、牛の脳から原発性ペリサイトを分離する方法を発表した。記述されたプロトコルは、そうでなければアクセスできないセル型のカルチャを許可します。その後得られた細胞培養は、ほぼ均質な近母細胞集団であり、細胞の形態およびタンパク質発現¹²に基づく内皮細胞およびグリア細胞との汚染はほとんどまたはまったくなかった。さらに、意図した結果に応?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATP	Tocris	3245
Cal-520 AM	AAT Bioquest	21130
Cell incubator	Thermo Fisher
Centrifuge	Thermo Fisher	Heraeus Multifuge 3SR+	Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss	Zeiss LSM 510	Inverted microscope
Counting chamber	FastRead	102
Coverslip cell chamber	Airekacells	SC15022
Cremophor EL	Sigma Aldrich	C5135	Formerly known as Kolliphor EL
DMSO	Sigma Aldrich	471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium	Sigma Aldrich	D0819
Fetal bovine serum (FBS)	PAA/GE Healthcare	A15-101
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
Fura-2 AM	Thermo Fisher	F1201
Glass coverslips 22x22 mm	VWR International	631-0123
HBSS	Gibco	14065-049
Heparin	Sigma Aldrich	H3149
HEPES	AppliChem Panreac	A1069
Light microscope	Olympus	Olympus CK2	Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids	Sigma Aldrich	M7145
Microplate Reader	BMG LabTech	NOVOstar
PBS	Sigma Aldrich	D8537	Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate	Sigma Aldrich	P0781
Pluronic F127	Sigma Aldrich	P2443
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4299
T-75 flask	Sigma Aldrich	CLS3972
96-well plate	Corning incorporated	3603