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要約

酸素誘導網膜症(OIR)は、未熟児網膜症や糖尿病網膜症の増殖などの虚血性網膜症をモデル化し、新血管疾患の抗血管新生薬の評価における概念実証研究のモデルとして使用することができます。OIRは、定量化できるレチナにおける堅牢で再現性の新生血管化を誘導する。

要約

虚血性網膜症に一般的に使用されるモデルの1つは酸素誘発性網膜症(OIR)モデルです。ここでは、OIRモデル誘導の詳細なプロトコルと、マウスとラットの両方における読み出しについて説明します。OIRでは、高酸素(マウス)または高酸素および低酸素(ラット)の交互レベルのいずれかにげっ歯類の子犬を曝露することによって、OIRで新生血管新生が誘導される。これらのモデルの主要な読み出しは、新血管(NV)および無血管(AVA)領域の大きさです。この前臨床インビボモデルは、潜在的な抗血管新生薬の有効性を評価したり、遺伝子操作された動物を用いて、遺伝子新生における特定の遺伝子の役割に対処するために使用することができる。このモデルは、OIR誘導に歪みとベンダー固有の変動があり、実験を設計する際に考慮する必要があります。

概要

血管新生眼疾患の背後にある病理を研究し、これらの壊滅的な疾患に対する新しい治療法を開発するために、信頼性と再現性のある実験モデルが必要です。病理学的血管新生は、湿潤加齢黄斑変性症(AMD)の特徴であり、その中でも多くの虚血性網膜症の未熟児網膜症(ROP)、増殖性糖尿病網膜症(PDR)および網膜静脈閉塞(RVO)1、2、3、4の特徴である。ヒトとげっ歯類の両方が血管化された最後の組織の一つであるため、ヒトとげっ歯類のretinaは同様の発達パターンに従う。残管血管系が完全に発達する前に、レティナはヒアルイド血管系から栄養供給を受け取り、その結果、その後、残性血管系が発達し始めると後退する。ヒトでは、生前に血管の血管の発達が完了し、げっ歯類では出生後に血管系の成長が起こる。歯立ちの後に生後に起こる血管の発達は、血管形成2,3を研究する理想的なモデルシステムを提供する。新生児げっ歯類は、第3週目4の終わりまでに完全な血管内の残性が発達するまで徐々に発達する血管性の無脈を有する。新生児マウスの成長血管はプラスチックであり、彼らは過酸素刺激5の間に退行を受ける。

ROPは、1,250 g6,7の出生体重を有する未熟児のほぼ70%に影響を及ぼすので、西洋諸国における小児失明の主な原因である。ROPは、レチナル血管が正常な成長を完了する前に生まれた未熟児に発生する。第1期において、早産は、第II期の後に、発達中の性状性の残管化が低酸素症を引き起こし、新しい異常な血管成長を刺激する血管新生成長因子の発現を誘発する、再発性血管成長を遅らせる。OIRモデルは、ROPおよび他の虚血性網膜症の病態生理学を研究し、新しい薬剤候補2、3、9をテストするために広く使用されているモデルである。眼疾患および非眼疾患に対する潜在的な抗血管新生薬の概念実証研究を行うための再現性のあるモデルとして広く考えられています。2つのげっ歯類モデルすなわち、マウスとラットOIRは、そのモデル誘導および疾患表現型において異なる。ラットモデルはROP表現型をより正確に模倣しますが、マウスモデルは、より堅牢で迅速かつ再現性のあるモデルを提供し、より強く、より迅速に再現性の高いモデルを提供します。マウスモデルでは、NVは中央のレティナに発達する。この病理学的読み出しは、PDR、RVおよび滲出性AMDなどの多くの虚血性網膜症、ならびに癌のような非眼球、血管新生疾患に対する薬理学的有効性研究において重要である。さらに、遺伝的に操作された(トランスジェニックおよびノックアウト)マウスの利用可能性は、マウスOIRモデルをより一般的な選択肢にする。しかし、マウスもラットOIRモデルも、ヒト疾患に典型的な筋線維症を作り出さない。

高酸素濃度が1950年代10年のROPの発展に寄与するという理解は、動物モデルの開発につながった。酸素が残性血管系に及ぼす影響に関する最初の研究は1950年12年、13年、14年に行われ、1990年代までOIRモデルには多くの改良がありました。1994年のSmithらの研究は、ヒャロイドパシーと網膜症を分離する現在のマウスOIRモデルの標準を設定した。コナーら(2009)によって血管義務と病理学的NVを定量化する方法の広い採用は、その人気をさらに高めた16.このモデルでは、マウスはP7で5日間、75%酸素(O2)に配置され、続いてノルモキシ状態で5日間置かれる。P7からP12までの高酸素症は、心筋の後退に筋脈管を引き起こす。ノルモキシ性状態に戻ると、血管性の無酸素性の無酸素状態になる(図1A)。血管中央部の低酸素刺激により、いくつかの陰部血管が、膜前房2,3と呼ばれる前レチナルNVを形成し、膜前に向かって芽生える。これらの房は未熟で、過透過性です。NV の量は P17 でピークに達し、その後は後退します。レチナは完全に再血管化され、NVはP23 - P25(図2A)2、3によって完全に後退する。

ラットOIRモデル(O2の様々なレベルを用いた)は、80%および40%でO2レベルを変動させることが80%O2定常暴露17の下よりも顕著なNVを引き起こすことを示す1990年代に最初に説明された。その後、O2が過酸化症からサイクルされる断続的な低酸素モデル(50%)が発見された低酸素症(10-12%)に、80/40%O2モデル18よりもさらに多くのNVを引き起こす。50/10%モデルでは、ラットの子犬は24時間50%に曝され、次いで10%O2で24時間が続く。これらのサイクルは、ラットの子犬がノルモキシ状態に戻されるまでP14まで続く(図1B)。ヒトROP患者のように、ラットモデルでは、未熟な心血管叢のために、血管領域がレチナの周辺に発達する(図3)。

どちらのモデルでも、通常は定量化される主なパラメータは、AVAとNVのサイズです。これらのパラメータは通常、内皮細胞が4,16のラベルが付いているレチナルフラットマウントから分析されます。以前は、プレレチナルNVの量は、血管または血管細胞核を数えることによって、内膜の上の膜上の膜に延びることによって、レチナル断面から評価した。このアプローチの主な制限は、AVA を定量化できないことです。

プロトコル

ここに記載されているプロトコルは、フィンランドの国家動物倫理委員会(プロトコル番号ESAVI/9520/2020およびESAVI/6421/04.10.07/2017)によって承認されています。

1. 実験動物とマウスOIRモデル誘導

注:例えば、一般的に使用されるC57BL / 6Jマウスを使用して、同じ日に生まれた子犬を得るために、時間交配動物を使用してください。育成ダム、例えば、129株(129S1 / SvImJまたは129S3 / SvIM)授乳ダムを使用して、ハイオキシアの誘導中および誘導後に子犬を看護します。あるいは、疲労のために授乳ダムを交換する必要がある場合に備えて、余分な授乳ダムがあることを確認してください。C57BL/6Jマウス/ダムを使用する場合、各ダムのごみサイズを6〜7匹に制限する(ごみがそれより大きい場合は、子犬が体重増加を制限する傾向がある場合)16。

  1. 過酸化誘発前後、および犠牲時の動物の体重を記録する。
  2. ケージの底に十分な食料があることを確認してください。
  3. 濾過システムが使用されていないときに余分なCO2 を吸収するためにチャンバーの底部に色表示器とソーダライムを追加します。
  4. 室内の湿度と温度を監視し、湿度を40~65%に保ちます。必要に応じて、チャンバーの底に水を入れる皿(例えば、ペトリ皿)を置くことによって、チャンバーの湿度を高めます。
  5. O2センサーを100%O2と通常の室内空気でキャリブレーションします。
  6. P7マウスをチャンバーに入れ、O2レベルを75%に設定します。マウスを5日間、P12までチャンバーに保管します。高酸素誘導時にチャンバーを開けないようにしてください。O2シリンダーのガス圧力を確認し、必要に応じてシリンダーを交換してください。誘導中に動物を監視します。
  7. チャンバーからマウスケージを取り出し、すべての子犬の重量を量ります。各実験群が子犬の体重分布が類似するように体重に基づいて子犬をグループ化する。

2. 実験動物及びラットOIRモデル誘導(半閉系を用いた)

注:同じ日に生まれた子犬を取得するために、時間交配動物を使用してください。ラットOIRの場合は、ラットモデルで十分なNV誘導を得るために、約18の子犬/ダムの増加したごみサイズを使用してください。各ごみに十分な子犬を得るためにいくつかのごみから子犬をプールします。

  1. 誘導前後、および犠牲時の動物の体重を記録する。
  2. ケージの底に十分な食料があることを確認してください。
  3. 濾過システムが使用されていない場合は、余分なCO2 を吸収するためにチャンバーの底部に色インジケーターとソーダライムを追加します。
  4. 室内の湿度と温度を監視します。チャンバーの底にシリカゲルを加えて(複数のラットから生成される)余分な湿度を吸収します。
  5. O2センサーを100%N2と通常の室内空気でキャリブレーションします。
  6. ラットをP0(出産後数時間)のチャンバーに入れます。O2レベルを50%に設定し、O2シリンダをチャンバーに24時間接続します。その後、設定を10%O2に切り替え、窒素(N2)シリンダをチャンバーに24時間接続します。50%と10%のO2レベルの間で24時間のサイクリングを14日間続けます。
  7. 研究中のガス消費量と動物の幸福を監視します。50/10%O2の間の変更の間にチャンバーを開き、必要に応じてより多くの食料と水を加えます。誘導時に動物のケージを清掃するように変更します。
  8. チャンバーからネズミのケージを取り出し、すべての子犬の重量を量ります。各実験群が子犬の体重分布が類似するように体重に基づいて子犬をグループ化する。

3. 薬物投与(オプション)

注:OIRで一般的に使用される薬物投与経路は、マウスの場合はP12-P14、ラットの場合はP14で、ビトリアル治療(ivt)によるものである。実験の設定に基づいて、治療日を決定します。複数の子犬が実験に使用される場合は、すべてのごみから動物を持つために治療グループを分割します。好ましくは、片方の眼だけに薬物を注入し、対照として対側の目を保つ。

  1. 動物の重量を量り、尾や耳に識別マークを作ります。
  2. 注射可能な麻酔(例えばケタミンとメデトミジンの混合物、マウスの場合は30mg/kgおよび0.4mg/kg)または吸入麻酔(2-3.5%のイゾフルランおよび200-350 mL/min気流)のいずれかで動物を麻酔する。つまんで麻酔の深さを確認します。治療中は、動物を加熱パッドの上に保管してください。
  3. 局所麻酔の場合は、まぶたに鎮痛薬を一滴塗布します。マウスとラットがP14の周りに目を開くので、ivtを実行する前に鉗子で慎重にまぶたを開きます。鎮痛薬(例えば、オキシブプロカイン塩酸塩)を角膜に塗布します。
  4. ivt注射を行う前にヨウ素の滴を適用します。.
  5. ivt注射には、33-34G針が取り付けられたガラス注射器を使用してください。まぶたを押し下げ、眼球を鉗子で引っ張ります。注射を後肢に、およそ45° 角度針で視神経を向けて作る。
  6. 1.0 μL以上をビトリア空間に注入しないようにしてください。注射液の還流を避けるために、薬剤を注入した後、30 sの針を所定の位置に保ちます.
  7. 針を取り除いた後、眼(例えば、眼科鏡)で出血や眼の損傷などの合併症を調べます。注射後、角膜の上に抗生物質軟膏を塗布する。
    注: マウスの ivt インジェクションボリュームは 0.5 ~ 1.0 μL にする必要があります。
  8. 麻酔を逆にします(例えばメデトミジンのα2アンタゴニスト(2.5mg/kg)を使用して、子犬をケージに戻します。研究の終わりまでごみを通常の状態で収容する。

4. インビボイメージングと電気レタイノグラフィー(オプション)

  1. 必要に応じて、血管新生応答の間にレティナで発症する変化を記録するために、フォローアップ期間中に生きている動物に生体イメージングを行う。例えば、蛍光血管造影(FA)または走査型レーザー共焦点顕微鏡19を行い、血管構造を可視化する(図4)。スペクトルドメイン光コヒレンス断層撮影(SD-OCT)を使用して、生体内のレチナル層を可視化する(図4)。
  2. 必要に応じて、電解法(ERG)を用いてOIR誘導後の異なるレチン細胞集団の機能的変化を調査する(図5)。

5. 組織の採取と、レチン状の平台の準備

注:所望の研究仮説に従って組織を収集します。マウスの場合、サンプルを例えばP12(高酸素相後の血管軟化を研究するため)または低酸素期(P13-P17)で採取する。P17でマウスOIRサンプルを収集し、これは、サンプリングのための最も一般的なタイムポイントであり、NV量のピークを検出します。ラットOIRでは、P18-P21でサンプルを収集して、NVの最高量を観察する(図3)。

  1. サンプリング前に動物の重量を量る。
  2. 残性血管系にラベルを付けるために、深く麻酔動物をFITC-dextranと経体的に浸透させることができる。(あるいは、後でイソレクチンでレティナルフラットマウントを染色する)。
  3. 麻酔薬の過剰摂取(ケタミンとメデトミジンの混合物、マウスの場合は300mg /kgおよび4mg/kg)またはCO2 吸入のいずれかを使用して動物を犠牲にする。
  4. 曲がった鉗子で眼球の後ろをつかんで動物の目を集め、眼の周りの組織を切り取り、軌道から目を持ち上げます。
  5. 作りたてで眼球をインキュベートし、4%パラホルムアルデヒド(リン酸緩衝生理食塩水、PBS)を1〜4時間濾過する。固定液を取り出し、眼球を3 x 10分PBSで洗います。すぐにレチナを解剖するか、+4°CでPBSに保管してください。
    注意:パラホルムアルデヒドは、吸入、皮膚と接触し、飲み込んだ場合に有毒です。安全データシートを読んでから操作してください。
    注:眼球全体の断面が行われている場合、網膜剥離を避けるために、サンプリング中または組織処理の任意の段階で眼球に圧力をかけないでください。
  6. NV の量と AVA のサイズを定量化するために、レティナル フラット マウントを準備します。あるいは、眼球/レチナを処理して、体質学、またはRNAまたはタンパク質分析を行います。マイクロハサミと鉗子を用いて、ステレオ顕微鏡でレチナを解剖する。
    1. 眼球をPBSに入れ、針(23G)で手足の眼球を湿らせて穿刺し、湾曲したマイクロハサミで手足の周りを切って虹彩と角膜を取り除きます。
    2. 慎重に、はさみの先端を、眼神経に向かって切り取り、皮切りと切り傷の間に置きます。眼球の反対側にも同じことを行い、レチンカップが露出するまで慎重に切り取り/引き裂きます。レティナルカップからレンズを引き出し、カップにPBSを加えます。
    3. すべてのヒアロイド血管、炎および破片を除去し、その後、残骸を傷つけることなく。レチンカップにPBSを加えて、レティナを洗います。まっすぐなマイクロハサミで、4つの切開(12、3、6、9時)を行い、花のような構造を作ります。必要に応じて、サンプルを取り付ける前に、外科用ブレードで切り傷を行います。柔らかいペイントブラシを使用してレティナをよくプレートに持ち上げて染色します。
  7. 内皮細胞の表面を染色するイソレクチンB4を使用して、レチナル血管系にラベルを付けます(動物にFITC-dextranを浸透させなかった場合)。1時間ブロッキングバッファー(10% NGS + 0.5% トリトン)でレティナをインキュベートし、1%NGS + 0.1% トリトンをTBSで10分間洗浄します。蛍光色素共役イソレクチンB4(5-10μg/ml)を1%NGS+0.1%トリトンで一晩+4°Cで光から保護しながら、レチナをインキュベートします。
    注:必要に応じて、特定の抗体を使用して炎症細胞や潜血細胞などの他の細胞にラベルを付けます。
  8. TBSで1%NGS + 0.1%トリトンで10分間レチナ3倍を洗い、内側のレチナを上向きに向けた顕微鏡スライドでレチナを持ち上げます。柔らかい絵筆を使用して慎重にレティナを広げ、残りのヒアロイド容器や破片を取り除きます。取り付け用メディアをカバースリップに加え、遺素の上に置きます。レチナを+4 °Cで保存し、光から保護します。

6. フラットマウントの解析

  1. 10xの目的を持つ蛍光顕微鏡を使用して、レティナルフラットマウントの画像を撮ります。表面血管叢および前脳血管新生に焦点を当てる。タイルスキャン画像を作成して、全体のretinaをキャプチャし、タイルスキャンをマージします
  2. 画像処理プログラムを使用して、AVA、NVの面積、および全レティナル領域を測定して画像を定量化します( 資料表を参照)。
    1. 自由な手描きツールを使用して、AVAと総レチナル領域を描画し、選択ツールを使用して新血管領域を選択します。ソフトウェアは、対象領域をピクセル単位で測定し、AVAとNV領域(ピクセル単位で表す)を使用して、総領域に対するパーセンテージを計算することができます。また、NV を定量化するためのソフトウェア ツールもいくつか用意されています。
      注:最近、ディープラーニングニューラルネットワークを用いたOIR画像の主要値を定量化するためのオープンソースの完全自動化プログラムが導入され、RET-AVAとNV(例えば、https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21の再現可能な定量化のための信頼性の高いツールを提供しています。
  3. 個々の細胞集団の免疫組織化学的検出に抗体を用いる場合、必要に応じて、必要に応じて、手で、または自動画像分析システムによって、染色された細胞(ミクログリア、 図2Bなど)を、レチナルフラットマウントから定量化します。

7. 統計

  1. 必要に応じて、スチューデントのt検定またはワンウェイANOVAで正規分布データを分析し、その後にダネットまたはTukeyの複数比較テストを行います。マン・ホイットニーU検定や、非正規分布データのクルスカル・ウォリス検定などのノンパラメトリック検定を使用します。P < 0.05 レベルで統計的に有意な差を考慮してください。

結果

モデルの主な結果は血管表現型:AAのサイズとNVの量です。マウスOIRモデルでは、血管軟化は中央のレチナ(図2A)で起こり、ラットモデルでは周囲に発症する、すなわちヒトROP22 と同様である(図3A)。これは、マウスが高酸素状態に曝露されると表面血管叢が既に発症しており、一方ラットモデルでは、OIR誘導時の無血管(P0)である。?...

ディスカッション

疾患表現型の重症度は、マウスおよびラットOIRモデル23の両方における株およびベンダーの両方に依存する。これは、病理の発達に広い遺伝子学的変動があることを示唆している。一般に、色素化したげっ歯類は、アルビノよりも重篤な表現型を発症する。例えば、アルビノBALB/cの血管系の筋血管は、高酸素症後に急速に血管化し、全24でNVを発症しない。?...

開示事項

著者マリア・ヴェハトゥパ、博士号、ニーナ・ヤスケカイネン、マルク・セラダ・ヒメネス、博士号、ルビーナ・タパは、株式会社実験の従業員です。

著者ギドリウス・カレスニカス博士は、この記事で使用される前臨床OIRモデルを採用した契約研究サービスを提供する従業員(社長兼最高経営責任者)および株式会社エクスペリシカの株主です。

テロ・ヤルヴィネン博士、博士号、ハネレ・ウシタロ=ヤルヴィネン博士は何も開示する必要はありません。

謝辞

マリアンヌ・カールスバーグ、アン・マリ・ハーパニエミ、パイヴィ・パルタネン、アン・カンクネンの技術サポートに感謝します。この研究は、フィンランドアカデミー、パイビキ、サカリ・ソールバーグ財団、タンペレ結核財団、フィンランド医学財団、ピルカンマー病院地区研究財団、タンペレ大学病院研究基金によって資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
33 gauge, Small Hub RN NeedleHamilton Company7803-05, 10mm, 25°, PS4For intravitreal injection
Adobe PhotoshopAdobe Inc.For image analysis
Air pump air100Eheim GmbH & Co. KG.143207For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 APUniventor Ltd.2360309For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda limeVWR International Ltd22666.362For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/gVET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 17 05 79For inhalation anaesthesia
BrushFor preparation of flat mounts
Carbon dioxide gasFor sacrifice
Celeris D430 ERG systemDiagnosys LLC121For in vivo ERG
Cell culture dishesGreiner Bio-One International GmbH664 160For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mLVET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 08 78 96For anaesthesia
Cover slipsThermo Fisher Scientific15165452For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and DehumidifierCoy Laboratory ProductsClosed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensorBioSphenix, Ltd.E207, 1801901For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT)Bioptigen, Inc.BPN000668For in vivo imaging
Eye spearsBeaver-Visitec International, Inc.0008685For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light sourceMikron11140For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium saltMerck KGaAF6377-100GFor in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter)UNO Roestvaststaal BVGEX 17015249For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RNHamilton Company7633-01For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA)Heidelberg Engineering GmbHSpec-KT-05488For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 ConjugateThermo Fisher ScientificI21411For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mLIntervet International B.V.vnr 51 14 85For anaesthesia
Medicinal Oxygen gasFor disease model induction
Mice C57BL/6JRjJanvier LabsAlso other strains possible
Microscope slidesThermo Fisher ScientificJ1800AMNZFor preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit)Bausch & Lomb U.K Limitedvnr 24 11 304For intravitreal injection
Nitrogen gasFor disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/gSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 01 11For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/mlSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 03 43For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/mlSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 03 50For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/mlSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 04 12 36For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamberBioSphenix, Ltd.803For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamberBioSphenix, Ltd.538For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD)Charles River LaboratoriesAlso other strains possible
Revertor 5 mg/mLVET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 13 04 97For anaesthesia reversal
Silica gelFor humidity control during model induction
Systane Ultra 10mlAlconTamro 2050250For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7mlAlconTamro 2064871For hydration of the eye
Transfer pipetteThermo Fisher Scientific1343-9108For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying ovenVWRVL180S 170301For drying silica gel
VisiScope SZT350 StereomicroscopeVWR481067For intravitreal injection or tissue collection

参考文献

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