JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Oksijen kaynaklı retinopati (OIR), prematürite retinopatisi ve proliferatif diyabetik retinopati gibi iskemik retina hastalıklarını modellemek ve neovasküler hastalıklar için antianjiyojenik ilaçların değerlendirilmesinde kavram kanıtı çalışmaları için bir model görevi görmek için kullanılabilir. OIR, retinada ölçülebilen sağlam ve tekrarlanabilir neovaskülarizasyona neden olur.

Özet

İskemik retinopatiler için yaygın olarak kullanılan modellerden biri oksijen kaynaklı retinopati (OIR) modelidir. Burada OIR modeli indüksiyonu için ayrıntılı protokolleri ve hem farelerde hem de sıçanlarda okumalarını açıklıyoruz. Retinal neovaskülarizasyon OIR'de kemirgen yavrularını hiperoksi (fareler) veya alternatif hiperoksi ve hipoksi (sıçanlar) seviyelerine maruz kalarak indüklenmiştir. Bu modellerin birincil okumaları retinadaki neovasküler (NV) ve avasküler (AVA) alanların büyüklüğüdür. Bu preklinik in vivo model, potansiyel anti-anjiyojenik ilaçların etkinliğini değerlendirmek veya genetik olarak manipüle edilmiş hayvanlar kullanarak retina anjiogenezinde belirli genlerin rolünü ele almak için kullanılabilir. Model, deneyleri tasarlarken dikkate alınması gereken OIR indüksiyonunda bazı gerilme ve satıcıya özgü varyasyonlara sahiptir.

Giriş

Anjiyojenik göz hastalıklarının arkasındaki patolojiyi incelemek ve bu yıkıcı hastalıklara yeni terapötikler geliştirmek için güvenilir ve tekrarlanabilir deneysel modellere ihtiyaç vardır. Patolojik anjiogenez, ıslak yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve bunların arasında prematürite retinopatisi (ROP), proliferatif diyabetik retinopati (PDR) ve retinal ven tıkanıklığı (RVO)1, 2,3,4gibi birçok iskemik retina hastalığı için ayırt edicidir. İnsan ve kemirgen retinaları benzer bir gelişim modelini izler, çünkü hem insan hem de kemirgen retinası damarlı son dokular arasındadır. Retina vaskülat tamamen gelişmeden önce, retina besin kaynağını hyaloid vaskülürden alır, bu da retinal vaskülat gelişmeye başladığında geriler1,2. İnsanda, retinal vasküler gelişim doğumdan önce tamamlanır, kemirgenlerde ise doğumdan sonra retinal vaskülat büyümesi meydana gelir. Retinal vasküler gelişim kemirgenlerde postnatal olarak gerçekleştiğinden, anjiogenez2,3. Yenidoğan kemirgenler, üçüncü doğum sonrası haftanın sonuna kadar tam vasküler retina gelişimi elde edilene kadar yavaş yavaş gelişen bir avasküler retinaya sahiptir4. Yenidoğan faresinin büyüyen kan damarları plastiktir ve hiperoksi uyaranı sırasında gerileme geçirirler5.

ROP, Doğum ağırlığı 1.250 g6,7'nin altında olan prematüre bebeklerin neredeyse% 70'ini etkilediği için Batı ülkelerinde çocukluk körlüğünün önde gelen nedenidir. ROP, retina damarları normal büyümesini tamamlamadan doğan prematüre bebeklerde görülür. ROP iki aşamada ilerler: Faz I'de, preterm doğum retina vasküler büyümeyi geciktirir, faz II'den sonra, gelişmekte olan retinanın bitmemiş vaskülerleşmesi hipoksiye neden olur, bu da yeni ve anormal kan damar büyümesini uyaran anjiyojenik büyüme faktörlerinin ifade edilmesine neden olur8. OIR modeli, ROP ve diğer iskemik retinopatilerin patofizyolojisini incelemek ve yeni ilaç adaylarını test etmek için yaygın olarak kullanılan bir model olmuştur2,3,9. Oküler ve oküler olmayan hastalıklar için potansiyel antianjiyojenik ilaçlar için kavram kanıtı çalışmaları yapmak için tekrarlanabilir bir model olarak kabul edilir. İki kemirgen modeli, yani fare ve sıçan OIR, model indüksiyonu ve hastalık fenotipinde farklılık gösterir. Sıçan modeli ROP fenotipini daha doğru bir şekilde taklit eder, ancak fare modeli retina neovaskülarizasyonu (NV) için daha sağlam, hızlı ve tekrarlanabilir bir model sağlar. Fare modelinde, NV merkezi retinaya gelişir. Bu patolojik okuma, PDR, RV ve eksüdatif AMD gibi birçok iskemik retinopatinin yanı sıra kanser gibi oküler olmayan, anjiyojenik hastalıklar için farmakolojik etkinlik çalışmalarında önemlidir. Ayrıca, genetik olarak manipüle edilmiş (transgenik ve nakavt) farelerin mevcudiyeti, fare OIR modelini daha popüler bir seçenek haline getirir. Bununla birlikte, ne fare ne de sıçan OIR modeli, insan hastalıklarında tipik olan retina fibrozisi oluşturur.

Yüksek oksijen seviyelerinin 1950'lerde ROP gelişimine katkıda bulunduğunun anlaşılması10,11 hayvan modellerinin gelişmesine yol açmıştır. Oksijenin retinal vaskülür üzerindeki etkisi ile ilgili ilk çalışmalar 195012 , 13,14'te yapılmış ve 1990'lara kadar OIR modelinde birçok iyileştirme yapılmıştır. Smith ve arkadaşları tarafından 1994 yılında yapılan araştırma, hyaloidopatiyi retinopati15'tenayıran mevcut fare OIR modeli için bir standart belirledi. Connor ve ark. (2009) tarafından vazo-yok etme ve patolojik NV'yi ölçme yönteminin geniş bir şekilde benimsenmesi popülaritesini daha da artırdı16. Bu modelde, fareler P7'de 5 gün boyunca% 75 oksijene (O2)yerleştirilir, ardından normoksik koşullarda 5 gün. P7'den P12'ye hiperoksi, retina vaskülatlarının merkezi retinada gerilemesine neden olur. Normoksik durumlara geri döndüğünde, avasküler retina hipoksik hale gelir (Şekil 1A). Avasküler merkezi retinanın hipoksik uyaranları nedeniyle, retina kan damarlarının bir kısmı vitreusa doğru filizlenir ve preretinal tufts2,3olarak adlandırılan preretinal NV oluşturur. Bu tutamlar olgunlaşmamış ve hiperpermezik. NV miktarı P17'de zirveler, daha sonra geriler. Retina tamamen revaskülarizedir ve NV P23 - P25 (Şekil 2A)2,3tarafından tamamen geriletilir.

Sıçan OIR modeli (farklı O2seviyeleri kullanılarak) ilk olarak 1990'larda, değişen O2 seviyelerinin% 80 ve% 40'ta% 80'in altında daha belirgin NV'ye neden olduğunu gösteren açıklanmıştır O2 sürekli maruz kalma17. Daha sonra, O2'nin hiperoksiden (%50) geçtiği aralıklı hipoksi modelinin hipoksiye (%10-12), %80/40 O2 model18'dendaha fazla NV'ye neden olur. % 50/10 modelinde, sıçan yavruları 24 saat boyunca% 50'ye maruz kalır, ardından% 10 O2'de 24saat . Bu döngüler, sıçan yavrularının normoksik koşullara geri döndüğü P14'e kadar devam eder (Şekil 1B). İnsan ROP hastalarında olduğu gibi, sıçan modelinde de avasküler alanlar olgunlaşmamış retinal vasküler pleksus nedeniyle retinanın çevresine gelişir (Şekil 3).

Her iki modelde de, genellikle ölçülen ana parametreler AVA ve NV'nin boyutudur. Bu parametreler tipik olarak endotel hücrelerinin4,16olarak etiketlendiği retina düz montajlarından analiz edilir. Daha önce preretinal NV miktarı, iç sınırlayıcı zarın üzerinde vitreusa kadar uzanan kan damarı veya vasküler hücre çekirdekleri sayılarak retina kesitlerinden değerlendirildi. Bu yaklaşımın en büyük sınırlaması, AVA'ları ölçmenin mümkün olmamasıdır.

Protokol

Burada açıklanan protokol Finlandiya Ulusal Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (protokol numarası ESAVI/9520/2020 ve ESAVI/6421/04.10.07/2017).

1. Deneysel hayvanlar ve fare OIR modeli indüksiyonu

NOT: Yavruların aynı gün doğması için zaman çiftleşmesine neden olan hayvanları, örneğin yaygın olarak kullanılan C57BL/6J fareleri kullanın. Hiperoksinin indüksiyonu sırasında ve sonrasında yavruları emzirmek için 129 suş (129S1/SvImJ veya 129S3/SvIM) emziren barajlar kullanın. Alternatif olarak, bakım barajlarının tükenme nedeniyle değiştirilmesi gerektiğinde ekstra emziren barajlar olduğundan emin olun. C57BL/ 6J fareler / barajlar kullanırken her baraj için çöp boyutunu 6-7 yavru ile kısıtlayın (yavrular, yavruların sınırlı kilo alımına sahip olma eğiliminde olduğundan daha büyükse)16.

  1. Hiperoksi indüksiyondan önce ve sonra ve kurban anında hayvanların ağırlığını kaydedin.
  2. Kafesin dibinde yeterli yiyecek olduğundan emin olun, böylece barajlar yiyeceğe kolay erişime sahiptir.
  3. Filtrasyon sistemi kullanılmadığında fazla CO2'yi emmek için odanın altına renk göstergesine sahip soda kireç ekleyin.
  4. Odanın içindeki nemi ve sıcaklığı izleyin ve nemi% 40 ila 65 arasında tutun. Gerekirse, odanın dibine su ile bulaşıklar yerleştirerek odanın nemini artırın (örneğin, Petri yemekleri).
  5. O2 sensörini %100 O2 ve normal oda havasıyla kalibre edin.
  6. P7 farelerini bir odaya yerleştirin ve O2 seviyesini% 75'e ayarlayın. Fareleri P12'ye kadar 5 gün boyunca odada tutun. Hiperoksi indüksiyonu sırasında hazneyi açmaktan kaçının. O2 silindirinin gaz basıncını kontrol edin ve gerektiğinde silindiri değiştirin. İndüksiyon sırasında hayvanları izleyin.
  7. Fare kafeslerini odadan çıkar ve tüm yavruları tart. Yavruları ağırlığa göre grupla, böylece her deney grubu yavrularda benzer ağırlık dağılımına sahiptir.

2. Deney hayvanları ve sıçan OIR modeli indüksiyonu (yarı kapalı sistem kullanılarak)

NOT: Yavruların aynı gün doğmasını sağlamak için zamanla çiftleşen hayvanları kullanın. Sıçan OIR için, sıçan modelinde yeterli NV indüksiyonu elde etmek için yaklaşık 18 yavru / baraj olmak üzere artan çöp boyutu kullanın. Her çöpe yeterli yavru elde etmek için birkaç çöpten havuz yavruları.

  1. Hayvanların ağırlığını indüksiyondan önce ve sonra ve kurban anında kaydedin.
  2. Kafesin dibinde yeterli yiyecek olduğundan emin olun, böylece barajlar yiyeceğe kolay erişime sahiptir.
  3. Filtrasyon sistemi kullanılmadığında fazla CO2'yi emmek için odanın altına renk göstergesine sahip soda kireç ekleyin.
  4. Odanın içindeki nemi ve sıcaklığı izleyin. Odanın altına silika jel ekleyerek ekstra nemi (birden fazla sayıda sıçandan üretilen) emer.
  5. O2 sensörini %100 N2 ve normal oda havasıyla kalibre edin.
  6. Sıçanları P0'daki odaya yerleştirin (doğumdan birkaç saat sonra). O2 seviyesini % 50'ye ayarlayın ve O2 silindirini 24 saat boyunca hazneye bağlayın. Bundan sonra, ayarları% 10 O2'ye geçirin ve azot (N2)silindirini 24 saat boyunca odaya bağlayın. 14 gün boyunca % 50 ila% 10 O 2 seviyeleri arasında24 saat bisiklet sürmeye devam edin.
  7. Çalışma sırasında gaz tüketimini ve hayvanların refahını izleyin. %50/10 O2 arasındaki değişim sırasında hazneyi açın ve gerekirse daha fazla yiyecek ve su ekleyin. İndüksiyon sırasında hayvanların kafeslerini temiz olacak şekilde değiştirin.
  8. Fare kafeslerini odadan çıkar ve tüm yavruları tart. Yavruları ağırlığa göre gruplaştır, böylece her deney grubu yavrularda benzer ağırlık dağılımına sahiptir.

3. İlaç kullanımı (isteğe bağlı)

NOT: OIR'de yaygın olarak kullanılan ilaç uygulama yolu intravitreal tedavi (ivt), fareler için P12-P14 ve sıçanlar için P14'tedir. Deneysel kuruluma göre tedavi gününü belirleyin. Deneylerde birden fazla yavru kullanıldığında, tüm yavrulardan hayvan olması için tedavi gruplarını bölün. Tercihen, ilacı sadece bir göze enjekte edin ve karşıt gözü kontrol olarak tutun.

  1. Hayvanları tartın ve kuyruğa ve/veya kulağa kimlik işaretleri yapın.
  2. Hayvanı enjekte edilebilir anestezi (örneğin ketamin ve medetomidin karışımı, fareler için 30 mg/kg ve 0,4 mg/kg) veya inhalasyon anestezisi (% 2-3,5 izofluran ve 200-350 mL/ dk hava akışında izofluran) ile uyuşturun. Parmak uçlarını kıstırarak anestezinin derinliğini kontrol edin. Tedavi sırasında hayvanı bir ısıtma yastığında tutun.
  3. Lokal anestezi için göz kapağına bir damla analjezik uygulayın. Fareler ve sıçanlar P14 etrafında gözlerini açtığından, ivt'yi gerçekleştirmeden önce göz kapağınıps ile dikkatlice açın. Korneaya bir damla analjezik (örneğin oksibuprokain hidroklorür) uygulayın.
  4. Ivt enjeksiyonu yapmadan önce bir damla iyot uygulayın.
  5. Ivt enjeksiyonu için 33-34 G iğnesi takılı bir cam şırınga kullanın. Göz kapaklarını aşağı bastırın ve göz küresini asalarla kavrayın. Enjeksiyon arkasını limbusun içine, yaklaşık olarak optik sinire doğru işaret eden 45° açılı iğne yapın.
  6. İntravitreal alana 1,0 μL'den fazla enjekte etmekten kaçının. Enjekte edilen çözeltinin reflüden kaçınmak için ilacı enjekte ettikten sonra iğneyi 30 s yerinde tutun.
  7. İğneyi çıkardıktan sonra kanamalar veya retina hasarı gibi komplikasyonlar için gözü (örneğin oftalmoskopla) inceleyin. Enjeksiyondan sonra korneanın üzerine antibiyotik merhem uygulayın.
    NOT: Fareler için ivt enjeksiyon hacmi 0,5 – 1,0 μL olmalıdır.
  8. Anesteziyi tersine çevirin (örneğin medetomidin için bir α2-antagonist ile (2,5 mg / kg) ve yavruyu kafese geri koyun. Çöpü çalışmanın sonuna kadar normal şekilde barındırın.

4. In vivo görüntüleme ve elektroretinografi (isteğe bağlı)

  1. İstenirse, anjiyojenik yanıtlar sırasında retinada gelişen değişiklikleri kaydetmek için takip süresi boyunca canlı hayvanlar üzerinde in vivo görüntüleme gerçekleştirin. Örneğin, vaskülatı görselleştirmek için floresan anjiyografi (FA) veya tarama lazer konfokal mikroskopi19 gerçekleştirin (Şekil 4). Retina katmanlarını in vivo olarak görselleştirmek için spektral etki alanı optik tutarlılık tomografisini (SD-OCT) kullanın (Şekil 4).
  2. İstenirse, elektroretinografi (ERG) kullanarak OIR indüksiyonu sonrası farklı retina hücre popülasyonlarındaki fonksiyonel değişiklikleri araştırın (Şekil 5).

5. Doku toplama ve retina düz montajların hazırlanması

NOT: Dokuları istenen araştırma hipotezine göre toplayın. Fareler için, örnekleri örneğin P12'de (hiperoksik fazdan sonra vazo-obliterasyonu incelemek için) veya hipoksik dönemde (P13-P17) toplayın. NV miktarındaki tepe noktasını tespit etmek için örnekleme için en yaygın zaman noktası olan P17'de fare OIR örneklerini toplayın. Sıçan OIR'de, en yüksek NV miktarını gözlemlemek için örnekleri P18-P21'de toplayın (Şekil 3).

  1. Örneklemeden önce hayvanları tartın.
  2. Retinal vaskülatürü etiketlemek için, derin anesteziye maruz hayvanlar FITC-dekstran ile transkardiyel olarak perfüzyon yapılabilir. (Alternatif olarak, retina düz montajlarını daha sonra Isolectin ile lekelenin).
  3. Aşırı dozda anestezi ilaçları (örneğin ketamin ve medetomidin karışımı, fareler için 300 mg / kg ve 4 mg / kg) veya CO2 inhalasyonu kullanarak hayvanları kurban edin.
  4. Kavisli tokalarla göz küresinin arkasına tutunarak hayvanların gözlerini toplayın, gözlerin etrafındaki dokuyu kesin ve gözü yörüngeden kaldırın.
  5. Gözbebeklerini taze yapılmış, filtrelenmiş% 4 paraformaldehitte (fosfat tamponlu salin, PBS'de) 1-4 saat kuluçkaya yatırın. Fiksatifi çıkarın ve gözbebeklerini PBS ile 3 x 10 dk yıkayın. Retinaları hemen parçalara alın veya PBS'de +4 °C'de saklayın.
    DİkKAT: Paraformaldehit solunması, ciltle temas halinde ve yutulması durumunda toksiktir. Lütfen çalışmadan önce güvenlik veri sayfasını okuyun.
    NOT: Tüm göz kürelerinden kesitler yapılırsa, retina dekolmanını önlemek için örnekleme sırasında veya doku işleminin herhangi bir aşamasında göz küresine basınç uygulamayın.
  6. NV miktarını ve AVA'ların boyutunu ölçmek için retina düz montajları hazırlayın. Alternatif olarak, histoloji veya RNA veya protein analizi için göz kürelerini / retinaları işleyin. Retinayı stereo mikroskop altında mikro makas ve etops kullanarak parçalara ayrıştırın.
    1. Göz küresini nemli tutmak için PBS'ye yerleştirin ve göz küresini bir iğneyle (23G) limbusta delin ve iris ve korneayı çıkarmak için kavisli mikro makasla limbus etrafında kesin.
    2. Makasın ucunu sklera ve retina arasına dikkatlice yerleştirin ve sklerayı optik sinire doğru kesin. Aynı şeyi göz küresinin diğer tarafına da yapın ve retina kabı açığa çıkana kadar sklerayı dikkatlice kesin / yırtın. Lensi retina kabından çıkarın ve fincana PBS ekleyin.
    3. Retinaya zarar vermeden tüm hyaloid damarları, vitreus ve döküntüleri çıkarın. Retina kabına PBS ekleyerek retinayı yıkayın. Çiçek benzeri bir yapı yapmak için retinaya düz mikro makasla dört kesi (saat 12, 3, 6 ve 9'da) yapın. İsteğe bağlı olarak, numuneleri monte etmeden önce cerrahi bıçakla kesimleri yapın. Yumuşak bir boya fırçası kullanarak retinayı boyama için iyi bir tabağa kaldırın.
  7. Endotel hücrelerinin yüzeyini lekeleyen Isolectin B4 kullanarak retinal vaskülatürü etiketleyin (hayvanlar FITC-dekstran ile perfüzyona maruz kalmadıysa). Retinaları bloke tamponunda (%10 NGS + TBS'de %0,5 Triton) 1 saat kuluçkaya yatırın ve 10 dakika boyunca TBS'de %1 NGS + %0,1 Triton ile yıkayın. Işıktan korunurken bir gecede TBS'de%1 NGS + %0,1 Triton'da floresan boya konjuge Isolectin B 4 (5-10μg/ml) ile retinaları kuluçkaya yatırın.
    NOT: İsterseniz, belirli antikorları kullanarak enflamatuar hücreler ve perisitler gibi diğer hücreleri etiketleyin.
  8. Tbs'de %1 NGS + %0,1 Triton ile retinaları 10 dakika boyunca 3x yıkayın ve retinaları mikroskobik bir slaytta, iç retina yukarı bakacak şekilde kaldırın. Retinayı yumuşak boya fırçası kullanarak dikkatlice yayın ve kalan hyaloid kaplarını veya kalıntılarını çıkarın. Kapak kaymasına montaj ortamı ekleyin ve retinanın üzerine yerleştirin. Retinaları +4 °C'de saklayın ve ışıktan koruyun.

6. Düz montajların analizi

  1. 10x hedefe sahip bir floresan mikroskobu kullanarak retina düz montajlarının görüntülerini alın. Yüzeysel vasküler pleksusa ve preretinal neovaskülarizasyona odaklanın. Tüm retinayı yakalamak ve karo taramalarını birleştirmek için bir karo tarama görüntüsü yapın
  2. Bir görüntü işleme programı kullanarak AVA'ları, NV alanını ve toplam retina alanını ölçerek görüntüleri ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
    1. Ücretsiz bir el çizim aracı kullanarak AVA'ları ve toplam retina alanını çizin ve bir seçim aracı kullanarak neovasküler alanları seçin. Yazılım, ilgi alanlarını piksel cinsinden ölçür ve AVA ve NV alanları (piksellerle ifade edilir) toplam retina alanına göre yüzdelerini hesaplamak için kullanılabilir. Ayrıca, NV'yi ölçmek için bazı yazılım araçları mevcuttur.
      NOT: Son zamanlarda, derin öğrenme sinir ağları kullanarak OIR görüntülerinin temel değerlerinin ölçülmesi için açık kaynaklı, tam otomatik programlar tanıtıldı ve retina AVA ve NV'nin (örneğin, https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64) tekrarlanabilir nicelemesi için güvenilir bir araç sağladı20,21.
  3. Bireysel hücre popülasyonlarının immünohistokimyasal tespiti için antikor kullanıyorsanız, retina düz montajlarından elde veya istenirse otomatik görüntü analiz sistemleriyle lekeli hücrelerin (mikroglia, Şekil 2Bgibi) sayısını ölçün.

7. İstatistikler

  1. Normalde dağıtılan verileri Student's t testine veya One-Way ANOVA'ya ve ardından Dunnett'in veya Tukey'in çoklu karşılaştırma testine göre analiz edin. Normalde dağıtılmayan veriler için Mann-Whitney U testi veya Kruskal Wallis testi gibi nonparametrik testler kullanın. P < 0.05 düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları göz önünde bulundurun.

Sonuçlar

Modelin ana sonucu vasküler fenotiptir: AVA'ların büyüklüğü ve NV miktarı. Fare OIR modelinde, vazo-obliterasyon merkezi retinada meydana gelir (Şekil 2A), sıçan modelinde ise periferde, yani insan ROP22'ye benzer şekilde gelişir (Şekil 3A). Bunun nedeni, fareler hiperoksiye maruz kaldığında yüzeyel vasküler pleksus zaten gelişmiştir, sıçan modelinde retina OIR indüksiyonu sırasında avaskülerdir (P0). Preretinal...

Tartışmalar

Hastalık fenotipinin şiddeti hem fare hem de sıçan OIR modellerinde hem zorlanmaya hem de satıcıyabağlıdır 23. Bu, patoloji gelişiminde geniş bir genotipik değişkenlik olduğunu göstermektedir. Genel olarak, pigmentli kemirgenler albino olanlardan daha şiddetli fenotip geliştirir. Örneğin, albino BALB /c'nin retinal vaskülatürü hiperoksiden sonra hızla revaskülarize olur ve24'teNV gelişmez. Benzer şekilde, sıçanlarda, pigmentli Kahverengi Norveç ...

Açıklamalar

Yazarlar Maria Vähätupa, PhD, Niina Jääskeläinen, Marc Cerrada-Gimenez, PhD ve Rubina Thapa Experimentica Ltd.'nin çalışanlarıdır.

Yazar Giedrius Kalesnykas, PhD, bu Makalede kullanılan preklinik OIR modellerini kullanan sözleşme araştırma hizmetleri sunan Experimentica Ltd.'nin bir çalışanı (Başkan ve İcra Kurulu Başkanı) ve hissedarıdır.

Tero Järvinen, M.D., PhD ve Hannele Uusitalo-Järvinen, M.D., PhD, açıklayacak hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen ve Anne Kankkunen'e mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma Finlandiya Akademisi, Päivikki ve Sakari Sohlberg Vakfı, Tampere Tüberküloz Vakfı, Finlandiya Tıp Vakfı, Pirkanmaa Hastanesi Bölge Araştırma Vakfı ve Tampere Üniversite Hastanesi Araştırma Fonu tarafından finanse edildi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
33 gauge, Small Hub RN NeedleHamilton Company7803-05, 10mm, 25°, PS4For intravitreal injection
Adobe PhotoshopAdobe Inc.For image analysis
Air pump air100Eheim GmbH & Co. KG.143207For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 APUniventor Ltd.2360309For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda limeVWR International Ltd22666.362For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/gVET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 17 05 79For inhalation anaesthesia
BrushFor preparation of flat mounts
Carbon dioxide gasFor sacrifice
Celeris D430 ERG systemDiagnosys LLC121For in vivo ERG
Cell culture dishesGreiner Bio-One International GmbH664 160For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mLVET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 08 78 96For anaesthesia
Cover slipsThermo Fisher Scientific15165452For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and DehumidifierCoy Laboratory ProductsClosed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensorBioSphenix, Ltd.E207, 1801901For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT)Bioptigen, Inc.BPN000668For in vivo imaging
Eye spearsBeaver-Visitec International, Inc.0008685For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light sourceMikron11140For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium saltMerck KGaAF6377-100GFor in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter)UNO Roestvaststaal BVGEX 17015249For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RNHamilton Company7633-01For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA)Heidelberg Engineering GmbHSpec-KT-05488For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 ConjugateThermo Fisher ScientificI21411For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mLIntervet International B.V.vnr 51 14 85For anaesthesia
Medicinal Oxygen gasFor disease model induction
Mice C57BL/6JRjJanvier LabsAlso other strains possible
Microscope slidesThermo Fisher ScientificJ1800AMNZFor preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit)Bausch & Lomb U.K Limitedvnr 24 11 304For intravitreal injection
Nitrogen gasFor disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/gSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 01 11For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/mlSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 03 43For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/mlSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 03 50For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/mlSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 04 12 36For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamberBioSphenix, Ltd.803For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamberBioSphenix, Ltd.538For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD)Charles River LaboratoriesAlso other strains possible
Revertor 5 mg/mLVET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 13 04 97For anaesthesia reversal
Silica gelFor humidity control during model induction
Systane Ultra 10mlAlconTamro 2050250For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7mlAlconTamro 2064871For hydration of the eye
Transfer pipetteThermo Fisher Scientific1343-9108For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying ovenVWRVL180S 170301For drying silica gel
VisiScope SZT350 StereomicroscopeVWR481067For intravitreal injection or tissue collection

Referanslar

  1. Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
  2. Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
  3. Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873 (2020).
  4. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  5. Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
  6. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  7. Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
  8. Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
  9. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  10. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
  11. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
  12. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C., Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  13. Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
  14. Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
  15. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  18. Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
  19. Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
  20. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585 (2017).
  21. Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
  22. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  23. Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
  24. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
  25. Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
  26. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  27. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  28. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  29. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  30. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  31. Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
  32. Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
  33. Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
  34. Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
  35. Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
  36. Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649 (2016).
  37. Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
  38. Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
  39. Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
  40. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  41. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  42. Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
  43. Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876 (2017).
  44. Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
  45. Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167 (2012).
  46. Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
  47. Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
  48. Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
  49. Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559 (2013).
  50. Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287 (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 163anjiogenezneovask larizasyonoksijen kaynakl retinopatiOIRhipoksipremat rite retinopatisiROPdiyabetik retinopatiintravitreal enjeksiyong r nt analiziyapay zekayapay zeka

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır