Modèle de rétinopathie induite par l’oxygène pour les maladies rétiniennes ischémiques chez les rongeurs

Résumé

La rétinopathie induite par l’oxygène (OIR) peut être utilisée pour modéliser les maladies rétiniennes ischémiques telles que la rétinopathie de la prématurité et la rétinopathie diabétique proliférative et pour servir de modèle pour des études de preuve de concept dans l’évaluation des médicaments antiangiogéniques pour les maladies néovasculaires. OIR induit une néovascularisation robuste et reproductible dans la rétine qui peut être quantifiée.

Résumé

Un des modèles couramment utilisés pour les rétinopathies ischémiques est le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR). Ici, nous décrivons des protocoles détaillés pour l’induction du modèle OIR et ses readouts chez les souris et les rats. La néovascularisation rétinienne est induite dans l’OIR en exposant les petits rongeurs soit à l’hyperoxie (souris) soit en alternant les niveaux d’hyperoxie et d’hypoxie (rats). Les principales lectures de ces modèles sont la taille des zones néovasculaires (NV) et avasculaires (AVA) dans la rétine. Ce modèle in vivo préclinique peut être utilisé pour évaluer l’efficacité des médicaments anti-angiogéniques potentiels ou pour aborder le rôle de gènes spécifiques dans l’angiogenèse rétinienne en utilisant des animaux génétiquement manipulés. Le modèle a une certaine tension et la variation spécifique du fournisseur dans l’induction OIR qui doit être pris en considération lors de la conception des expériences.

Introduction

Des modèles expérimentaux fiables et reproductibles sont nécessaires pour étudier la pathologie derrière les maladies oculaires angiogéniques et pour développer de nouvelles thérapeutiques à ces maladies dévastatrices. L’angiogenèse pathologique est la marque de fabrique de la dégénérescence maculaire liée à l’âge humide (DMLA) et de nombreuses maladies rétiniennes ischémiques dont la rétinopathie de la prématurité (ROP), la rétinopathie diabétique proliférante (DP) et l’occlusion rétinienne des veines (RVO)^1,2,3,4. Les rétines humaines et rongeurs suivent un modèle de développement similaire, car la rétine humaine et la rétine des rongeurs sont parmi les derniers tissus vascularisés. Avant que la vascularisation rétinienne se soit complètement développée, la rétine reçoit son approvisionnement en éléments nutritifs de la vascularisation hyaloïde, qui, à son tour, régresse lorsque la vascularisation rétinienne^{commence à se développer 1,2}. Chez l’homme, le développement vasculaire rétinien est achevé avant la naissance, tandis que chez les rongeurs la croissance de la vascularisation rétinienne se produit après la naissance. Puisque le développement vasculaire rétinien se produit postnatally chez les rongeurs, il fournit un système modèle idéal pour étudier l’angiogenèse^2,3. Les rongeurs nouveau-nés ont une rétine avasculaire qui se développe progressivement jusqu’à ce que le développement complet de la rétine vasculaire soit atteint à la fin de la troisième semaine^{postnatale 4}. Les vaisseaux sanguins croissants de la souris néonatale sont en plastique, et ils subissent une régression pendant le stimulus hyperoxie⁵.

Rop est la principale cause de cécité infantile dans les pays occidentaux, car il affecte près de 70% des prématurés ayant un poids à la naissance de moins de 1250 g^6,7. Le ROP survient chez les prématurés nés avant que les vaisseaux rétiniens ne terminent leur croissance normale. Rop progresse en deux phases: dans la phase I, la naissance prématurée retarde la croissance vasculaire rétinienne où, après la phase II, la vascularisation inachevée de la rétine en développement provoque l’hypoxie, ce qui induit l’expression de facteurs de croissance angiogéniques qui stimulent la croissance nouvelle et anormale des vaisseaux^{sanguins 8}. Le modèle OIR a été un modèle largement utilisé pour étudier la pathophysiologie du ROP et d’autres rétinopathies ischémiques ainsi que pour tester de nouveaux candidats^{médicaments 2,3,9}. Il est largement considéré comme un modèle reproductible pour la réalisation d’études de preuve de concept pour les médicaments antiangiogéniques potentiels pour les maladies oculaires ainsi que non oculaires. Les deux modèles de rongeurs, c’est-à-dire la souris et le rat OIR diffèrent dans leur modèle d’induction et de phénotype de la maladie. Le modèle de rat imite le phénotype ROP avec plus de précision, mais le modèle de souris fournit un modèle plus robuste, rapide et reproductible pour la néovascularisation rétinienne (NV). Dans le modèle de souris, NV se développe à la rétine centrale. Cette lecture pathologique est importante dans les études pharmacologiques d’efficacité pour de nombreuses rétinopathies ischémiques, telles que la RDP, le VR et la DMR exsudative, ainsi que pour les maladies angiogéniques non oculaires comme le cancer. En outre, la disponibilité de souris génétiquement manipulées (transgéniques et knockout) fait du modèle OIR souris une option plus populaire. Cependant, ni la souris ni le rat OIR modèle crée la fibrose rétinienne, qui est typique dans les maladies humaines.

La compréhension que des niveaux élevés d’oxygène contribuent au développement du ROP dans les années^{1950 10,11 a} conduit au développement de modèles animaux. Les premières études sur l’effet de l’oxygène sur la vascularisation rétinienne ont été faites en 1950^12,13,14 et jusqu’aux années 1990, il y avait beaucoup de raffinements au modèle OIR. Les recherches menées par Smith et coll. en 1994 ont établi une norme pour le modèle actuel d’OIR de souris qui sépare l’hyaloidopathy de la rétinopathie¹⁵. Une large adoption de la méthode pour quantifier la vaso-oblitération et la NV pathologique par Connor et coll. (2009) a encore accru sa popularité¹⁶. Dans ce modèle, les souris sont placées à 75% d’oxygène (O₂) pendant 5 jours à P7, suivies de 5 jours dans des conditions normoxiques. L’hyperoxie de P7 à P12 provoque une régression de la vascularisation rétinienne dans la rétine centrale. Au retour aux conditions normoxiques, la rétine avasculaire devient hypoxique (Figure 1A). En raison des stimulus hypoxiques de la rétine centrale avasculaire, certains des vaisseaux sanguins rétiniens poussent vers le vitré, formant le NV preretinal, appelé touffes préretinales^2,3. Ces touffes sont immatures et hyperpermérables. La quantité de NV culmine à P17, après quoi elle régresse. La rétine est entièrement revascularisée et le NV est complètement régressé par P23 - P25 (Figure 2A)^2,3.

Le modèle rat OIR (utilisant différents niveaux d’O₂) a été décrit pour la première fois dans les années 1990 montrant que les différents niveaux_{d’O 2} à 80% et 40% causent un NV plus prononcé que moins de 80% O₂ exposition constante¹⁷. Plus tard, il a été découvert que le modèle d’hypoxie intermittente, où O₂ est pédalé à partir de l’hyperoxie (50%) l’hypoxie (10-12 %), provoque encore plus de NV que le modèle O 2¹⁸à 80/40 %. Dans le modèle 50/10%, les chiots rat sont exposés à 50% pendant 24 heures, suivis de 24 heures dans 10% O₂. Ces cycles se poursuivent jusqu’au P14, lorsque les chiots rat sont retournés à des conditions normoxiques (figure 1B). Comme chez les patients humains de ROP, dans le modèle de rat les secteurs avasculaires se développent à la périphérie de la rétine en raison du plexus vasculaire rétinien immature (figure 3).

Dans les deux modèles, les principaux paramètres qui sont habituellement quantifiés sont la taille d’AVA et de NV. Ces paramètres sont généralement analysés à partir de supports plats rétiniens où les cellules endothéliales sont^{étiquetées 4,16}. Auparavant, la quantité de NV préretinal a été évaluée à partir de sections transversales rétiniennes en comptant les noyaux de vaisseaux sanguins ou de cellules vasculaires s’étendant à vitreux au-dessus de la membrane limitante interne. La principale limite de cette approche est qu’il n’est pas possible de quantifier les AGA.

Protocole

Le protocole décrit ici a été approuvé par le Comité national d’éthique animale de Finlande (numéro de protocole ESAVI/9520/2020 et ESAVI/6421/04.10.07/2017).

1. Induction expérimentale de modèle d’OIR d’animaux et de souris

REMARQUE : Utilisez des animaux aciérés dans le temps, par exemple des souris C57BL/6J couramment utilisées, pour faire naître des petits le même jour. Utiliser des barrages d’accueil, p. ex., 129 souches (129S1/SvImJ ou 129S3/SvIM) pour allaiter les chiots pendant et après l’induction de l’hyperoxie. Sinon, assurez-vous qu’il y a des barrages de lactating supplémentaires disponibles au cas où les barrages de soins infirmiers doivent être remplacés en raison de l’épuisement. Limitez la taille de la portée à 6-7 petits pour chaque barrage lors de l’utilisation de souris/mères C57BL/6J (si les portées sont plus grandes que cela, les chiots ont tendance à avoir un gain de poids limité)¹⁶.

1. Enregistrez le poids des animaux avant et après l’induction de l’hyperoxie, et au moment du sacrifice.
2. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de nourriture au fond de la cage, de sorte que les barrages ont un accès facile à la nourriture.
3. Ajouter de la chaux gazeuse avec un indicateur de couleur au fond de la chambre pour absorber l’excès de CO₂ lorsqu’un système de filtration n’est pas utilisé.
4. Surveillez l’humidité et la température à l’intérieur de la chambre et maintenez l’humidité entre 40 et 65 %. Augmenter l’humidité de la chambre, si nécessaire, en plaçant des plats avec de l’eau au fond de la chambre (p. ex., boîtes de Pétri).
5. Calibrer le capteur O_{2 avec} 100% O_{2 et l’air} normal de la pièce.
6. Placez les souris P7 dans une chambre et installez le niveau O₂ à 75%. Gardez les souris dans la chambre pendant 5 jours, jusqu’à P12. Évitez d’ouvrir la chambre pendant l’induction de l’hyperoxie. Vérifiez la pression de gaz du cylindre O₂ et remplacez le cylindre en cas de besoin. Surveillez les animaux pendant l’induction.
7. Sortez les cages de souris de la chambre et pesez tous les chiots. Regroupez les chiots en fonction du poids de sorte que chaque groupe expérimental ait une répartition du poids similaire chez les chiots.

2. Induction expérimentale de modèle d’animaux et de rat OIR (utilisant le système semi-fermé)

REMARQUE : Utilisez des animaux à osser dans le temps pour faire naître les petits le même jour. Pour rat OIR, utiliser une taille de litière accrue, environ 18 petits/barrage, pour obtenir une induction suffisante de NV dans le modèle de rat. Piscine chiots de plusieurs portées pour obtenir suffisamment de chiots à chaque portée.

1. Enregistrez le poids des animaux avant et après l’induction, et au moment du sacrifice.
2. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de nourriture au fond de la cage, de sorte que les barrages ont un accès facile à la nourriture.
3. Ajouter de la chaux gazeuse avec un indicateur de couleur au fond de la chambre pour absorber l’excès de CO_{2 lorsque} le système de filtration n’est pas utilisé.
4. Surveillez l’humidité et la température à l’intérieur de la chambre. Absorber l’humidité supplémentaire (générée par plusieurs nombres de rats) en ajoutant du gel de silice sur le fond de la chambre.
5. Calibrer le capteur O_{2 avec} 100% N_{2 et l’air} normal de la pièce.
6. Placez les rats dans la chambre à P0 (quelques heures après la naissance). Réglez le niveau O₂ à 50% et connectez le cylindre O₂ à la chambre pendant 24 h. Après cela, passer les paramètres à 10% O_{2 et} connecter l’azote (N₂) cylindre à la chambre pendant 24 h. Continuer le cycle de 24 h entre 50% et 10% O₂ niveaux pendant 14 jours.
7. Surveiller la consommation de gaz et le bien-être des animaux pendant l’étude. Ouvrez la chambre pendant le changement entre 50/10% O_{2 et} ajoutez plus de nourriture et d’eau si nécessaire. Changer les cages des animaux pour les nettoyer pendant l’induction.
8. Sortez les cages à rats de la chambre et pesez tous les chiots. Regroupez les chiots en fonction du poids de sorte que chaque groupe expérimental ait une distribution de peser similaire chez les chiots.

3. Administration de médicaments (facultatif)

REMARQUE : La voie couramment utilisée d’administration de drogue dans OIR est par traitement intravitreal (ivt), à P12-P14 pour des souris et à P14 pour des rats. Déterminez le jour du traitement en fonction de la configuration expérimentale. Lorsque plusieurs portées de petits sont utilisées dans des expériences, divisez les groupes de traitement pour avoir des animaux de toutes les portées. De préférence, injectez la drogue à un seul œil, et gardez l’œil contralatéral comme un contrôle.

1. Pesez les animaux et faites des marques d’identification à la queue et/ou à l’oreille.
2. Anesthésier l’animal soit par anesthésie injectable (par exemple mélange de kétamine et de médetomidine, 30 mg/kg et 0,4 mg/kg pour les souris) soit par anesthésie par inhalation (isoflurane à 2-3,5% isoflurane et 200-350 mL/min de débit d’air). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les ateils. Gardez l’animal sur un coussin chauffant pendant le traitement.
3. Pour l’anesthésie locale, appliquer une goutte d’analgésique sur la paupière. Ouvrez soigneusement la paupière avec des forceps avant d’effectuer l’ivt, comme les souris et les rats ouvrent les yeux autour de P14. Appliquer une goutte d’analgésique (p. ex., hydrochlorure d’oxybuprocaine) sur la cornée.
4. Appliquer une goutte d’iode avant d’effectuer l’injection d’ivt.
5. Pour l’injection ivt utiliser une seringue en verre avec une aiguille de 33-34 G attaché. Appuyez sur les paupières vers le bas et grap le globe oculaire avec des pinces. Faire l’injection postérieure aux limbes, environ dans l’aiguille d’angle de 45^° pointant vers le nerf optique.
6. Évitez d’injecter plus de 1,0 μL dans l’espace intravitreal. Gardez l’aiguille en place pendant 30 s après l’injection du médicament pour éviter le reflux de la solution injectée.
7. Examiner l’œil (p. ex., à l’aide d’un ophtalmoscope) pour toute complication, comme des hémorragies ou des lésions rétiniennes, après avoir enlevé l’aiguille. Appliquer de l’onguent antibiotique sur la cornée après l’injection.
   REMARQUE : Le volume d’injection d’ivt pour les souris devrait être de 0,5 à 1,0 μL.
8. Inverser l’anesthésie (par exemple avec un antagoniste α2 pour la médetomidine (2,5 mg/kg) et retourner le chiot dans la cage. Abritez la litière normalement jusqu’à la fin de l’étude.

4. Imagerie in vivo et électrorétographie (facultatif)

1. Si désiré, effectuer une imagerie in vivo sur des animaux vivants pendant la période de suivi pour enregistrer les changements qui se développent dans la rétine pendant les réponses angiogéniques. Par exemple, effectuez une angiographie de fluorescéine (FA) ou une microscopie confoccale laser^{à balayage 19} pour visualiser la vascularisation (Figure 4). Utiliser la tomographie par cohérence optique du domaine spectral (SD-OCT) pour visualiser les couches rétiniennes in vivo (Figure 4).
2. Si désiré, étudier les changements fonctionnels dans différentes populations de cellules rétiniennes après l’induction de l’OIR en utilisant l’électrorétinographie (ERG) (Figure 5).

5. Collecte de tissus et préparation de montures plates rétiniennes

REMARQUE : Recueillir les tissus selon l’hypothèse de recherche souhaitée. Pour les souris, recueillir les échantillons par exemple à P12 (pour étudier la vaso-oblitération après la phase hyperoxique) ou à la période hypoxique (P13-P17). Recueillir les échantillons de souris OIR à P17, qui est le point de temps le plus commun pour l’échantillonnage, pour détecter le pic en quantité de NV. Dans rat OIR, recueillir les échantillons à P18-P21 pour observer la plus grande quantité de NV (Figure 3).

1. Pesez les animaux avant l’échantillonnage.
2. Pour étiqueter la vascularisation rétinienne, les animaux profondément anesthésiés peuvent être transcardiés perfusés avec fitc-dextran. (Alternativement, tacher les montures plates rétiniennes avec isolectine plus tard).
3. Sacrifier les animaux en utilisant soit une surdose de médicaments d’anesthésie (par exemple mélange de kétamine et de médetomidine, 300 mg/kg et 4 mg/kg pour les souris) ou l’inhalation de CO_2.
4. Recueillir les yeux des animaux en saisissant derrière le globe oculaire avec des forceps incurvés, couper le tissu autour des yeux et soulever l’œil hors de l’orbite.
5. Incuber les globes oculaires dans du paraformaldéhyde fraîchement fait filtré et filtré (en solution saline tamponnée de phosphate, PBS) pendant 1-4 h. Retirer le fixatif et laver les globes oculaires 3 x 10 min avec PBS. Disséquer immédiatement les rétines ou les conserver en PBS à +4 °C.
   AVERTISSEMENT : Le paraformaldéhyde est toxique par inhalation, en contact avec la peau et s’il est avalé. Veuillez lire la fiche de données de sécurité avant de travailler avec elle.
   REMARQUE : N’appliquez pas de pression sur le globe oculaire pendant l’échantillonnage ou n’importe quelle phase du traitement des tissus afin d’éviter le décollement de la rétine, si des sections transversales de globes oculaires entiers sont effectuées.
6. Préparez des supports plats rétiniens pour quantifier la quantité de NV et la taille des AVA. Alternativement, traiter les globes oculaires / rétines pour l’histologie, ou l’ARN ou l’analyse des protéines. Disséquer la rétine au microscope stéréo à l’aide de micro ciseaux et de forceps.
   1. Placez le globe oculaire dans PBS pour le garder humide et percer le globe oculaire à limbus avec une aiguille (23G) et couper autour des limbes avec des micro ciseaux incurvés pour enlever l’iris et la cornée.
   2. Placez soigneusement la pointe des ciseaux entre la sclère et la rétine et coupez la sclère vers le nerf optique. Faites de même de l’autre côté du globe oculaire, et coupez/déchirez soigneusement la sclère jusqu’à ce que la tasse rétinienne soit exposée. Retirez la lentille de la tasse rétinienne et ajoutez PBS à la tasse.
   3. Enlevez tous les vaisseaux hyaloïdes, vitreux et débris sans endommager la rétine. Lavez la rétine en ajoutant du PBS à la tasse rétinienne. Effectuer quatre incisions (à 12, 3, 6 et 9 heures) à la rétine avec des micro ciseaux droits pour faire une structure en forme de fleur. En option, faire les coupes avec la lame chirurgicale avant de monter les échantillons. Soulevez la rétine à l’aide d’un pinceau doux à une plaque de puits pour la coloration.
7. Étiquetez la vascularisation rétinienne à l’aide de l’isolectine B₄ qui tache la surface des cellules endothéliales (si les animaux n’ont pas été perfusés avec fitc-dextran). Incuber les rétines dans le tampon de blocage (10% NGS + 0,5% Triton dans tbs) pendant 1 h et laver avec 1% NGS + 0,1% Triton dans tbs pendant 10 min. Incuber les rétines avec colorant fluorescent conjugué Isolectine B₄ (5-10μg/ml) en 1% NGS + 0,1% Triton dans tbs nuit à +4 °C tout en étant protégé de la lumière.
   REMARQUE : Si désiré, étiquetez d’autres cellules telles que les cellules inflammatoires et les péricytes à l’aide d’anticorps spécifiques.
8. Laver les rétines 3x pendant 10 min avec 1% NGS + 0,1% Triton dans tbs et soulever les rétines sur une lame microscopique, la rétine interne orientée vers le haut. Étendre soigneusement la rétine à l’aide d’un pinceau souple et enlever les vaisseaux hyaloïdes restants ou les débris. Ajouter le milieu de montage à un glissement de couverture et le placer sur le dessus de la rétine. Conservez les rétines à +4 °C et protégez-les de la lumière.

6. Analyse des montures plates

1. Prenez des images des montures plates rétiniennes à l’aide d’un microscope à fluorescence avec objectif 10x. Concentrez-vous sur le plexus vasculaire superficiel et sur la néovascularisation préréaculaire. Faites une image de balayage de tuile pour capturer la rétine entière et fusionner les balayages de tuile
2. Quantifier les images en mesurant les AVA, la zone de NV et la zone rétinienne totale à l’aide d’un programme de traitement d’image (voir tableau des matériaux).
   1. Dessinez les AVA et la zone rétinienne totale à l’aide d’un outil de dessin à main libre et sélectionnez les zones néovasculaires à l’aide d’un outil de sélection. Le logiciel mesure les régions d’intérêt pour les pixels, et les zones AVA et NV (exprimées en pixels) peuvent être utilisées pour calculer leur pourcentage par rapport à la zone rétinienne totale. En outre, certains outils logiciels sont disponibles pour quantifier NV.
      REMARQUE : Récemment, un programme open-source entièrement automatisé pour la quantification des valeurs clés des images OIR à l’aide de réseaux neuronaux d’apprentissage profond a été introduit et fournit un outil fiable pour la quantification reproductible de l’AVA rétinienne et du NV (p. ex., https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)^20,21.
3. Si vous utilisez des anticorps pour la détection immunohistochimique des populations cellulaires individuelles, quantifier le nombre de cellules tachées (comme les microglies, figure 2B)à partir des supports plats rétiniens à la main ou par des systèmes automatisés d’analyse d’image si désiré.

7. Statistiques

1. Analyser les données normalement distribuées par le test t de l’étudiant ou anova à sens unique suivi du test de comparaisons multiples de Dunnett ou Tukey, le cas échéant. Utilisez des tests non paramétriques comme le test Mann-Whitney U ou le test Kruskal Wallis pour les données non normalement distribuées. Tenir compte des différences statistiquement significatives au niveau P < 0,05.

Résultats

Le principal résultat du modèle est le phénotype vasculaire : la taille des AVA et la quantité de NV. Dans le modèle OIR de souris, la vaso-oblitération se produit dans la rétine centrale (Figure 2A), tandis que dans le modèle de rat, il se développe dans la périphérie, c’est-à-dire, semblable à l’homme ROP²² (Figure 3A). C’est parce que le plexus vasculaire superficiel s’est déjà développé lorsque les souris sont...

Discussion

La sévérité du phénotype de la maladie dépend à la fois de la souche et même du fournisseur dans les modèles OIR souris et rat²³. Ceci suggère qu’il y ait une grande variabilité génotypique dans le développement pathologique. En général, les rongeurs pigmentés développent un phénotype plus grave que les rongeurs albinos. Par exemple, la vascularisation rétinienne de l’albinos BALB/c se revascularise rapidement après l’hyperoxie et ne développe pas de NV^d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 gauge, Small Hub RN Needle	Hamilton Company	7803-05, 10mm, 25°, PS4	For intravitreal injection
Adobe Photoshop	Adobe Inc.		For image analysis
Air pump air100	Eheim GmbH & Co. KG.	143207	For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 AP	Univentor Ltd.	2360309	For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda lime	VWR International Ltd	22666.362	For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/g	VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY	vnr 17 05 79	For inhalation anaesthesia
Brush			For preparation of flat mounts
Carbon dioxide gas			For sacrifice
Celeris D430 ERG system	Diagnosys LLC	121	For in vivo ERG
Cell culture dishes	Greiner Bio-One International GmbH	664 160	For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mL	VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY	vnr 08 78 96	For anaesthesia
Cover slips	Thermo Fisher Scientific	15165452	For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier	Coy Laboratory Products		Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensor	BioSphenix, Ltd.	E207, 1801901	For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT)	Bioptigen, Inc.	BPN000668	For in vivo imaging
Eye spears	Beaver-Visitec International, Inc.	0008685	For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light source	Mikron	11140	For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium salt	Merck KGaA	F6377-100G	For in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter)	UNO Roestvaststaal BV	GEX 17015249	For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RN	Hamilton Company	7633-01	For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA)	Heidelberg Engineering GmbH	Spec-KT-05488	For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	I21411	For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mL	Intervet International B.V.	vnr 51 14 85	For anaesthesia
Medicinal Oxygen gas			For disease model induction
Mice C57BL/6JRj	Janvier Labs		Also other strains possible
Microscope slides	Thermo Fisher Scientific	J1800AMNZ	For preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit)	Bausch & Lomb U.K Limited	vnr 24 11 304	For intravitreal injection
Nitrogen gas			For disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/g	Santen Pharmaceutical Co., Ltd.	vnr 55 01 11	For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml	Santen Pharmaceutical Co., Ltd.	vnr 55 03 43	For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/ml	Santen Pharmaceutical Co., Ltd.	vnr 55 03 50	For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/ml	Santen Pharmaceutical Co., Ltd.	vnr 04 12 36	For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber	BioSphenix, Ltd.	803	For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber	BioSphenix, Ltd.	538	For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD)	Charles River Laboratories		Also other strains possible
Revertor 5 mg/mL	VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY	vnr 13 04 97	For anaesthesia reversal
Silica gel			For humidity control during model induction
Systane Ultra 10ml	Alcon	Tamro 2050250	For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7ml	Alcon	Tamro 2064871	For hydration of the eye
Transfer pipette	Thermo Fisher Scientific	1343-9108	For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven	VWR	VL180S 170301	For drying silica gel
VisiScope SZT350 Stereomicroscope	VWR	481067	For intravitreal injection or tissue collection