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要約

本研究では、ハイスループットスクリーニング形式でジカウイルス複製の阻害剤をスクリーニングするための、レビコンベースおよびウイルス酵素ベースのアッセイで使用されるプロトコルについて説明する。

要約

抗ウイルス薬の発見は、高スループットスクリーニング(HTS)フォーマットで行うことができる信頼性の高い生化学的および細胞アッセイの開発を必要とします。非構造(NS)タンパク質は、小胞体(ER)膜上で共同翻訳的に組み立てられ、複製複合体(RC)を形成すると考えられている。NS3とNS5はRCの最も研究された酵素であり、ウイルスゲノム複製における重要な役割のために医薬品開発の主な標的となる。NS2Bを補因子とするNS3プロテアーゼドメインは、未熟なウイルス性ポリタンパク質を成熟したNSタンパク質に切断するのに対し、NS5 RdRpドメインはRNA複製を担当します。本明細書において、ジカウイルス(ZIKV)複製の阻害剤に対する大規模な化合物ライブラリーを試験するために、レコンベースのスクリーニングおよび酵素アッセイで使用されるプロトコルについて詳細に説明する。Repliconsは哺乳類細胞で発現する自己複製型サブゲノム系であり、ウイルス構造遺伝子はレポーター遺伝子に置き換えられる。ウイルスRNA複製に対する化合物の阻害効果は、レポータータンパク質活性の低下を測定することによって容易に評価することができる。レプレッサンベースのスクリーニングは、 レニラル シファーゼをレポーター遺伝子として発現するBHK-21 ZIKVリプレコン細胞株を用いて行った。同定された化合物の特異的標的を特徴付けるため、組換えに発現NS3プロテアーゼおよびNS5 RdRp用のイン ビトロ 蛍光ベースアッセイを確立しました。ウイルスプロテアーゼのタンパク質分解活性を、フッ素化ペプチド基質Bz-nKRR-AMCを用いて測定した、 NS5 RdRp伸長活性は、RNA伸長中のSYBRグリーンIの蛍光シグナルの増加によって直接検出された一方で、合成バイオチン化自己プライミングテンプレート3'UTR-U30(5'-ビオチン-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3')を使用した。

概要

ジカウイルス(ZIKV)は、フラビウイルス属の新興の節足動物媒介ウイルスメンバーであり、密接に関連するデング熱ウイルス(DENV)、日本脳炎ウイルス(JEV)および黄熱病ウイルス(YFV)を含み、公衆衛生に絶え間ない脅威をもたらす1。2015-16年のアメリカ大陸でのZIKVの流行は、新生児2、3およびギランバレー症候群の先天性ZIKV関連小頭症およびギランバレー症候群などの重度の神経障害との関連により、ブラジルでの出現に続いて世界的な注目を集めた。感染例の数は今後2年間で減少したが、2019年には87の国と地域でZIKVの蚊媒介感染が確認され、ウイルスが流行として再び出現する可能性を証明した。現在までに、ZIKV感染に対する承認されたワクチンや有効な薬物はありません。

抗ウイルス薬の発見は、高スループットスクリーニング(HTS)フォーマットで行うことができる信頼性の高い細胞および生化学的アッセイの開発を必要とします。レプコンベースのスクリーニングとウイルス酵素ベースのアッセイは、ZIKV1の阻害剤に対する低分子化合物を試験するための2つの貴重な戦略である。非構造(NS)タンパク質とは、小胞体(ER)膜上で共翻訳的に組み立てられ、複製複合体(RC)6を形成すると考えられている。NS3とNS5はRCの最も研究された酵素であり、ウイルスゲノム複製における重要な役割のために医薬品開発の主な標的となる。NS2Bを補因子とするNS3プロテアーゼドメインは、未熟なウイルス性ポリタンパク質を成熟したNSタンパク質に切断する一方、NS5 RdRpドメインはRNA複製6を担う。

Repliconsは哺乳類細胞で発現する自己複製型サブゲノム系であり、ウイルス構造遺伝子はレポーター遺伝子に置き換えられる。ウイルスRNA複製に対する化合物の阻害効果は、レポータータンパク質活性7の低下を測定することによって容易に評価することができる。本明細書において、96ウェルプレート形式でのZIKV複製のスクリーニング阻害剤に用いられるプロトコルについて説明する。レパコンベースのアッセイは、我々が最近開発したBHK-21 ZIKV Rluc レパコンセルラインを使用して行われました8.同定された化合物の特異的標的を特徴付けるために、我々は、フッ素化ペプチド基質を用いて組換え発現NS3プロテアーゼに対する インビトロ 蛍光ベースアッセイを確立し、 Bz-nKRR-AMCは、NS5 RdRpの場合、合成バイオチン化自己プライミングテンプレート3'UTR-U30(5'-ビオチン-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCUAAGU-3')の伸びを測定し、インターカレートダイSYBRグリーンI.

ジKVプロテアーゼ(グリシンリッチリンカー[G4SG4])によってNS3プロテアーゼドメインの残基1〜177に結合したNS2B補因子の45-96残基が得られたが、YFV9に記載されている通り、ポリメラーゼ(RdRpドメインの276-898残基)をクローニングし、10で詳述した。両方の酵素配列は、GenBank ALU33341.1に由来した。一次抗ウイルススクリーニングとして、化合物は10μMで試験され、80%≥活性を示す化合物は用量依存的に評価され、その結果、有効/阻害(EC50またはIC50)および細胞傷害(CC50)濃度が得られます。代表的な結果の文脈では、NITD008のEC50およびCC50値、既知のフラビウイルス阻害剤11、レコンベースのスクリーニングからが示されている。酵素アッセイの場合、抗菌、抗真菌および抗ウイルス活性を有する400分子からなるライブラリーであるMMV/DNDiパンデミック応答ボックスからの2つの化合物のIC50値が示されている。本研究で説明したプロトコルは、他の関連するフラビウイルスの阻害剤をスクリーニングするように変更することができる。

プロトコル

1. ルシファーゼ活性アッセイ

注: 細胞培養に関連するすべての手順が、認定バイオセーフティフードで行われていることを確認します( 資料表を参照)。

  1. 10%FBSと500 μg/mL G418を補ったダルベックコの修正イーグルのミディアム(DMEM)で成る成長培地を準備します。
  2. 100%DMSOで試験した化合物の10mMストック溶液を調製し、100%DMSOで1mMに希釈します。
  3. 培養ZIKV Rlucレプコン細胞は、70-90%合流に達するまで、CO2 -加湿インキュベーター(材料表を参照)で37°Cで75cm2培養フラスコで培養します。
  4. メディアを破棄します。5 mLのトリプシン-EDTAをフラスコに5〜10分間加え、125 x g で細胞を遠心分離して5分間加えます。
  5. 上清を捨て、5 mLのDMEM 10%FBSで細胞を再懸濁し、ヘミック計で再懸濁細胞の10μLを数える。
  6. 96ウェルの細胞培養プレートで、DMEM 10%FBSで2 x 104 細胞/ウェルに細胞を調整し、1ウェル当たり100μLの細胞をシードします( 材料表を参照)。
  7. CO2 -加湿インキュベーターで37°Cでプレートを16時間インキュベートします(材料表を参照)。
  8. 次に、マルチチャンネルマイクロピペットで媒体を廃棄し、DMEM 2%FBSの100 μL/wellをプレートに追加します。
  9. 1ウェルあたり1μLの化合物を添加して、アッセイ媒体中の10μM 1%DMSOの最終濃度を得ます。最初の列では、阻害制御なしとしてDMSOを1%、最後の列にNITD008を正のコントロールとして追加します(100%阻害)。
  10. CO2-加湿インキュベーターで37°Cで48時間プレートをインキュベートします(材料表を参照)。
  11. レ ニラ ルシファーゼアッセイシステムキットを室温で解凍し、1x レニラ ルシファーゼライシスバッファー作業溶液と レニラ ルシファーゼ試薬(アッセイバッファー+基板;ウェルあたり100 μL)の適切な量を調製します。
  12. マルチチャンネルマイクロピペットで細胞から上澄み液を捨て、ウェルあたり1x レニラ ルシファーゼライシスバッファーの25 μLを追加します。
  13. プレートを室温で15分間インキュベートし、マルチチャンネルマイクロピペットで20 μLの細胞ライセートを、レニラルシファーゼアッセイ試薬の100 μL/wellを含む白色不透明な96ウェルプレート(材料表を参照)に移します。
  14. ルミネッセンス信号を、ルミノメーターまたは発光を読み取るオプションを持つ機器で読み取ります( 材料表を参照)。
  15. 各プレートについて、Z ファクター値 12を次のように計算します。SD - 標準偏差。0.5 と 1.0 の間の Z ファクターは、良質のアッセイ 12を意味します。
  16. 化合物のEC50 値を決定するには、ステップ1.3〜1.8の手順に従って進み、負(1%DMSO)および正(NITD008(10μMのNITD008)コントロールと共に、連続して希釈した化合物を細胞に加えます。重複してアッセイを2回実行する。
  17. 化合物濃度あたりの阻害率の平均値をプロットし、グラフ分析ソフトウェアを使用してシグモイドフィッティングを実行し、EC50 値を取得します。

2. 細胞増殖ベースMTTアッセイ

  1. 項目 1 ステップ 1.1 ~ 1.8 の説明に従って進めます。
  2. 最初は10μMで化合物を加え、コントロール1%DMSOを細胞に加えます。
  3. リン酸緩衝生理食塩水(PBS - 137 mM NaCl)に5 mg/mL MTT(3-(4-ジメチルチアゾール-2-イイル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化)溶液を調製 2,7 mM KCl、10 mM Na2HPO 4、1,8 mM KH2PO4;pH7.4)およびMTTの完全な可溶化まで渦。
  4. MTT溶液をウェルボリュームの10分の1(10μL/ウェル)の細胞に加えます。
  5. 3-4時間CO2-加湿インキュベーター( 材料表を参照)で37°Cでプレートをインキュベートします。
  6. マルチチャンネルマイクロピペットで上澄み液を捨て、各ウェルに100 μLのDMSO(100%)を加えます。
  7. アップとダウンでformazan結晶を可溶化し、分光光度計で570 nmの吸光度を読み取ります( 材料表を参照)。
  8. 化合物のCC50 値を決定するには、項目1ステップ1.1〜1.8に記載された手順に進み、次いで、負(1%DMSO)制御を一緒に細胞に連続希釈した化合物を添加する。重複してアッセイを2回実行する。
  9. 化合物濃度あたりの阻害率の平均値をプロットし、グラフ分析ソフトウェアを使用してシグモイドフィッティングを実行し、CC50 値を取得します。

3. NS2B-NS3プロテアーゼ活性アッセイ

  1. 氷の上にタンパク質アリコートを解凍します。
  2. プレートリーダー( 材料表参照)温度を37°Cに設定します。
  3. 80 nM(5 μL/ウェル)に希釈したタンパク質の適切な量を準備します。最終的なタンパク質濃度は4nMである。
  4. 氷上のBz-nKRR-AMC基板の適切な量を解凍します(アッセイバッファーで希釈された300 μMストック溶液、10 μL/well)。
  5. 96ウェルの白い板( 材料のテーブルを参照)で、各井戸に84 μLのアッセイバッファー(20 mM Tris pH 8.5、5%グリセロール、0.01%トリトンX-100)を分配します。
  6. 正の制御反応を行うために、最後のカラムの各ウェルに1μLのアプロチニンを分配して、1μMの最終濃度を達成する(ストック溶液100μM水で希釈)
  7. 陰性制御反応を行うために、第1カラムにDMSOの1μL(最終濃度1%)を分配する。
  8. 化合物スクリーニングを行うために、各化合物の1μLを分配し、正および負の制御ウェルを除いた10μM(1mMストック濃度)の最終濃度を達成します。
  9. プロテアーゼ溶液の5 μLを分配する。
  10. プレートを4°Cで30分間インキュベートします。
  11. 反応を開始するには、Bz-nKRR-AMCストック溶液(最終濃度30μM)を10μL塗布します。
  12. 励起波長を380 nmに、発光を460 nmに設定し、マイクロプレートリーダーで1分ごとに30分間蛍光を読み込みます( 材料表を参照)。37°Cで実験全体を行います。
  13. 正と負のコントロール反応に対する蛍光の平均値を計算します。プロテアーゼ活性の100%を正制御の平均値から差し引いた負制御反応に対する蛍光の平均値を設定し、各化合物の活性の割合を算出する。
  14. 各プレートについて、ステップ 1.15 で説明したように、Z 係数の値を計算します。
  15. 80%を超える阻害率を示した化合物に対するIC50 判定を進める。
  16. ステップ3.1-3.13に記載されているようにトリクリケートでアッセイを実行し、化合物の連続希釈を使用する。
  17. 化合物濃度あたりの阻害率の平均値をプロットし、グラフ分析ソフトウェアを使用してシグモイドフィッティングを実行し、IC50 値を取得します。

4. NS5 RdRp伸長アッセイ

注:このアッセイで使用されるすべての材料は、RNase、DNaseおよびパイロジェナーゼ無料認定です。

  1. アッセイバッファー(50 mM Tris pH 7.0、2.5 mMMnCl 2、0.01%トリトンX-100)と200 mM ATPストック溶液を0.1%ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水で調製します。
  2. 200 μM 3'UTR-U 30(5'-biotin-U 30-ACUGGAGAUCGAUCCAGU-3')の5 μLアリコートを、サーモサイクルで55°Cで5分間インキュベートして、PCR処理水に含めます。
  3. NS5 RdRp、200 mM ATP、x10.000 SYBRグリーンIのストックソリューションを氷上で解凍します。
  4. タンパク質を3mLのアッセイバッファーで250 nMの最終濃度に希釈します。
  5. ATP、3'UTR-U30 およびSYBRグリーンIのストック溶液を3mLのアッセイバッファーでそれぞれ1mM、300 nMおよび1Xの最終濃度に希釈することによって、基質溶液を調製する。
  6. 96ウェル PCR プレート( 材料表を参照)では、各列の 1 ~ 11 列に希釈タンパク質 24.5 μL を追加します。残りのウェルに同じ量のアッセイバッファーを追加します。
  7. 制御およびブランク反応の場合は、列 1 および 12 に DMSO を 0.5 μL 追加します。DMSOで希釈した化合物を0.5 μL加えて、最終濃度の10 μM 1mMのストック溶液に加えます)。
  8. プレートをシールフィルムで密封し、室温で15分間インキュベートします。
  9. 25 μLの基質溶液を加えて反応を開始し、プレートを再び密封します。
  10. リアルタイムPCRシステムで30°Cでインキュベートし( 材料表を参照)、蛍光を1時間監視し、FAMフィルター(エミッション:494 nm/励起:521 nm)で蛍光を30sごとに測定します。
  11. 各プレートについて、ステップ 1.15 で説明したように、Z 係数の値を計算します。
  12. 工程3.15で説明したように、80%を超える阻害率を示した化合物に対するIC50 の判定を進める。
  13. 化合物濃度あたりの阻害率の平均値をプロットし、グラフ分析ソフトウェアを使用してシグモイドフィッティングを実行し、IC50 値を取得します。

結果

本明細書に記載されているすべてのプロトコルは96ウェルプレートで刺され、プレートの最初と最後の列に配置された陰性および陽性対照を含む単一濃度の一次スクリーニングでプレート当たり80化合物の評価を可能にする。このレプレッサンベースのスクリーニングは、BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo細胞株を得るために開発されたRNA構築物(図1A)、アッセイ回路

ディスカッション

本明細書に記載されているプロトコルは、384または1536-well形式でのスクリーニングに容易に適応することができる。HTS形式で行われる生化学的および/または細胞ベースのスクリーニングの場合、Z'因子値は、統計的パラメータであり、それらのアッセイ12の感度、再現性および正確性を確保するために各プレートについて計算される。レコンベースのスクリーニングでは0.5?...

開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この作品は、フンダサン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(FAPESP)、CEPID助成金2013/07600-3によって支援されました。 RSFに2018/05130-3、ASGに2016/19712-9を付与し、COGに対しては、クオルデナソン・デ・アペルフェイソアメント・デ・ペソアル・デ・ニヴェル・スーペリア(助成金88887.516153/2020-00)を付与します。マラリアベンチャーズの医薬品(MMV、www.mmv.org)と放置病治療薬イニシアチブ(DNDi、www.dndi.org)のサポート、パンデミックレスポンスボックスの設計、化合物の供給に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3'Dharmacon-100 ng
96-well cell culture platesKASVIK12-096
96-well PCR MicroplateKASVIK4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind MicroplateCorning3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarine)SIGMA-Aldrich257370100 mg
Aprotinin from bovine lungSIGMA-AldrichA115310 mg
ATPJenaBioscienceNU-1010-1G1 g
Bz-nKRR-AMCInternational Peptides-5 mg
Class II Biohazard Safety CabinetESCO
Diethyl pyrocarbonateSIGMA-AldrichD575825 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide)SIGMA-Aldrich4723011 L
Dulbecco’s Modified Eagle MediumGIBCO3760091
Fetal Bovine SerumGIBCO12657-029500 mL
G418SIGMA-AldrichA1720Disulfate salt
GlycerolSIGMA-AldrichG55161 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubatorThermo Scientific
MnCl2 tetrahydrateSIGMA-Aldrich20373425 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)InvitrogenM6494
NITD008 ≥98% (HPLC)Sigma-AldrichSML24095 mg
qPCR system Mx3000PAgilent
Renilla luciferase Assay SystemPROMEGAE2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence ReaderMolecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection PlatformMolecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate ReaderMolecular Devices
SYBR Green IInvitrogenS7563500 µl
Triton X-100SIGMA-AldrichX100500 mL
Trizma baseSIGMA-AldrichT15031 kg
Trypsin-EDTA Solution 1XSIGMA-Aldrich59417-C100 mL

参考文献

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