Antivirale Hochdurchsatz-Assays zum Screening auf Inhibitoren der Zika-Virusreplikation

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir die Protokolle, die in replikonbasierten und viralen enzymbasierten Assays verwendet werden, um in einem Hochdurchsatz-Screening-Format nach Inhibitoren der Zika-Virusreplikation zu suchen.

Zusammenfassung

Die Entdeckung antiviraler Medikamente erfordert die Entwicklung zuverlässiger biochemischer und zellulärer Assays, die in Hochdurchsatz-Screening-Formaten (HTS) durchgeführt werden können. Es wird angenommen, dass sich die nichtstrukturellen Flavivirusproteine (NS) kotranslational auf den endoplasmatischen Retikulummembranen (ER) zusammensetzen und den Replikationskomplex (RC) bilden. Die NS3 und NS5 sind die am besten untersuchten Enzyme der RC und stellen aufgrund ihrer entscheidenden Rolle bei der Replikation des viralen Genoms die Hauptziele für die Arzneimittelentwicklung dar. Die NS3-Proteasedomäne, die NS2B als Cofaktor benötigt, ist für die Spaltung des unreifen viralen Polyproteins in die reifen NS-Proteine verantwortlich, während die NS5 RdRp-Domäne für die RNA-Replikation verantwortlich ist. Hierin beschreiben wir detailliert die Protokolle, die in replicon-basierten Screenings und enzymatischen Assays verwendet werden, um große Verbindungsbibliotheken auf Inhibitoren der Zika-Virus-Replikation (ZIKV) zu testen. Replicons sind selbstreplizierende subgenomische Systeme, die in Säugetierzellen exprimiert werden, in denen die viralen Strukturgene durch ein Reportergen ersetzt werden. Die hemmenden Wirkungen von Verbindungen auf die virale RNA-Replikation können leicht bewertet werden, indem die Verringerung der Reporterproteinaktivität gemessen wird. Die replicon-basierten Screenings wurden mit einer BHK-21 ZIKV Replicon Zelllinie durchgeführt, die Renilla Luciferase als Reportergen exprimierte. Um die spezifischen Ziele der identifizierten Verbindungen zu charakterisieren, haben wir in-vitro-fluoreszenzbasierte Assays für rekombinant exprimierte NS3-Protease und NS5 RdRp etabliert. Die proteolytische Aktivität der viralen Protease wurde unter Verwendung des fluorogenen Peptidsubstrats Bz-nKRR-AMC gemessen, während die NS5 RdRp-Dehnungsaktivität direkt durch die Erhöhung des fluoreszierenden Signals von SYBR Green I während der RNA-Elongation unter Verwendung der synthetischen biotinylierten selbstansaugenden Vorlage 3′UTR-U30 (5'-Biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') nachgewiesen wurde.

Einleitung

Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein neu auftretendes arthropodenübertragenes Virus, das zur Gattung Flavivirusgehört, zu der das eng verwandte Dengue-Virus (DENV), das Japanische Enzephalitis-Virus (JEV) und das Gelbfiebervirus (YFV) gehören, die eine ständige Bedrohung für die öffentliche Gesundheit darstellen¹. Der ZIKV-Ausbruch 2015-16 in Amerika erhielt weltweite Aufmerksamkeit nach seinem Auftreten in Brasilien aufgrund der Assoziation mit schweren neurologischen Störungen, wie angeborener ZIKV-assoziierter Mikrozephalie bei Neugeborenen^2,3 und Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen⁴. Obwohl die Zahl der Infektionsfälle in den nächsten zwei Jahren zurückging, wurden autochthone durch Mücken übertragene Übertragungen von ZIKV im Jahr 2019 in 87 Ländern und Gebieten nachgewiesen, was das Potenzial des Virus belegt, als Epidemie wieder aufzutauchen⁵. Bis heute gibt es keine zugelassenen Impfstoffe oder wirksamen Medikamente gegen ZIKV-Infektionen.

Die Entdeckung antiviraler Medikamente erfordert die Entwicklung zuverlässiger zellulärer und biochemischer Assays, die in Hochdurchsatz-Screening-Formaten (HTS) durchgeführt werden können. Replicon-basierte Screenings und virale enzymbasierte Assays sind zwei wertvolle Strategien, um niedermolekulare Verbindungen auf Inhibitoren von ZIKV¹zu testen. Es wird angenommen, dass sich die nichtstrukturellen Flavivirusproteine (NS) kotranslational auf den endoplasmatischen Retikulummembranen (ER) zusammensetzen und den Replikationskomplex (RC)^{bilden 6}. Die NS3 und NS5 sind die am besten untersuchten Enzyme der RC und stellen aufgrund ihrer entscheidenden Rolle bei der Replikation des viralen Genoms die Hauptziele für die Arzneimittelentwicklung dar. Die NS3-Proteasedomäne, die NS2B als Cofaktor benötigt, ist für die Spaltung des unreifen viralen Polyproteins in die reifen NS-Proteine verantwortlich, während die NS5 RdRp-Domäne für die RNA-Replikation verantwortlich ist⁶.

Replicons sind selbstreplizierende subgenomische Systeme, die in Säugetierzellen exprimiert werden, in denen die viralen Strukturgene durch ein Reportergen ersetzt werden. Die hemmenden Wirkungen von Verbindungen auf die virale RNA-Replikation können leicht bewertet werden, indem die Verringerung der Reporterproteinaktivität gemessen wird⁷. Hierin beschreiben wir die Protokolle, die für screening-Inhibitoren der ZIKV-Replikation in einem 96-Well-Plattenformat verwendet werden. Die Replicon-basierten Assays wurden mit einer BHK-21 ZIKV Rluc Replicon Zelllinie durchgeführt, die wir kürzlich entwickelt haben⁸. Um die spezifischen Targets der identifizierten Verbindungen zu charakterisieren, haben wir in vitro fluoreszenzbasierte Assays für rekombinant exprimierte NS3-Protease unter Verwendung des fluorogenen Peptidsubstrats Bz-nKRR-AMC etabliert, während wir für NS5 RdRp die Dehnung der synthetischen biotinylierten selbstansaugenden Schablone 3′UTR-U30 (5'-Biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') mit dem interkalierenden Farbstoff SYBR Green I gemessen haben.

Die ZIKV-Protease (45-96 Rückstände des NS2B-Cofaktors, die mit den Rückständen 1-177 der NS3-Proteasedomäne durch einen glycinreichen Linker_[G4SG_4])verbunden sind, wurde wie für YFV⁹beschrieben erhalten, während die Polymerase (276-898 Rückstände der RdRp-Domäne) geklont und exprimiert wurde, wie in¹⁰beschrieben. Beide Enzymsequenzen wurden von GenBank ALU33341.1 abgeleitet. Als primäre antivirale Screenings werden Verbindungen bei 10 μM getestet und diejenigen, die Aktivitäten ≥ 80% zeigen, werden dann dosisabhängig bewertet, was zu den Effektiv-/Hemmungs- (EC₅₀ oder IC₅₀₎und den zytotoxischen (CC₅₀₎Konzentrationen führt. Im Rahmen repräsentativer Ergebnisse werden die EC_50- und CC_50-Werte von NITD008, einem bekannten Flavivirusinhibitor^11,aus replicon-basierten Screenings gezeigt. Für die enzymatischen Assays werden die IC_50-Werte von zwei Verbindungen aus der MMV/DNDi Pandemic Response Box, einer Bibliothek aus 400 Molekülen mit antibakteriellen, antimykotischen und antiviralen Aktivitäten, gezeigt. Die in dieser Arbeit beschriebenen Protokolle könnten modifiziert werden, um nach Inhibitoren anderer verwandter Flaviviren zu suchen.

Protokoll

1. Luciferase-Aktivitätstest

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Verfahren mit Zellkultur in zertifizierten Biosicherheitshauben durchgeführt werden (siehe Materialtabelle).

1. Bereiten Sie Wachstumsmedien vor, die aus Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) bestehen, ergänzt mit 10% FBS und 500 μg/ml G418.
2. Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung aus getesteten Verbindungen in 100% DMSO vor und verdünnen Sie sie dann auf 1 mM in 100% DMSO.
3. Kultur ZIKV Rluc Replikonzellen in Wachstumsmedien in einem 75 cm² Kulturkolben bei 37 °C in einem CO₂-befeuchteten Inkubator (siehe Materialtabelle),bis sie eine 70-90%ige Konfluenz erreichen.
4. Verwerfen Sie das Medium. 5 ml Trypsin-EDTA für 5 bis 10 min in den Kolben geben und dann die Zellen bei 125 x g für 5 min zentrifugieren.
5. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 5 mL DMEM 10% FBS und zählen Sie 10 μL resuspendierte Zellen an einem Hämozytometer.
6. Stellen Sie die Zellen auf 2 x 10⁴ Zellen/Vertiefung in DMEM 10% FBS ein und säen Sie 100 μL Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Zellkulturplatte (siehe Materialtabelle).
7. Inkubieren Sie die Platte für 16 h bei 37 °C in einem CO₂-befeuchteten Inkubator (siehe Materialtabelle).
8. Als nächstes entsorgen Sie das Medium mit einer Mehrkanal-Mikropipette und fügen Sie der Platte 100 μL / Well DMEM 2% FBS hinzu.
9. Fügen Sie 1 μL der Verbindungen pro Vertiefung hinzu, um eine Endkonzentration von 10 μM 1% DMSO im Assay-Medium zu erhalten. Fügen Sie in der ersten Spalte nur 1% DMSO als Keine Inhibitionskontrolle und NITD008 in der letzten Spalte als Positivkontrolle (100% Inhibition) hinzu.
10. Inkubieren Sie die Platte für 48 h bei 37 °C in einem CO₂-befeuchteten Inkubator (siehe Materialtabelle).
11. Tauen Sie das Renilla Luciferase Assay System Kit bei Raumtemperatur auf, bereiten Sie eine 1x Renilla Luciferase Lysis Buffer Arbeitslösung und ein geeignetes Volumen Reagenz Renilla Luciferase (Assay Puffer + Substrat; 100 μL pro Vertiefung) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
12. Verwerfen Sie den Überstand aus den Zellen mit einer Mehrkanal-Mikropipette und fügen Sie 25 μL 1x Renilla luciferase Lysis Buffer pro Vertiefung hinzu.
13. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 15 min und übertragen Sie dann 20 μL Zelllysate mit einer Mehrkanal-Mikropipette auf eine weiße, undurchsichtige 96-Well-Platte (siehe Materialtabelle),die 100 μL/Well Renilla luciferase Assay Reagenz enthält.
14. Lesen Sie die Lumineszenzsignale in einem Luminometer oder in jedem Gerät, das die Möglichkeit hat, Lumineszenz zu lesen (siehe Materialtabelle).
15. Berechnen Sie für jede Platte den Z-Faktorwert ¹²wie folgt: Z′ = 1 - ((3SD der Probe + 3SD der Kontrolle)/│Mittelwert der Probe - Mittelwert der Kontrolle│); SD - Standardabweichung. Ein Z-Faktor zwischen 0,5 und 1,0 bedeutet einen assay von guter Qualität ¹².
16. Um die EC_50-Werte von Verbindungen zu bestimmen, gehen Sie wie in den Schritten 1.3 bis 1.8 beschrieben vor und fügen Sie dann die serienmäßig verdünnten Verbindungen zusammen mit den negativen (1% DMSO) und positiven (NITD008 bei 10 μM) Kontrollen zu den Zellen hinzu. Führen Sie den Assay zweimal in Duplikaten durch.
17. Zeichnen Sie die Durchschnittswerte der Inhibitionsraten pro Verbindungskonzentration auf und verwenden Sie eine Graphanalysesoftware, um eine sigmoidale Anpassung durchzuführen und die EC_50-Werte zu erhalten.

2. Zellproliferationsbasierter MTT-Assay

1. Gehen Sie wie in Punkt 1 Schritte 1.1 bis 1.8 beschrieben vor.
2. Fügen Sie die Verbindungen zunächst bei 10 μM und die Kontrolle 1% DMSO zu den Zellen hinzu.
3. Eine 5 mg/ml MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM_Na2HPO4,1,8 mM_KH2PO4;pH 7,4) und Wirbel bis zur vollständigen Lösung von MTT wird hergestellt.
4. Fügen Sie die MTT-Lösung den Zellen bei einem Zehntel des Bohrvolumens (10 μL/Well) hinzu.
5. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem CO₂-befeuchteten Inkubator (siehe Materialtabelle)für 3-4 h.
6. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Mehrkanal-Mikropipette und fügen Sie jeder Vertiefung 100 μL DMSO (100%) hinzu.
7. Solubilisieren Sie die Formazankristalle durch Pipettieren auf und ab und lesen Sie dann die Absorption bei 570 nm in einem Spektralphotometer ab (siehe Materialtabelle).
8. Um die CC_50-Werte von Verbindungen zu bestimmen, gehen Sie wie in Punkt 1 Schritte 1.1 bis 1.8 beschrieben vor und fügen Sie dann die verbindungen seriell verdünnten Verbindungen zu den Zellen hinzu, zusammen mit der negativen (1% DMSO) Kontrolle. Führen Sie den Assay zweimal in Duplikaten durch.
9. Zeichnen Sie die Durchschnittswerte der Inhibitionsraten pro Verbindungskonzentration auf und verwenden Sie eine Graphanalysesoftware, um eine sigmoidale Anpassung durchzuführen und die CC_50-Werte zu erhalten.

3. NS2B-NS3 Protease-Aktivitätstest

1. Tauen Sie ein Protein-Aliquot auf Eis auf.
2. Stellen Sie den Plattenleser (siehe Materialtabelle)auf 37°C ein.
3. Bereiten Sie die entsprechende Menge proteinverdünnt auf 80 nM (5 μL/Well) vor. Die endgültige Proteinkonzentration beträgt 4 nM.
4. Die entsprechende Menge Bz-nKRR-AMC-Substrat auf Eis auftauen (300 μM Stammlösung verdünnt in Assay-Puffer, 10 μL/Well).
5. In einer weißen Platte mit 96 Wellen (siehe Materialtabelle)werden 84 μL Assay-Puffer (20 mM Tris pH 8,5, 5% Glycerin und 0,01% Triton X-100) in jede Vertiefung abgegeben.
6. Um die positive Kontrollreaktion zu machen, werden in jede Vertiefung der letzten Säule 1 μL Aprotinin abgegeben, um eine Endkonzentration von 1 μM zu erreichen (Stammlösung 100 μM in Wasser verdünnt)
7. Um die negative Kontrollreaktion zu machen, geben Sie an die erste Säule 1 μL DMSO (Endkonzentration 1%).
8. Um das Compound-Screening durchzuführen, dosieren Sie 1 μL jeder Verbindung, um eine Endkonzentration von 10 μM (1 mM Stammkonzentration) zu erreichen, ohne Positiv- und Negativkontrollbohrungen.
9. Dosieren Sie 5 μL der Proteaselösung.
10. Die Platte 30 Minuten lang bei 4 °C inkubieren.
11. Um die Reaktion zu starten, dosieren Sie 10 μL Bz-nKRR-AMC-Stammlösung (Endkonzentration von 30 μM).
12. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 380 nm und die Emission auf 460 nm ein und lesen Sie die Fluoreszenz alle 1 minute in einem Mikroplattenleser für 30 min ab (siehe Materialtabelle). Führen Sie das gesamte Experiment bei 37 °C durch.
13. Berechnen Sie die Mittelwerte der Fluoreszenz für positive und negative Kontrollreaktionen. Setzen Sie den Mittelwert der Fluoreszenz für negative Kontrollreaktionen auf 100% der Proteaseaktivität ab, abzüglich des Mittelwerts der Positivkontrolle, und berechnen Sie die Aktivitätsprozentsätze für jede Verbindung.
14. Berechnen Sie für jede Platte den Z-Faktor-Wert, wie in Schritt 1.15 beschrieben.
15. Fahren Sie mit der IC_{50-Bestimmung} für Verbindungen fort, die eine Hemmrate von mehr als 80% aufwiesen.
16. Führen Sie den Assay in Triplikaten wie in den Schritten 3.1-3.13 beschrieben unter Verwendung einer seriellen Verdünnung der Verbindung durch.
17. Zeichnen Sie die Durchschnittswerte der Inhibitionsraten pro Verbindungskonzentration auf und verwenden Sie eine Graphanalysesoftware, um eine sigmoidale Anpassung durchzuführen und die IC_50-Werte zu erhalten.

4. NS5 RdRp Elongationstest

HINWEIS: Alle materialien, die in diesem Assay verwendet werden, sind RNase-, DNase- und Pyrogenase-frei zertifiziert.

1. Bereiten Sie sowohl den Assay-Puffer (50 mM Tris pH 7,0, 2,5 mM MnCl_2,0,01% Triton X-100) als auch die 200 mM ATP-Stammlösung mit 0,1% Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser vor.
2. Ein 5 μL Aliquot von 200 μM 3′UTR-U₃₀ (5'-Biotin-U 30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') in PCR-behandeltem Wasser anglühen, indem Sie es 5 Minuten bei 55 °C in einem Thermocycler inkubieren.
3. Tauen Sie die Standardlösung von NS5 RdRp, 200 mM ATP und x10.000 SYBR Green I auf Eis auf.
4. Verdünnen Sie das Protein auf eine Endkonzentration von 250 nM in 3 ml Assay-Puffer.
5. Bereiten Sie die Substratlösung vor, indem Sie die Stammlösungen von ATP, 3'UTR-U₃₀ und SYBR Green I in 3 ml Assaypuffer auf eine Endkonzentration von 1 mM, 300 nM bzw. 1X verdünnen.
6. In einer 96-Well-PCR-Platte (siehe Materialtabelle)werden 24,5 μL verdünntes Protein in den Spalten 1 bis 11 jeder Zeile hinzugefügt. Fügen Sie das gleiche Volumen an Assay-Puffer in die verbleibenden Bohrungen hinzu.
7. Für die Kontrolle und Die Blindreaktion fügen Sie 0,5 μL DMSO in den Spalten 1 und 12 hinzu. 0,5 μL in DMSO verdünnte Verbindung zu einer Endkonzentration von 10 μM 1mM Stammlösung hinzufügen).
8. Verschließen Sie die Platte mit einer Dichtfolie und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 15 Minuten.
9. Starten Sie die Reaktion, indem Sie 25 μL Substratlösung hinzufügen und die Platte erneut versiegeln.
10. Inkubieren Sie bei 30 °C in einem Echtzeit-PCR-System (siehe Materialtabelle)und überwachen Sie die Fluoreszenz für 1 Stunde, wobei die Fluoreszenz alle 30 s mit dem FAM-Filter gemessen wird (Emission: 494 nm / Anregung: 521 nm).
11. Berechnen Sie für jede Platte den Z-Faktor-Wert, wie in Schritt 1.15 beschrieben.
12. Fahren Sie mit der IC_{50-Bestimmung} für Verbindungen fort, die eine Hemmrate von mehr als 80% aufwiesen, wie in Schritt 3.15 beschrieben.
13. Zeichnen Sie die Durchschnittswerte der Inhibitionsraten pro Verbindungskonzentration auf und verwenden Sie eine Graphanalysesoftware, um eine sigmoidale Anpassung durchzuführen und die IC_50-Werte zu erhalten.

Ergebnisse

Alle hierin beschriebenen Protokolle wurden in 96-Well-Platten festgelegt und ermöglichen die Bewertung von 80 Verbindungen pro Platte in einem primären Screening einer einzigen Konzentration, einschließlich der Negativ- und Positivkontrollen an der ersten bzw. letzten Spalte der Platte. Die replicon-basierten Screenings sind in Abbildung 1dargestellt, die das RNA-Konstrukt enthält, das zur Gewinnung der BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo-Zelllinie entwickelt wurde (Abbildung 1...

Diskussion

Die hier beschriebenen Protokolle könnten leicht für Screenings in einem 384- oder 1536-Well-Format angepasst werden. Für biochemische und/oder zellbasierte Screenings, die im HTS-Format durchgeführt werden, wird der Z'-Faktorwert, ein statistischer Parameter, für jede Platte berechnet, um die Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Genauigkeit dieser Assays sicherzustellen¹². Für replicon-basierte Screenings wird ein Z'-Faktorwert von 0,5 oder mehr erwartet, während für die NS3- und NS5-A...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3'	Dharmacon	-	100 ng
96-well cell culture plates	KASVI	K12-096
96-well PCR Microplate	KASVI	K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate	Corning	3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarine)	SIGMA-Aldrich	257370	100 mg
Aprotinin from bovine lung	SIGMA-Aldrich	A1153	10 mg
ATP	JenaBioscience	NU-1010-1G	1 g
Bz-nKRR-AMC	International Peptides	-	5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet	ESCO
Diethyl pyrocarbonate	SIGMA-Aldrich	D5758	25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	SIGMA-Aldrich	472301	1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	GIBCO	3760091
Fetal Bovine Serum	GIBCO	12657-029	500 mL
G418	SIGMA-Aldrich	A1720	Disulfate salt
Glycerol	SIGMA-Aldrich	G5516	1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate	SIGMA-Aldrich	203734	25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)	Invitrogen	M6494
NITD008 ≥98% (HPLC)	Sigma-Aldrich	SML2409	5 mg
qPCR system Mx3000P	Agilent
Renilla luciferase Assay System	PROMEGA	E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader	Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform	Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader	Molecular Devices
SYBR Green I	Invitrogen	S7563	500 µl
Triton X-100	SIGMA-Aldrich	X100	500 mL
Trizma base	SIGMA-Aldrich	T1503	1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X	SIGMA-Aldrich	59417-C	100 mL