Tests antiviraux à haut débit pour dépister les inhibiteurs de la réplication du virus Zika

Résumé

Dans ce travail, nous décrivons les protocoles utilisés dans les tests à base de réplicon et à base d’enzymes virales pour dépister les inhibiteurs de la réplication du virus Zika dans un format de dépistage à haut débit.

Résumé

La découverte de médicaments antiviraux nécessite le développement de tests biochimiques et cellulaires fiables qui peuvent être effectués dans des formats de criblage à haut débit (HTS). On pense que les protéines non structurelles (NS) du flavivirus s’assemblent de manière co-translationnelle sur les membranes du réticulum endoplasmique (ER), formant le complexe de réplication (RC). Les NS3 et NS5 sont les enzymes les plus étudiées de la RC et constituent les principales cibles du développement de médicaments en raison de leur rôle crucial dans la réplication du génome viral. Le domaine de la protéase NS3, qui nécessite NS2B comme cofacteur, est responsable du clivage de la polyprotéine virale immature dans les protéines NS matures, tandis que le domaine NS5 RdRp est responsable de la réplication de l’ARN. Ici, nous décrivons en détail les protocoles utilisés dans les dépistages basés sur la réplication et les tests enzymatiques pour tester de grandes bibliothèques de composés pour les inhibiteurs de la réplication du virus Zika (ZIKV). Les replicons sont des systèmes sous-économiques auto-réplicants exprimés dans les cellules de mammifères, dans lesquels les gènes structurels viraux sont remplacés par un gène rapporteur. Les effets inhibiteurs des composés sur la réplication de l’ARN viral peuvent être facilement évalués en mesurant la réduction de l’activité de la protéine rapporteure. Les dépistages basés sur la réplicon ont été effectués à l’aide d’une lignée cellulaire de réplicon BHK-21 ZIKV exprimant la renilla luciférase en tant que gène rapporteur. Pour caractériser les cibles spécifiques des composés identifiés, nous avons établi des essais in vitro basés sur la fluorescence pour la protéase NS3 exprimée par recombinaison et le RdRp NS5. L’activité protéolytique de la protéase virale a été mesurée en utilisant le substrat peptidique fluorogénique Bz-nKRR-AMC, tandis que l’activité d’allongement NS5 RdRp a été directement détectée par l’augmentation du signal fluorescent de SYBR Green I pendant l’allongement de l’ARN, en utilisant le modèle d’auto-amorçage biotinylé synthétique 3′UTR-U30 (5'-biotine-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3').

Introduction

Le virus Zika (ZIKV) est un nouveau virus transmis par les arthropodes du genre Flavivirus,qui comprend le virus de la dengue (DENV), le virus de l’encéphalite japonaise (JEV) et le virus de la fièvre jaune (YFV), qui constituent des menaces constantes pour la santé publique¹. L’épidémie de ZIKV de 2015-2016 dans les Amériques a attiré l’attention du monde entier après son émergence au Brésil en raison de l’association avec des troubles neurologiques graves, tels que la microcéphalie congénitale associée au ZIKV chez les nouveau-nés^2,3 et le syndrome de Guillain-Barré chez les adultes⁴. Bien que le nombre de cas d’infection ait diminué au cours des deux années suivantes, les transmissions autochtones de ZIKV transmises par les moustiques ont été vérifiées dans 87 pays et territoires en 2019, ce qui témoigne du potentiel du virus à réapparaître en tant qu’épidémie⁵. À ce jour, il n’existe aucun vaccin approuvé ou médicament efficace contre l’infection par le ZIKV.

La découverte de médicaments antiviraux nécessite le développement de tests cellulaires et biochimiques fiables qui peuvent être effectués dans des formats de criblage à haut débit (HTS). Les dépistages à base de réplicon et les tests à base d’enzymes virales sont deux stratégies précieuses pour tester les composés à petites molécules pour les inhibiteurs du ZIKV^1. On pense que les protéines non structurelles (NS) du flavivirus s’assemblent de manière co-translationnelle sur les membranes du réticulum endoplasmique (ER), formant le complexe de réplication (RC)⁶. Les NS3 et NS5 sont les enzymes les plus étudiées de la RC et constituent les principales cibles du développement de médicaments en raison de leur rôle crucial dans la réplication du génome viral. Le domaine de la protéase NS3, qui nécessite NS2B comme cofacteur, est responsable du clivage de la polyprotéine virale immature dans les protéines NS matures, tandis que le domaine NS5 RdRp est responsable de la réplication de l’ARN^6.

Les replicons sont des systèmes sous-économiques auto-réplicants exprimés dans les cellules de mammifères, dans lesquels les gènes structurels viraux sont remplacés par un gène rapporteur. Les effets inhibiteurs des composés sur la réplication de l’ARN viral peuvent être facilement évalués en mesurant la réduction de l’activité de la protéine^{rapporteure 7}. Nous décrivons ici les protocoles utilisés pour le dépistage des inhibiteurs de la réplication du ZIKV dans un format de plaque à 96 puits. Les tests à base de réplicon ont été effectués à l’aide d’une lignée cellulaire BHK-21 ZIKV Rluc replicon que nous avons récemment développée⁸. Pour caractériser les cibles spécifiques des composés identifiés, nous avons établi des tests in vitro basés sur la fluorescence pour la protéase NS3 exprimée par recombinaison en utilisant le substrat peptidique fluorogénique, Bz-nKRR-AMC, tandis que pour NS5 RdRp, nous avons mesuré l’allongement du modèle d’auto-amorçage biotinylé synthétique 3′UTR-U30 (5'-biotine-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3'), en utilisant le colorant intercalant SYBR Green I.

La protéase ZIKV (45-96 résidus de cofacteur NS2B liés aux résidus 1-177 du domaine protéase NS3 par un liant riche en glycine [G₄SG₄]) a été obtenue, comme décrit pour YFV^9,tandis que la polymérase (276-898 résidus du domaine RdRp) a été clonée et exprimée, comme détaillé dans¹⁰. Les deux séquences enzymatiques ont été dérivées de GenBank ALU33341.1. En tant que dépistages antiviraux primaires, les composés sont testés à 10 μM et ceux dont les activités sont ≥ 80% sont ensuite évalués de manière dose-dépendante, ce qui entraîne les concentrations efficaces/inhibition (EC₅₀ ou IC₅₀₎et cytotoxiques (CC_50). Dans le contexte de résultats représentatifs, les valeurs EC₅₀ et CC₅₀ de NITD008, un inhibiteur connu des flavivirus¹¹, issus de dépistages basés sur la réplicône sont montrées. Pour les tests enzymatiques, les valeurs IC₅₀ de deux composés de la boîte de réponse pandémique MMV/DNDi, une bibliothèque composée de 400 molécules ayant des activités antibactériennes, antifongiques et antivirales, sont présentées. Les protocoles décrits dans ce travail pourraient être modifiés pour dépister les inhibiteurs d’autres flavivirus apparentés.

Protocole

1. Test d’activité de la luciférase

REMARQUE : S’assurer que toutes les procédures impliquant la culture cellulaire sont effectuées dans des hottes de biosécurité certifiées (voir tableau des matériaux).

1. Préparer des milieux de croissance constitués du milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de FBS et 500 μg/mL de G418.
2. Préparer une solution mère de 10 mM de composés testés dans du DMSO à 100 %, puis les diluer à 1 mM dans du DMSO à 100 %.
3. Culture ZIKV Rluc replicon cellules dans un milieu de croissance dans une fiole de culture de 75 cm² à 37 °C dans un incubateur humidifié au CO₂(voir Tableau des matériaux)jusqu’à ce qu’elles atteignent 70-90% de confluence.
4. Jetez le support. Ajouter 5 mL de trypsine-EDTA dans la fiole pendant 5 à 10 min, puis centrifuger les cellules à 125 x g pendant 5 min.
5. Jeter le surnageant, ressuspender les cellules dans 5 mL de DMEM 10% FBS et compter 10 μL de cellules ressuspendées à un hémocytomètre.
6. Ajuster les cellules à 2 x 10⁴ cellules/puits dans DMEM 10% FBS et ensemencer 100 μL de cellules par puits dans une plaque de culture cellulaire de 96 puits (voir Tableau des matériaux).
7. Incuber la plaque pendant 16 h à 37 °C dans un incubateur humidifié au CO₂(voir Tableau des matériaux).
8. Ensuite, jetez le milieu avec une micropipette multicanal et ajoutez 100 μL / puits de DMEM 2% FBS à la plaque.
9. Ajouter 1 μL des composés par puits pour donner une concentration finale de 10 μM à 1 % de DMSO dans le milieu d’essai. Dans la première colonne, ajoutez seulement 1% de DMSO comme témoin sans inhibition et NITD008 dans la dernière colonne, comme témoin positif (inhibition de 100%).
10. Incuber la plaque pendant 48 h à 37 °C dans un incubateur humidifié au CO₂(voir Tableau des matériaux).
11. Décongeler le kit Renilla luciferase Assay System à température ambiante, préparer une solution de travail 1x Renilla luciferase Lysis Buffer et un volume approprié de réactif Renilla Luciferase (tampon De dosage + substrat; 100 μL par puits), conformément aux instructions du fabricant.
12. Jetez le surnageant des cellules avec une micropipette multicanal et ajoutez 25 μL de 1x tampon de lyse renilla luciferase par puits.
13. Incuber la plaque à température ambiante pendant 15 min, puis transférer 20 μL de lysates cellulaires avec une micropipette multicanal sur une plaque blanche opaque de 96 puits (voir Tableau des matériaux)contenant 100 μL/puits de réactif d’essai renilla luciferase.
14. Lisez les signaux luminescents dans un luminomètre ou dans tout équipement qui a la possibilité de lire la luminescence (voir Tableau des matériaux).
15. Pour chaque plaque, calculer la valeur du facteur Z ¹², comme suit : Z′ = 1 - ((3SD de l’échantillon + 3SD du contrôle)/│Moyenne de l’échantillon - Moyenne du contrôle│); SD - écart type. Un facteur Z compris entre 0,5 et 1,0 signifie un test de bonne qualité ¹².
16. Pour déterminer les valeurs EC₅₀ des composés, procédez comme décrit aux étapes 1.3 à 1.8, puis ajoutez les composés dilués en série aux cellules, ainsi que les témoins négatifs (1% DMSO) et positifs (NITD008 à 10 μM). Effectuez le test deux fois en double.
17. Tracer les valeurs moyennes des taux d’inhibition par concentration de composé et utiliser un logiciel d’analyse graphique pour effectuer un ajustement sigmoïdal et obtenir les valeurs EC_50.

2. Essai MTT basé sur la prolifération cellulaire

1. Procédez comme décrit au point 1, étapes 1.1 à 1.8.
2. Ajouter les composés initialement à 10 μM et le DMSO témoin à 1% dans les cellules.
3. Préparer une solution de MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium bromure) à 5 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na_2HPO4,1,8 mM KH₂PO₄; pH 7,4) et vortex jusqu’à la solubilisation complète du MTT.
4. Ajouter la solution MTT aux cellules à un dixième du volume du puits (10 μL/puits).
5. Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur humidifié au CO₂(voir tableau des matériaux)pendant 3-4 h.
6. Jetez le surnageant avec une micropipette multicanal et ajoutez 100 μL de DMSO (100%) à chaque puits.
7. Solubilisez les cristaux de formazan en pipetant de haut en bas, puis lisez l’absorbance à 570 nm dans un spectrophotomètre (voir Tableau des matériaux).
8. Pour déterminer les valeurs CC₅₀ des composés, procéder comme décrit au point 1 étapes 1.1 à 1.8, puis ajouter les composés dilués en série aux cellules, ensemble le témoin négatif (1% de DMSO). Effectuez le test deux fois en double.
9. Tracez les valeurs moyennes des taux d’inhibition par concentration de composé et utilisez un logiciel d’analyse graphique pour effectuer un ajustement sigmoïdal et obtenir les valeurs CC_50.

3. Dosage de l’activité de la protéase NS2B-NS3

1. Décongeler une aliquote de protéines sur de la glace.
2. Réglez la température du lecteur de plaques (voir Tableau des matériaux)à 37 °C.
3. Préparer la quantité appropriée de protéine diluée à 80 nM (5 μL/puits). La concentration finale en protéines est de 4 nM.
4. Décongeler la quantité appropriée de substrat Bz-nKRR-AMC sur de la glace (solution mère de 300 μM diluée dans un tampon d’essai, 10 μL/puits).
5. Dans une plaque blanche de 96 puits (voir tableau des matériaux),distribuer 84 μL de tampon d’essai (20 mM Tris pH 8,5, 5% glycérol et 0,01% Triton X-100) dans chaque puits.
6. Pour faire la réaction témoin positive, à chaque puits de la dernière colonne distribuer 1 μL d’aprotinine pour atteindre une concentration finale de 1 μM (solution mère 100 μM diluée dans l’eau)
7. Pour faire la réaction témoin négative, à la première colonne distribuer 1 μL de DMSO (concentration finale 1%).
8. Pour effectuer le criblage des composés, distribuer 1 μL de chaque composé pour atteindre une concentration finale de 10 μM (concentration de 1 mM en stock) à l’exclusion des puits témoins positifs et négatifs.
9. Distribuer 5 μL de la solution de protéase.
10. Incuber la plaque à 4 °C pendant 30 minutes.
11. Pour commencer la réaction, distribuer 10 μL de solution mère Bz-nKRR-AMC (concentration finale de 30 μM).
12. Réglez la longueur d’onde d’excitation à 380 nm et l’émission à 460 nm et lisez la fluorescence pendant 30 minutes toutes les 1 minutes dans un lecteur de microplaques (voir Tableau des matériaux). Effectuez toute l’expérience à 37 °C.
13. Calculer les valeurs moyennes de la fluorescence pour les réactions témoins positives et négatives. Définissez à 100 % de l’activité de la protéase la valeur moyenne de la fluorescence pour les réactions de contrôle négatives soustraite de la valeur moyenne du contrôle positif et calculez les pourcentages d’activité pour chaque composé.
14. Pour chaque plaque, calculez la valeur du facteur Z, comme décrit à l’étape 1.15.
15. Procéder à la détermination de la_{CI 50} pour les composés qui présentaient un taux d’inhibition supérieur à 80 %.
16. Effectuer le dosage en trois exemplaires comme décrit aux étapes 3.1-3.13, en utilisant une dilution en série du composé.
17. Tracer les valeurs moyennes des taux d’inhibition par concentration de composé et utiliser un logiciel d’analyse graphique pour effectuer un ajustement sigmoïdal et obtenir les valeurs IC_50.

4. Essai d’allongement NS5 RdRp

REMARQUE: Tous les matériaux utilisés dans ce test sont certifiés sans RNase, DNase et pyrogénase.

1. Préparer à la fois le tampon d’essai (50 mM Tris pH 7,0, 2,5 mM MnCl_2,0,01 % Triton X-100) et la solution mère ATP de 200 mM avec de l’eau traitée à 0,1 % de diéthylpyrocarbonate (DEPC).
2. Recuit d’une aliquote de 5 μL de 200 μM 3′UTR-U₃₀ (5'-biotine-U 30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') dans de l’eau traitée par PCR en l’incubant pendant 5 minutes à 55 °C dans un thermocycleur.
3. Décongeler la solution mère de NS5 RdRp, 200 mM ATP et x10.000 SYBR Green I sur glace.
4. Diluer la protéine à une concentration finale de 250 nM dans 3 mL de tampon d’essai.
5. Préparer la solution de substrat en diluant les solutions mères de l’ATP, du 3'UTR-U₃₀ et du SYBR Green I dans 3 mL de tampon d’essai jusqu’à une concentration finale de 1 mM, 300 nM et 1X, respectivement.
6. Dans une plaque de PCR de 96 puits (voir tableau des matériaux),ajouter 24,5 μL de protéine diluée dans les colonnes 1 à 11 de chaque ligne. Ajouter le même volume de tampon d’essai dans les puits restants.
7. Pour le contrôle et la réaction à blanc, ajouter 0,5 μL de DMSO dans les colonnes 1 et 12. Ajouter 0,5 μL de composé dilué dans du DMSO à une concentration finale de 10 μM 1mM de solution mère).
8. Scellez la plaque avec un film d’étanchéité et incubez à température ambiante pendant 15 minutes.
9. Commencez la réaction en ajoutant 25 μL de solution de substrat et scellez à nouveau la plaque.
10. Incuber à 30 °C dans un système de PCR en temps réel (voir Tableau des matériaux)et surveiller la fluorescence pendant 1 heure, en mesurant la fluorescence toutes les 30 s avec le filtre FAM (Émission:494 nm/Excitation:521 nm).
11. Pour chaque plaque, calculez la valeur du facteur Z, comme décrit à l’étape 1.15.
12. Procéder à la détermination de la CI₅₀ pour les composés qui présentaient un taux d’inhibition supérieur à 80 %, comme décrit à l’étape 3.15.
13. Tracer les valeurs moyennes des taux d’inhibition par concentration de composé et utiliser un logiciel d’analyse graphique pour effectuer un ajustement sigmoïdal et obtenir les valeurs IC_50.

Résultats

Tous les protocoles décrits dans le présent document ont été établis dans des plaques de 96 puits et permettent l’évaluation de 80 composés par plaque dans un criblage primaire d’une seule concentration, y compris les témoins négatifs et positifs placés à la première et à la dernière colonne des plaques, respectivement. Les dépistages basés sur la réplicon sont représentés à la figure 1, qui comprend la construction de l’ARN développée pour obtenir la lignée cell...

Discussion

Les protocoles décrits ici pourraient être facilement adaptés pour les projections dans un format 384 ou 1536 puits. Pour les criblages biochimiques et/ou cellulaires effectués au format HTS, la valeur du facteur Z', un paramètre statistique, est calculée pour chaque plaque afin d’assurer la sensibilité, la reproductibilité et la précision de ces essais¹². Une valeur factorielle Z de 0,5 ou plus est attendue pour les dépistages basés sur la réplicône, tandis qu’une valeur de 0,7 o...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3'	Dharmacon	-	100 ng
96-well cell culture plates	KASVI	K12-096
96-well PCR Microplate	KASVI	K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate	Corning	3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarine)	SIGMA-Aldrich	257370	100 mg
Aprotinin from bovine lung	SIGMA-Aldrich	A1153	10 mg
ATP	JenaBioscience	NU-1010-1G	1 g
Bz-nKRR-AMC	International Peptides	-	5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet	ESCO
Diethyl pyrocarbonate	SIGMA-Aldrich	D5758	25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	SIGMA-Aldrich	472301	1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	GIBCO	3760091
Fetal Bovine Serum	GIBCO	12657-029	500 mL
G418	SIGMA-Aldrich	A1720	Disulfate salt
Glycerol	SIGMA-Aldrich	G5516	1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate	SIGMA-Aldrich	203734	25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)	Invitrogen	M6494
NITD008 ≥98% (HPLC)	Sigma-Aldrich	SML2409	5 mg
qPCR system Mx3000P	Agilent
Renilla luciferase Assay System	PROMEGA	E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader	Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform	Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader	Molecular Devices
SYBR Green I	Invitrogen	S7563	500 µl
Triton X-100	SIGMA-Aldrich	X100	500 mL
Trizma base	SIGMA-Aldrich	T1503	1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X	SIGMA-Aldrich	59417-C	100 mL