Zika Virüs Replikasyonunun inhibitörlerini taramak için yüksek verimli Antiviral Tahliller

Özet

Bu çalışmada, Zika virüsü replikasyonunun inhibitörlerini yüksek verimli bir tarama formatında taramak için replikon bazlı ve viral enzim bazlı tahlillerde kullanılan protokolleri açıklıyoruz.

Özet

Antiviral ilaç keşfi, yüksek verimli tarama (HTS) formatlarında gerçekleştirilebilen güvenilir biyokimyasal ve hücresel tahlillerin geliştirilmesini gerektirir. Flavivirüs yapısal olmayan (NS) proteinlerin endoplazmik retikül (ER) membranlar üzerinde birlikte bir araya getirilerek replikasyon kompleksini (RC) oluşturduğu düşünülmektedir. NS3 ve NS5, RC'nin en çok çalışılan enzimleridir ve viral genom replikasyonunda önemli rolleri nedeniyle ilaç gelişimi için ana hedefleri oluşturmaktadır. Kofaktör olarak NS2B gerektiren NS3 proteaz etki alanı, olgunlaşmamış viral poliproteinin olgun NS proteinlerine bölünmesinden sorumludur, NS5 RdRp etki alanı ise RNA replikasyondan sorumludur. Burada, Zika virüsü (ZIKV) replikasyonunun inhibitörleri için büyük bileşik kütüphaneleri test etmek için replikon tabanlı taramalarda ve enzymatic tahlillerde kullanılan protokolleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Replikonlar, viral yapısal genlerin bir muhabir geni ile değiştirildiği memeli hücrelerinde ifade edilen kendi kendini çoğaltan subgenomik sistemlerdir. Bileşiklerin viral RNA replikasyon üzerindeki inhibitör etkileri, muhabir protein aktivitesindeki azalma ölçülerek kolayca değerlendirilebilir. Replikon bazlı taramalar, Renilla luciferaz'ı muhabir geni olarak ifade eden bhk-21 ZIKV replikon hücre hattı kullanılarak gerçekleştirildi. Tanımlanan bileşiklerin spesifik hedeflerini karakterize etmek için, rekombinant olarak ifade edilen NS3 proteaz ve NS5 RdRp için in-vitro floresan bazlı tahliller kurduk. Viral proteazın proteolitik aktivitesi, florojenik peptit substratı Bz-nKRR-AMC kullanılarak ölçüldü, NS5 RdRp uzama aktivitesi, sentetik biyotinillenmiş kendinden emişli şablon 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') kullanılarak, RNA uzaması sırasında SYBR Green I'in floresan sinyalinin artmasıyla doğrudan tespit edildi.

Giriş

Zika virüsü (ZIKV), halk sağlığı için sürekli tehditler oluşturan, yakından ilişkili Dang virüsü (DENV), Japon ensefalit virüsü (JEV) ve Sarı Humma virüsünü (YFV) içeren Flaviviruscinsinin gelişmekte olan eklembacaklı kaynaklı bir virüs üyesidir¹. Amerika'daki 2015-16 ZIKV salgını, Brezilya'da yenidoğanlarda^2,3 ve yetişkinlerde Guillain-Barré sendromu gibi konjenital ZIKV ilişkili mikrosefali gibi ağır nörolojik bozukluklarla ilişkisi nedeniyle ortaya çıkmasının ardından küresel ilgi gördü⁴. Enfeksiyon vakalarının sayısı önümüzdeki iki yıl boyunca azalsa da, ZIKV'nin otokton sivrisinek kaynaklı bulaşları 2019'da 87 ülke ve bölgede doğrulandı, bu nedenle virüsün bir salgın olarak yeniden ortaya çıkma potansiyeli tahliye edildi⁵. Bugüne kadar ZIKV enfeksiyonuna karşı onaylanmış aşı veya etkili ilaç bulunmamaktadır.

Antiviral ilaç keşfi, yüksek verimli tarama (HTS) formatlarında gerçekleştirilebilen güvenilir hücresel ve biyokimyasal tahlillerin geliştirilmesini gerektirir. Replikon bazlı taramalar ve viral enzim bazlı tahliller, ZIKV¹inhibitörleri için küçük moleküllü bileşikleri test etmek için iki değerli stratejidir. Flavivirüs yapısal olmayan (NS) proteinlerin endoplazmik reticulum (ER) membranları üzerinde birlikte bir araya getirerek replikasyon kompleksini (RC) oluşturduğu düşünülmektedir^6. NS3 ve NS5, RC'nin en çok çalışılan enzimleridir ve viral genom replikasyonunda önemli rolleri nedeniyle ilaç gelişimi için ana hedefleri oluşturmaktadır. Kofaktör olarak NS2B gerektiren NS3 proteaz etki alanı, olgunlaşmamış viral poliproteinin olgun NS proteinlerine bölünmesinden sorumludur, NS5 RdRp etki alanı ise RNA replikasyon⁶.

Replikonlar, viral yapısal genlerin bir muhabir geni ile değiştirildiği memeli hücrelerinde ifade edilen kendi kendini çoğaltan subgenomik sistemlerdir. Bileşiklerin viral RNA replikasyon üzerindeki inhibitör etkileri, muhabir protein aktivitesindeki azalma ölçülerek kolayca değerlendirilebilir⁷. Burada, ZIKV replikasyonunun inhibitörlerinin taranırlığında kullanılan protokolleri 96 kuyu plaka biçiminde açıklıyoruz. Replicon tabanlı tahliller bhk-21 ZIKV Rluc replicon hücre hattı kullanılarak^{gerçekleştirildi}yakın zamanda geliştirdiğimiz 8 . Tanımlanan bileşiklerin spesifik hedeflerini karakterize etmek için, florojenik peptit substratını kullanarak rekombinant olarak ifade edilen NS3 proteaz için in vitro floresan bazlı tahliller kurduk, Bz-nKRR-AMC, NS5 RdRp için sentetik biyotinillenmiş kendinden emişli şablonun uzamasını ölçtük 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3'), intercalating boya SYBR Green I kullanarak.

Glisin zengini bir bağlayıcı [G 4 SG 4 ]) tarafından NS3 proteaz etki alanının 1-177 kalıntılarına bağlı ZIKV proteaz_(45-96NS2B kofaktör kalıntısı) elde edildi, YFV⁹için açıklandığı gibi, polimeraz (RdRp etki alanının 276-898 kalıntısı) klonlandı ve¹⁰'da ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ifade edildi. Her iki enzim dizisi de GenBank ALU33341.1'den türetilmiştir. Primer antiviral taramalar olarak bileşikler 10 μM'de test edilir ve aktiviteleri %80'≥ gösterenler doza bağımlı bir şekilde değerlendirilir ve bu da etkili/inhibisyon (EC₅₀ veya_{IC 50)}ve sitotoksik (CC₅₀₎konsantrasyonları ile sonuçlanır. Temsili sonuçlar bağlamında, NITD008'in EC₅₀ ve CC₅₀ değerleri, bilinen bir flavivirüs inhibitörü¹¹, replikon bazlı taramalardan gösterilmiştir. Enzmatik tahliller için, antibakteriyel, antifungal ve antiviral aktiviteli 400 molekülden oluşan bir kütüphane olan MMV/DNDi Pandemi Müdahale Kutusu'ndan iki bileşiğin IC₅₀ değerleri gösterilmiştir. Bu çalışmada açıklanan protokoller, diğer ilgili flavivirüslerin inhibitörlerini taramak için değiştirilebilir.

Protokol

1. Luciferase aktivitesi tahlili

NOT: Hücre kültürünü içeren tüm prosedürlerin sertifikalı biyogüvenlik başlıklarında yürütüldüğünden emin olun (bkz. Malzeme Tablosu).

1. Dulbecco'nun %10 FBS ve 500 μg/mL G418 ile desteklenmiş Modifiye Kartal Ortası'nda (DMEM) oluşan büyüme ortamı hazırlayın.
2. %100 DMSO'da test edilmiş bileşiklerin 10 mM stok çözeltisini hazırlayın ve ardından%100 DMSO'da 1 mM'ye seyreltin.
3. Kültür ZIKV Rluc replikon hücreleri büyüme ortamlarında 37 °C'de 75 cm² kültür şişesinde CO₂nemlendirilmiş inkübatörde (bkz. Malzeme Tablosu)%70-90 izdiah edene kadar.
4. Ortamı atın. Mataraya 5 ila 10 dakika boyunca 5 mL tripsin-EDTA ekleyin ve ardından hücreleri 5 dakika boyunca 125 x g'da santrifüjleyin.
5. Süpernatantı atın, hücreleri 5 mL DMEM% 10 FBS'de yeniden biriktirin ve hemositometrede 10 μL yeniden kullanılmış hücreleri sayın.
6. Hücreleri DMEM'de 2 x^{10 4} hücre/kuyuya% 10 FBS ve 96 kuyu hücreli bir hücre kültür plakasında kuyu başına 100 μL hücre tohumuna ayarlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
7. Plakayı 37 °C'de 16 saat boyunca CO₂nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın (bkz. Malzeme Tablosu).
8. Ardından, ortamı çok kanallı bir mikropipette ile atın ve plakaya 100 μL / kuyu DMEM% 2 FBS ekleyin.
9. Test ortamında 10 μM% 1 DMSO nihai konsantrasyona neden olmak için kuyu başına 1 μL bileşik ekleyin. İlk sütunda, inhibisyon kontrolü yok olarak yalnızca%1 DMSO ve son sütuna NITD008'i pozitif kontrol (%100 inhibisyon) olarak ekleyin.
10. Plakayı 37 °C'de 48 saat boyunca CO₂nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın (bkz. Malzeme Tablosu).
11. Renilla luciferase Tahlil Sistemi kitini oda sıcaklığında çözün, üreticinin talimatlarına göre 1x Renilla luciferaz Liziz Tampon çalışma çözeltisi ve uygun miktarda Renilla Luciferaz reaktifi (Test tamponu + substrat; kuyu başına 100 μL) hazırlayın.
12. Süpernatantı çok kanallı bir mikropipette ile hücrelerden atın ve kuyu başına 25 μL 1x Renilla luciferaz Lizis Tamponu ekleyin.
13. Plakayı oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından çok kanallı bir mikropipette ile 20 μL hücre lysates'i 100 μL / kuyu Renilla luciferase Assay Reaktif içeren beyaz bir opak 96 kuyu plakasına aktarın (bkz. Malzeme Tablosu).
14. Işıklı işaretleri bir ışıkölçerde veya lüminesansı okuma seçeneği olan herhangi bir ekipmanda okuyun (bkz. Malzeme Tablosu).
15. Her plaka için, Z faktör değerini ^{hesaplayın 12}, aşağıdaki gibi: Z′ = 1 - ((3SD numune + 3SD kontrol)/│Ekek- Kontrol ortalaması│); SD - standart sapma. 0.5 ile 1.0 arasında bir Z faktörü, kaliteli bir test anlamına gelir ¹².
16. Bileşiklerin EC₅₀ değerlerini belirlemek için, 1,3 ila 1,8 adımlarında açıklandığı gibi ilerleyin ve ardından negatif (%1 DMSO) ve pozitif (NITD008 at 10 μM) kontrollerle birlikte hücrelere seri olarak seyreltilmiş bileşikleri ekleyin. Tahlili iki kez yinelenen olarak gerçekleştirin.
17. Bileşik konsantrasyon başına ortalama inhibisyon oranlarının değerlerini çizin ve sigmoidal bir montaj gerçekleştirmek ve EC₅₀ değerlerini elde etmek için bir grafik analiz yazılımı kullanın.

2. Hücre çoğalmasına dayalı MTT tahlili

1. Madde 1 adım 1.1 ila 1.8'de açıklandığı gibi devam edin.
2. Bileşikleri başlangıçta 10 μM'de ve kontrol% 1 DMSO'yu hücrelere ekleyin.
3. Fosfat tamponlu salin (PBS - 137 mM NaCl), 5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimetiltiyazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium bromür) çözeltisi hazırlayın 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄; pH 7.4) ve MTT'nin tam çözünmesine kadar girdap.
4. MTT çözeltisini kuyu hacminin onda birinde hücrelere ekleyin (10 μL/kuyu).
5. Plakayı 3-4 saat boyunca CO₂nemlendirilmiş bir inkübatörde (bkz. Malzeme Tablosu) 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
6. Süpernatantı çok kanallı bir mikropipette ile atın ve her kuyuya 100 μL DMSO (%100) ekleyin.
7. Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak formazan kristallerini çözün ve ardından bir spektrofotometrede 570 nm'de emiciyi okuyun (bkz. Malzeme Tablosu).
8. Bileşiklerin CC₅₀ değerlerini belirlemek için, madde 1 adım 1.1 ila 1.8'de açıklandığı gibi devam edin ve ardından negatif (%1 DMSO) denetimi birlikte hücrelere seri olarak seyreltilmiş bileşikleri ekleyin. Tahlili iki kez yinelenen olarak gerçekleştirin.
9. Bileşik konsantrasyon başına ortalama inhibisyon oranlarının değerlerini çizin ve sigmoidal bir montaj gerçekleştirmek ve CC₅₀ değerlerini elde etmek için bir grafik analiz yazılımı kullanın.

3. NS2B-NS3 proteaz aktivitesi testi

1. Buzda bir protein aliquot çözün.
2. Plaka okuyucuyu (bkz. Malzeme Tablosu)sıcaklığı 37°C olarak ayarlayın.
3. 80 nM'ye (5 μL/kuyu) seyreltilmiş uygun miktarda protein hazırlayın. Son protein konsantrasyonu 4 nM'dir.
4. Uygun miktarda Bz-nKRR-AMC substratını buz üzerinde çözün (300 μM stok çözeltisi test tamponunda seyreltilmiş, 10 μL / kuyu).
5. 96 kuyulu beyaz bir plakada (bkz. Malzeme Tablosu),her kuyuya 84 μL test tamponu (20 mM Tris pH 8.5, % 5 gliserol ve% 0.01 Triton X-100) dağıtın.
6. Pozitif kontrol reaksiyonunu yapmak için, son sütunun her kuyusuna 1 μM'lik son konsantrasyonu elde etmek için 1 μL Aprotinin dağıtın (su ile seyreltilmiş stok çözeltisi 100 μM)
7. Negatif kontrol reaksiyonunu yapmak için, ilk sütuna 1 μL DMSO dağıtın (son konsantrasyon% 1).
8. Bileşik taramayı gerçekleştirmek için, pozitif ve negatif kontrol kuyuları hariç 10 μM (1 mM stok konsantrasyonu) nihai konsantrasyonu elde etmek için her bileşiğin 1 μL'sini dağıtın.
9. Proteaz çözeltisinin 5 μL'lik kısmını dağıtın.
10. Plakayı 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
11. Reaksiyonu başlatmak için 10 μL Bz-nKRR-AMC stok çözeltisi (30 μM'lik son konsantrasyon) dağıtın.
12. Heyecan dalga boyunu 380 nm ve emisyonu 460 nm olarak ayarlayın ve bir mikro plaka okuyucuda her 1 dakikada bir 30 dakika floresan okuyun (bkz. Malzeme Tablosu). Deneyin tamamını 37 °C'de gerçekleştirin.
13. Pozitif ve negatif kontrol reaksiyonları için floresan ortalama değerlerini hesaplayın. Proteaz aktivitesinin % 100'ü olarak ayarlayın pozitif kontrolün ortalama değerinin çıkarılan negatif kontrol reaksiyonları için floresan ortalama değeri ve her bileşik için aktivite yüzdelerini hesaplayın.
14. Her plaka için, adım 1.15'te açıklandığı gibi Z faktörü değerini hesaplayın.
15. %80'den yüksek bir inhibisyon oranı sergileyen bileşikler için IC₅₀ tayini ile devam edin.
16. 3.1-3.13 adımlarında açıklandığı gibi, bileşiğin seri seyreltilmesini kullanarak üç taraflı test gerçekleştirin.
17. Bileşik konsantrasyon başına ortalama inhibisyon oranlarının değerlerini çizin ve sigmoidal bir montaj gerçekleştirmek ve IC₅₀ değerlerini elde etmek için bir grafik analiz yazılımı kullanın.

4. NS5 RdRp uzama tahlili

NOT: Bu testte kullanılan tüm malzemeler RNase, DNase ve pirogenaz içermeyen sertifikalıdır.

1. Hem test tamponunu (50 mM Tris pH 7.0, 2.5 mM MnCl₂, %0.01 Triton X-100) hem de %0.1 dietilpyrokarbonat (DEPC) arıtılmış su ile 200 mM ATP stok solüsyonunu hazırlayın.
2. PCR arıtılmış suda 200 μM 3′UTR-U₃₀ (5'-biotin-U₃₀-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') 5 μL aliquot bir termosikler içinde 55 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırarak arıtılmış su.
3. NS5 RdRp, 200 mM ATP ve x10.000 SYBR Green I stok çözeltisini buz üzerinde çözün.
4. Proteini 3 mL test tamponunda 250 nM'lik son konsantrasyona seyreltin.
5. ATP, 3'UTR-U 30 ve SYBR Green I stok çözeltilerini_{sırasıyla 1} mM, 300 nM ve 1X'lik son konsantrasyona kadar 3 mL test tamponunda seyrelterek substrat çözeltisi hazırlayın.
6. 96 kuyulu bir PCR plakasında (bkz. Malzeme Tablosu),her satırın 1 ila 11 numaralı sütunlarına 24,5 μL seyreltilmiş protein ekleyin. Kalan kuyulara aynı miktarda test arabelleği ekleyin.
7. Kontrol ve boş reaksiyon için, sütun 1 ve 12'ye 0,5 μL DMSO ekleyin. DMSO'da seyreltilmiş 0,5 μL bileşik, 10 μM 1m stok çözeltisinin son konsantrasyonuna ekleyin).
8. Plakayı bir sızdırmazlık filmi ile kapatın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
9. Reaksiyona 25 μL substrat çözeltisi ekleyerek başlayın ve plakayı tekrar kapatın.
10. Gerçek zamanlı bir PCR sisteminde 30 °C'de kuluçkaya yatırın (bkz. Malzeme Tablosu)ve floresanları 1 saat boyunca izleyin, fam filtresi ile her 30 sn floresan ölçülebilir (Emisyon:494 nm/Excitation:521 nm).
11. Her plaka için, adım 1.15'te açıklandığı gibi Z faktörü değerini hesaplayın.
12. Adım_3.15'te açıklandığı gibi% 80'den daha yüksek bir inhibisyon oranı sergileyen bileşikler için IC 50 belirlemesine devam edin.
13. Bileşik konsantrasyon başına ortalama inhibisyon oranlarının değerlerini çizin ve sigmoidal bir montaj gerçekleştirmek ve IC₅₀ değerlerini elde etmek için bir grafik analiz yazılımı kullanın.

Sonuçlar

Burada açıklanan tüm protokoller 96 kuyu plakalarında bıçaklanmıştır ve plakaların ilk ve son sütununa yerleştirilen negatif ve pozitif kontroller de dahil olmak üzere tek bir konsantrasyonun birincil taramasında plaka başına 80 bileşiğin değerlendirilmesine izin verir. Replikon tabanlı taramalar, BHK-21-RepZIKV_IRES-Neohücre hattını elde etmek için geliştirilen RNA yapısı ( Şekil1A), tahlil şematik gösterimi ( Şekil

Tartışmalar

Burada açıklanan protokoller, 384 veya 1536 kuyu formatlarındaki gösterimler için kolayca uyarlanabilir. HTS formatında gerçekleştirilen biyokimyasal ve/veya hücre bazlı taramalar için, istatistiksel bir parametre olan Z faktörü değeri, bu tahlillerin hassasiyetini, tekrarlanabilirliğini ve doğruluğunu sağlamak için her plaka için hesaplanır¹². Replikon tabanlı taramalar için 0,5 ve üzeri bir Z' faktör değeri beklenirken, NS3 ve NS5 etkinlik tahlilleri için 0,7 ve üzeri...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3'	Dharmacon	-	100 ng
96-well cell culture plates	KASVI	K12-096
96-well PCR Microplate	KASVI	K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate	Corning	3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarine)	SIGMA-Aldrich	257370	100 mg
Aprotinin from bovine lung	SIGMA-Aldrich	A1153	10 mg
ATP	JenaBioscience	NU-1010-1G	1 g
Bz-nKRR-AMC	International Peptides	-	5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet	ESCO
Diethyl pyrocarbonate	SIGMA-Aldrich	D5758	25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	SIGMA-Aldrich	472301	1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	GIBCO	3760091
Fetal Bovine Serum	GIBCO	12657-029	500 mL
G418	SIGMA-Aldrich	A1720	Disulfate salt
Glycerol	SIGMA-Aldrich	G5516	1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate	SIGMA-Aldrich	203734	25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)	Invitrogen	M6494
NITD008 ≥98% (HPLC)	Sigma-Aldrich	SML2409	5 mg
qPCR system Mx3000P	Agilent
Renilla luciferase Assay System	PROMEGA	E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader	Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform	Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader	Molecular Devices
SYBR Green I	Invitrogen	S7563	500 µl
Triton X-100	SIGMA-Aldrich	X100	500 mL
Trizma base	SIGMA-Aldrich	T1503	1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X	SIGMA-Aldrich	59417-C	100 mL