Saggi antivirali ad alto rendimento per lo screening degli inibitori della replicazione del virus Zika

Riepilogo

In questo lavoro, descriviamo i protocolli utilizzati nei saggi basati su enzimi replicon e virali per lo screening degli inibitori della replicazione del virus Zika in un formato di screening ad alto rendimento.

Abstract

La scoperta di farmaci antivirali richiede lo sviluppo di saggi biochimici e cellulari affidabili che possono essere eseguiti in formati di screening ad alto rendimento (HTS). Si ritiene che le proteine non strutturali (NS) del flavivirus si assemblino co-traduzionalmente sulle membrane del reticolo endoplasmatico (ER), formando il complesso di replicazione (RC). NS3 e NS5 sono gli enzimi più studiati della RC e costituiscono i principali bersagli per lo sviluppo di farmaci a causa dei loro ruoli cruciali nella replicazione del genoma virale. Il dominio della proteasi NS3, che richiede NS2B come cofattore, è responsabile della scissione della poliproteina virale immatura nelle proteine NS mature, mentre il dominio NS5 RdRp è responsabile della replicazione dell'RNA. Qui descriviamo in dettaglio i protocolli utilizzati negli screening basati su replicon e nei saggi enzimatici per testare grandi librerie di composti per inibitori della replicazione del virus Zika (ZIKV). I repliconi sono sistemi subgenomici autoreplicanti espressi in cellule di mammifero, in cui i geni strutturali virali sono sostituiti da un gene reporter. Gli effetti inibitori dei composti sulla replicazione dell'RNA virale possono essere facilmente valutati misurando la riduzione dell'attività della proteina reporter. Gli screening basati su replicon sono stati eseguiti utilizzando una linea cellulare replicon ZIKV BHK-21 che esprime Renilla luciferasi come gene reporter. Per caratterizzare i bersagli specifici dei composti identificati, abbiamo stabilito saggi in vitro basati sulla fluorescenza per la proteasi NS3 e NS5 RdRp espressi in modo ricombinante. L'attività proteolitica della proteasi virale è stata misurata utilizzando il substrato peptidico fluorogenico Bz-nKRR-AMC, mentre l'attività di allungamento di NS5 RdRp è stata rilevata direttamente dall'aumento del segnale fluorescente di SYBR Green I durante l'allungamento dell'RNA, utilizzando il modello autoadescante biotinilato sintetico 3′UTR-U30 (5'-biotina-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3').

Introduzione

Il virus Zika (ZIKV) è un virus emergente trasmesso da artropodi membro del genere Flavivirus, che comprende il virus Dengue strettamente correlato (DENV), il virus dell'encefalite giapponese (JEV) e il virus della febbre gialla (YFV), che rappresentano costanti minacce per la salute pubblica¹. L'epidemia di ZIKV del 2015-16 nelle Americhe ha ricevuto un'attenzione globale in seguito alla sua comparsa in Brasile a causa dell'associazione con gravi disturbi neurologici, come la microcefalia congenita associata a ZIKV nei neonati^2,3 e la sindrome di Guillain-Barré negli adulti⁴. Sebbene il numero di casi di infezione sia diminuito nei prossimi due anni, le trasmissioni autoctone trasmesse dalle zanzare di ZIKV sono state verificate in 87 paesi e territori nel 2019, evidenziando quindi il potenziale del virus di riemergere come epidemia⁵. Ad oggi, non ci sono vaccini approvati o farmaci efficaci contro l'infezione da ZIKV.

La scoperta di farmaci antivirali richiede lo sviluppo di saggi cellulari e biochimici affidabili che possono essere eseguiti in formati di screening ad alto rendimento (HTS). Gli screening basati su Replicon e i saggi basati su enzimi virali sono due strategie preziose per testare composti a piccole molecole per gli inibitori di ZIKV¹. Si ritiene che le proteine non strutturali (NS) del flavivirus si assemblino co-traduzionalmente sulle membrane del reticolo endoplasmatico (ER), formando il complesso di replicazione (RC)⁶. NS3 e NS5 sono gli enzimi più studiati della RC e costituiscono i principali bersagli per lo sviluppo di farmaci a causa dei loro ruoli cruciali nella replicazione del genoma virale. Il dominio della proteasi NS3, che richiede NS2B come cofattore, è responsabile della scissione della poliproteina virale immatura nelle proteine NS mature, mentre il dominio NS5 RdRp è responsabile della replicazione dell'RNA⁶.

I repliconi sono sistemi subgenomici autoreplicanti espressi in cellule di mammifero, in cui i geni strutturali virali sono sostituiti da un gene reporter. Gli effetti inibitori dei composti sulla replicazione dell'RNA virale possono essere facilmente valutati misurando la riduzione dell'attività della proteina reporter⁷. Qui descriviamo i protocolli utilizzati per lo screening degli inibitori della replicazione ZIKV in un formato di piastra a 96 pozzetti. I saggi basati su replicon sono stati eseguiti utilizzando una linea cellulare BHK-21 ZIKV Rluc replicon che abbiamo recentemente sviluppato⁸. Per caratterizzare i bersagli specifici dei composti identificati, abbiamo stabilito saggi in vitro basati sulla fluorescenza per la proteasi NS3 espressa in modo ricombinante utilizzando il substrato peptidico fluorogenico, Bz-nKRR-AMC, mentre per NS5 RdRp abbiamo misurato l'allungamento del modello autoadescante biotinilato sintetico 3′UTR-U30 (5'-biotina-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3'), utilizzando il colorante intercalante SYBR Green I.

La proteasi ZIKV (45-96 residui di cofattore NS2B legati ai residui 1-177 del dominio proteasi NS3 da un linker ricco di glicina [G₄SG₄]) è stata ottenuta, come descritto per YFV⁹, mentre la polimerasi (276-898 residui del dominio RdRp) è stata clonata ed espressa, come dettagliato in¹⁰. Entrambe le sequenze enzimatiche sono state derivate da GenBank ALU33341.1. Come screening antivirali primari, i composti vengono testati a 10 μM e quelli che mostrano attività ≥ l'80% vengono quindi valutati in modo dose-dipendente, con conseguente efficacia/inibizione (EC₅₀ o IC₅₀₎e concentrazioni citotossiche (CC_50). Nel contesto di risultati rappresentativi, vengono mostrati i valori EC₅₀ e CC₅₀ di NITD008, un noto inibitore dei flavivirus¹¹, da screening basati su replicon. Per i saggi enzimatici vengono mostrati i valori IC₅₀ di due composti della MMV/DNDi Pandemic Response Box, una libreria composta da 400 molecole con attività antibatterica, antimicotica e antivirale. I protocolli descritti in questo lavoro potrebbero essere modificati per lo screening degli inibitori di altri flavivirus correlati.

Protocollo

1. Test di attività della luciferasi

NOTA: Assicurarsi che tutte le procedure che coinvolgono la coltura cellulare siano condotte in cappe di biosicurezza certificate (vedere Tabella dei materiali).

1. Preparare i mezzi di crescita costituiti dal Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di FBS e 500 μg/mL G418.
2. Preparare una soluzione stock da 10 mM di composti testati in DMSO al 100%, quindi diluirli a 1 mM in DMSO al 100%.
3. Cellule di coltura ZIKV Rluc replicon in mezzi di crescita in un pallone di coltura di 75 cm² a 37 °C in un incubatore umidificato a CO₂(vedi Tabella dei materiali)fino a raggiungere il 70-90% di confluenza.
4. Scartare il mezzo. Aggiungere 5 ml di tripsina-EDTA al matraccio per 5-10 minuti e quindi centrifugare le cellule a 125 x g per 5 minuti.
5. Scartare il surnatante, risospenare le cellule in 5 ml di DMEM 10% FBS e contare 10 μL di cellule riaspense in un emocitometro.
6. Regolare le celle a 2 x 10⁴ cellule / pozzetti in DMEM 10% FBS e seminare 100 μL di cellule per pozzetti in una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti (vedere Tabella dei materiali).
7. Incubare la piastra per 16 ore a 37 °C in un incubatore umidificato a CO₂(vedi Tabella dei materiali).
8. Quindi, scartare il mezzo con una micropipetta multicanale e aggiungere 100 μL / pozzetti di DMEM 2% FBS alla piastra.
9. Aggiungere 1 μL di composti per pozzedo per risultare in una concentrazione finale di 10 μM 1% DMSO nel mezzo di saggio. Nella prima colonna, aggiungere solo l'1% di DMSO come controllo senza inibizione e NITD008 nell'ultima colonna, come controllo positivo (inibizione al 100%).
10. Incubare la piastra per 48 ore a 37 °C in un incubatore umidificato a CO₂(vedi Tabella dei materiali).
11. Scongelare il kit Renilla luciferase Assay System a temperatura ambiente, preparare una soluzione di lavoro 1x Renilla luciferase Lysis Buffer e un volume appropriato di reagente Renilla Luciferase (Assay buffer + substrato; 100 μL per pozzetti), secondo le istruzioni del produttore.
12. Scartare il surnatante dalle cellule con una micropipetta multicanale e aggiungere 25 μL di 1x Renilla luciferase Lysis Buffer per pozzet.
13. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti e quindi trasferire 20 μL di lisati cellulari con una micropipetta multicanale in una piastra bianca opaca a 96 pozzetti (vedi Tabella dei materiali)contenente 100 μL/pozzetti di Reagente per il dosaggio della renilla luciferasi.
14. Leggere i segnali luminescenti in un luminometro o in qualsiasi apparecchiatura che abbia la possibilità di leggere la luminescenza (vedi Tabella dei materiali).
15. Per ogni piastra, calcolare il valore del fattore Z ¹², come segue: Z′ = 1 - ((3SD del campione + 3SD del controllo)/│Media del campione - Media del controllo│); SD - deviazione standard. Un fattore Z compreso tra 0,5 e 1,0 significa un saggio di buona qualità ¹².
16. Per determinare i valori EC₅₀ dei composti, procedere come descritto nei passaggi da 1.3 a 1.8 e quindi aggiungere i composti diluiti in serie alle cellule , insieme ai controlli negativo (1% DMSO) e positivo (NITD008 a 10 μM). Eseguire il test due volte in duplicati.
17. Tracciare i valori medi dei tassi di inibizione per concentrazione composta e utilizzare un software di analisi grafale per eseguire un raccordo sigmoidale e ottenere i valori EC_50.

2. Test MTT basato sulla proliferazione cellulare

1. Procedere come descritto al punto 1 passaggi da 1.1 a 1.8.
2. Aggiungere i composti inizialmente a 10 μM e il controllo 1% DMSO alle cellule.
3. Preparare una soluzione di MTT da 5 mg/mL (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio bromuro) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄; pH 7,4) e vortice fino alla completa solubilizzazione di MTT.
4. Aggiungere la soluzione MTT alle celle a un decimo del volume del pozzo (10 μL/pozzo).
5. Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore umidificato a CO₂(vedi Tabella dei materiali)per 3-4 ore.
6. Scartare il surnatante con una micropipetta multicanale e aggiungere 100 μL di DMSO (100%) a ciascun pozzetta.
7. Solubilizzare i cristalli formazan mediante pipettaggio su e giù e poi leggere l'assorbanza a 570 nm in uno spettrofotometro (vedi Tabella dei materiali).
8. Per determinare i valori CC₅₀ dei composti, procedere come descritto al punto 1 passaggi da 1.1 a 1.8 e quindi aggiungere i composti diluiti in serie alle cellule, insieme al controllo negativo (1% DMSO). Eseguire il test due volte in duplicati.
9. Tracciare i valori medi dei tassi di inibizione per concentrazione composta e utilizzare un software di analisi grafale per eseguire un raccordo sigmoidale e ottenere i valori CC_50.

3. Test dell'attività della proteasi NS2B-NS3

1. Scongelare un'aliquota proteica sul ghiaccio.
2. Impostare la temperatura del lettore di piastre (vedi Tabella dei materiali)a 37°C.
3. Preparare la quantità appropriata di proteine diluite a 80 nM (5 μL/pozzo). La concentrazione finale di proteine è di 4 nM.
4. Scongelare la quantità appropriata di substrato di Bz-nKRR-AMC sul ghiaccio (300 μM di soluzione stock diluita in tampone di dosaggio, 10 μL/pozzetti).
5. In una piastra bianca a 96 pozzetti (vedi Tabella dei materiali),erogare 84 μL di tampone di dosaggio (20 mM Tris pH 8,5, 5% glicerolo e 0,01% Triton X-100) in ciascun pozzetti.
6. Per effettuare la reazione di controllo positivo, ad ogni pozzetto dell'ultima colonna erogare 1 μL di Aprotinina per raggiungere la concentrazione finale di 1 μM (soluzione stock 100 μM diluita in acqua)
7. Per effettuare la reazione di controllo negativa, alla prima colonna erogare 1 μL di DMSO (concentrazione finale 1%).
8. Per eseguire lo screening del composto, erogare 1 μL di ciascun composto per raggiungere una concentrazione finale di 10 μM (1 mM di concentrazione di stock) esclusi i pozzi di controllo positivi e negativi.
9. Erogare 5 μL della soluzione di proteasi.
10. Incubare la piastra a 4 °C per 30 minuti.
11. Per avviare la reazione, erogare 10 μL di soluzione stock Bz-nKRR-AMC (concentrazione finale di 30 μM).
12. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 380 nm e l'emissione a 460 nm e leggere la fluorescenza per 30 minuti ogni 1 minuto in un lettore di micropiasche (vedi Tabella dei materiali). Eseguire l'intero esperimento a 37 °C.
13. Calcolare i valori medi della fluorescenza per le reazioni di controllo positive e negative. Impostare come 100% dell'attività della proteasi il valore medio di fluorescenza per le reazioni di controllo negative sottratto del valore medio di controllo positivo e calcolare le percentuali di attività per ciascun composto.
14. Per ogni piastra, calcolare il valore del fattore Z, come descritto nel passaggio 1.15.
15. Procedere con la determinazione IC₅₀ per i composti che hanno mostrato un tasso di inibizione superiore all'80%.
16. Eseguire il test in triplicati come descritto nei passaggi 3.1-3.13, utilizzando una diluizione seriale del composto.
17. Tracciare i valori medi dei tassi di inibizione per concentrazione composta e utilizzare un software di analisi grafale per eseguire un raccordo sigmoidale e ottenere i valori IC_50.

4. Test di allungamento NS5 RdRp

NOTA: Tutti i materiali utilizzati in questo test sono certificati RNasi, DNasi e pyrogenase free.

1. Preparare sia il tampone di dosaggio (50 mM Tris pH 7,0, 2,5 mM MnCl₂, 0,01% Triton X-100) sia la soluzione stock atP da 200 mM con acqua trattata con lo 0,1% di dietipirocarbonato (DEPC).
2. Ricottura di un'aliquota di 5 μL di 200 μM 3′UTR-U₃₀ (5'-biotina-U₃₀-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') in acqua trattata con PCR incubandola per 5 minuti a 55 °C in un termociclatore.
3. Scongelare la soluzione stock di NS5 RdRp, 200 mM ATP e x10.000 SYBR Green I sul ghiaccio.
4. Diluire la proteina ad una concentrazione finale di 250 nM in 3 ml di tampone di dosaggio.
5. Preparare la soluzione di substrato diluendo le soluzioni stock di ATP, 3'UTR-U₃₀ e SYBR Green I in 3 mL di tampone di dosaggio a una concentrazione finale di 1 mM, 300 nM e 1X, rispettivamente.
6. In una piastra PCR a 96 pozzetti (vedi Tabella dei materiali),aggiungere 24,5 μL di proteina diluita nelle colonne da 1 a 11 di ogni riga. Aggiungere lo stesso volume di tampone di dosaggio nei pozzi rimanenti.
7. Per il controllo e la reazione in bianco, aggiungere 0,5 μL di DMSO nelle colonne 1 e 12. Aggiungere 0,5 μL di composto diluito in DMSO ad una concentrazione finale di 10 μM 1mM di soluzione stock).
8. Sigillare la piastra con un film sigillante e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
9. Iniziare la reazione aggiungendo 25 μL di soluzione di substrato e sigillare nuovamente la piastra.
10. Incubare a 30 °C in un sistema PCR in tempo reale (vedi Tabella dei Materiali)e monitorare la fluorescenza per 1 ora, misurando la fluorescenza ogni 30 s con il filtro FAM (Emissione:494 nm/Eccitazione:521 nm).
11. Per ogni piastra, calcolare il valore del fattore Z, come descritto nel passaggio 1.15.
12. Procedere con la determinazione IC₅₀ per i composti che hanno mostrato un tasso di inibizione superiore all'80%, come descritto nel passaggio 3.15.
13. Tracciare i valori medi dei tassi di inibizione per concentrazione composta e utilizzare un software di analisi grafale per eseguire un raccordo sigmoidale e ottenere i valori IC_50.

Risultati

Tutti i protocolli qui descritti sono stati stabiliti in piastre a 96 pozzetti e consentono la valutazione di 80 composti per piastra in uno screening primario di una singola concentrazione, compresi i controlli negativi e positivi posti rispettivamente alla prima e all'ultima colonna delle piastre. Gli screening basati su replicon sono rappresentati in Figura 1,che include il costrutto di RNA sviluppato per ottenere la linea cellulare BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo (Figura 1A<...

Discussione

I protocolli qui descritti potrebbero essere facilmente adattati per le proiezioni in un formato a 384 o 1536 pozze. Per gli screening biochimici e/o cellulari eseguiti in formato HTS, il valore del fattore Z', un parametro statistico, viene calcolato per ciascuna piastra per garantire la sensibilità, la riproducibilità e l'accuratezza di tali saggi¹². Un valore del fattore Z' di 0,5 o superiore è previsto per gli screening basati su replicon, mentre un valore di 0,7 o superiore è previsto per...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3'	Dharmacon	-	100 ng
96-well cell culture plates	KASVI	K12-096
96-well PCR Microplate	KASVI	K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate	Corning	3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarin)	SIGMA-Aldrich	257370	100 mg
Aprotinin from bovine lung	SIGMA-Aldrich	A1153	10 mg
ATP	JenaBioscience	NU-1010-1G	1 g
Bz-nKRR-AMC	International Peptides	-	5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet	ESCO
Diethyl pyrocarbonate	SIGMA-Aldrich	D5758	25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	SIGMA-Aldrich	472301	1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	GIBCO	3760091
Fetal Bovine Serum	GIBCO	12657-029	500 mL
G418	SIGMA-Aldrich	A1720	Disulfate salt
Glycerol	SIGMA-Aldrich	G5516	1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate	SIGMA-Aldrich	203734	25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)	Invitrogen	M6494
NITD008 ≥98% (HPLC)	Sigma-Aldrich	SML2409	5 mg
qPCR system Mx3000P	Agilent
Renilla luciferase Assay System	PROMEGA	E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader	Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform	Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader	Molecular Devices
SYBR Green I	Invitrogen	S7563	500 µl
Triton X-100	SIGMA-Aldrich	X100	500 mL
Trizma base	SIGMA-Aldrich	T1503	1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X	SIGMA-Aldrich	59417-C	100 mL