ブタ腸粘膜上皮におけるアミノペプチダーゼNを標的とするモノクローナル抗体の作製

要約

pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO細胞で発現する組換え抗体タンパク質と、従来のハイブリドーマ技術を使用して産生されたモノクローナル抗体は、ブタアミノペプチダーゼN(APN)タンパク質を認識して結合することができます。

要約

小腸粘膜に豊富に存在する膜結合メタロペプチダーゼであるブタアミノペプチダーゼN(APN)は、低タンパク質発現、酵素不活性、構造変化などの干渉なしに粘膜免疫応答を開始できます。これにより、APNは粘膜上皮を選択的に標的とするワクチンの開発において魅力的な候補となります。以前の研究では、APNが毒素原性 大腸 菌(大腸菌)F4と伝染性胃腸炎ウイルスの両方の受容体タンパク質であることが示されています。したがって、APNは、抗体薬物複合体またはAPN特異的抗体に基づく新規ワクチンの開発において有望である。本研究では、従来のハイブリドーマ技術と遺伝子組換え抗体発現法を用いたAPN特異的モノクローナル抗体(mAb)の産生を比較した。また、pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APNとpET28a(+)-rAbs-APNベクターを保持する 大腸菌 発現BL21(DE3)株を使用して、安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を樹立しました。結果は、pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO細胞およびハイブリドーマを用いて産生されたmAbsで発現する抗体がAPNタンパク質を認識し、結合できることを示しています。これは、異なるAPN特異的エピトープを標的とする治療薬の開発のためのAPN受容体機能のさらなる解明の基礎を提供します。

概要

メタロプロテイナーゼM1ファミリーに属する月光酵素であるアミノペプチダーゼN(APN)は、酵素依存性および酵素非依存性の経路を介して腫瘍マーカー、受容体、およびシグナル伝達分子として機能します^1,2。APNは、様々な生理活性ペプチドのN末端アミノ酸残基を切断してそれらの生物学的活性を調節することに加えて、様々な炎症性疾患の病因において重要な役割を果たす。APNは、主要組織適合遺伝子複合体クラスII分子に強固に結合するトリミングペプチドによる抗原プロセシングおよび提示に関与しています^2,3。APNはまた、複数のシグナル伝達に関与するGタンパク質共役受容体と結合し、サイトカイン分泌を調節し、免疫応答におけるFcガンマ受容体媒介食作用に寄与することにより、抗炎症効果を発揮します^4,5,6,7。

広く分布している膜結合型エキソペプチダーゼとして、APNはブタの小腸粘膜に豊富にあり、受容体媒介性エンドサイトーシスと密接に関連しています^1,5,8。APNは、細胞侵入のために伝染性胃腸炎ウイルスのスパイクタンパク質を認識して結合し、毒素原性大腸菌F4線ブリアのFaeGサブユニットと直接相互作用して、宿主細胞との細菌接着に影響を与えます9,10,11。したがって、APNは、ウイルスおよび細菌感染症の治療における潜在的な治療標的である。

1975年にモノクローナル抗体(mAb)産生のためのハイブリドーマ技術およびその他の戦略が開発されて以来、mAbは免疫療法、薬物送達、および診断に広く使用されてきました^12,13,14。現在、モノクローナル抗体は、癌、炎症性腸疾患、多発性硬化症などの疾患の治療に成功しています^12,15。モノクローナル抗体は、その強力な親和性と特異性により、抗体薬物複合体(ADC)や新規ワクチンの開発において理想的な標的となり得る^16,17。APNタンパク質は、抗原を特定の細胞に選択的に送達するために重要であり、低タンパク質発現、酵素不活性、または構造変化を含む干渉なしに、病原体に対する特異的で強力な粘膜免疫応答を誘発することができる^5,8,18。したがって、APN特異的モノクローナル抗体に基づく治療用製品は、細菌およびウイルス感染に対して有望です。本研究では、ハイブリドーマ技術を用いたAPN特異的モノクローナル抗体の産生、および原核生物および真核生物ベクターを用いた抗APN組換え抗体(rAbs)の発現について述べる。この結果は、APNタンパク質がpIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO細胞およびハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体の両方で発現したrAbsによって認識されたことを示している。

プロトコル

この研究のすべての動物実験は、揚州大学施設動物管理および使用委員会(SYXK20200041)によって承認されました。

1. ブタAPNタンパク質抗原の調製

注:pET28a(+)-APN-BL21(DE3)株およびAPN安定発現細胞pEGFP-C1-APN-IPEC-J2は、以前の研究¹¹で構築されました。

1. 凍結グリセロールストックから細菌を回収し、50 μg/mLカナマイシン(Km⁺)を含むLuria-Bertani(LB)プレートにストリークして単一コロニーを分離します。
2. 新たに縞模様のプレートから単一のコロニーを選択し、Km⁺⁽ 50 μg/mL)を添加した4 mLのLB培地(10 g/Lトリプトン、10 g/L塩化ナトリウム(NaCl)および5 g/L酵母エキス、pH 7.2)で培養し、37°Cで攪拌(178 rpm)しながら一晩(12-16時間)増殖させます。
3. 調製した細菌を新鮮なKm ⁺ LBブロスで1:100に希釈し、OD₆₀₀ が0.4〜0.6に達するまで2〜3時間振とうしながら37°Cでインキュベートします。
4. イソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度0.4 mMになるまで培地に加え、培養液を16°Cでさらに10時間インキュベートします。
5. したがって、IPTG誘導(10,000 × g、4°C15分)を使用して細菌を遠心分離および回収します。
6. 1 mg/mLのリゾチームを含む5 mLのLEW(溶解/平衡化/洗浄)バッファー(50 mM無水リン酸ナトリウム一塩基(NaH₂PO₄)および300 mM NaCl、pH 8.0)を使用して、細胞ペレットを再懸濁します。氷上で30分間細菌懸濁液を攪拌し、超音波ホモジナイザーを使用して完全に超音波処理する(15秒パルスと20秒オフ、15分)。
7. 粗細胞ライセートを4°C、10,000 × gで30分間遠心分離し、細胞破片を除去します。上清を事前に平衡化したカラムに移し、重力ドレナージの1〜2分前にインキュベートします。この手順を 3 回繰り返します。
8. 20 mLのLEWバッファーを使用してカラムを洗浄し、重力を使用して排出します。9 mLの溶出バッファー(50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaClおよび250 mM イミダゾール、pH 8.0)を使用してヒスチジンタグ付きAPNタンパク質を溶出し、透析チューブに回収します。
9. タンパク質溶液を炭酸ナトリウム-炭酸水素ナトリウム(PBS、135 mM NaCl、4.7 mM 塩化カリウム、2 mM NaH 2 PO₄、および10 mMリン酸ナトリウム二ナトリウム、pH_7.2)バッファー中で4°Cで一晩透析します。
10. 12.0% SDS-PAGEゲルとウェスタンブロッティングを使用して分析し、APNタンパク質の純度を評価します。
    1. 5 μgのタンパク質をゲルの各ウェルにロードし、110 Vで1.5時間稼働させます。次に、タンパク質をPVDFメンブレンに15 Vで50分間転写し、BCAアッセイを使用して精製タンパク質の濃度を決定します。

2.動物予防接種

1. 皮下(s.c)は、6〜8週齢の雌のBALB / cマウスに、50μgのAPNタンパク質またはPBS(陰性対照)を2週間に1回アジュバントと混合して注射します。初回免疫には加熱死した抗酸菌を含む完全なフロイントアジュバントを使用し、ブースター免疫には不完全なフロイントアジュバントを使用してください。等量のAPNタンパク質(またはPBS)とフロイントアジュバントまたは不完全なフロイントアジュバントをそれぞれ混合します。
2. 0.05 M PBS(pH 9.6)で希釈した5 μg/mL APNタンパク質でコーティングしたマイクロタイタープレートを使用した間接酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、これらのマウスの血清中のAPNに対する抗体価を検出します。.

3. APNに対するモノクローナル抗体を作製するハイブリドーマ技術

1. 腹腔内(i.p.)100 μgのAPNタンパク質を選択したマウスに注入し、最終的な抗原ブーストを行います。
2. 3日後、ペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg、v / v、腹腔内)と頸部脱臼を使用してマウスを安楽死させます。
3. 脾臓を採取し、DMEMで2回洗浄して血液と脂肪細胞を取り除きます。200メッシュの銅グリッドを使用して脾臓細胞懸濁液をろ過して組織破片を除去し、遠心分離(1500 × g、10分)を使用して脾臓細胞を採取して脾臓の膜を除去します。
4. 6%ウシ胎児血清(FBS)を添加した5mLのDMEMを含む25cm2フラスコにマウス骨髄腫SP2/0細胞を播種し、細胞生存率を維持するために37°C、6%^CO2雰囲気で培養した。5〜6日間の培養後、細胞は蘇生後に80%〜90%のコンフルエントに達し、増殖対数段階にあります。顕微鏡下では、細胞は丸く、明るく、透明です。
5. ハイブリダイゼーションの1日前に、既報の方法^12、19に従ってマウスの腹腔からマクロファージを採取する。
6. 腹膜マクロファージを0.1-0.2×10⁵ / mLの密度で96ウェルプレートに播種し、各ウェルには100 μLのHAT培地(10%FBSと1x HATサプリメントを添加したDMEM)を入れ、37°C、6%_CO2 加湿雰囲気で一晩インキュベートします。
7. ハイブリダイゼーションの場合は、SP2/0細胞を8〜10本のピペットで穏やかに吸引し、10 mLの無血清DMEM培地に懸濁します。細胞を新鮮なDMEMで洗浄し、遠心分離機(1500 × g、10分)を2回行った後、10 mLのDMEMに再懸濁します。
8. 定量した脾臓細胞とSP2/0細胞を10:1の比率で混合し、50 mLチューブに移します。遠心分離機(1500×g、10分)し、上清を捨てる。チューブの底にある細胞ペレットを集め、手のひらで軽くたたいて、ハイブリダイゼーションの前にペレットを緩めます。
9. ポリエチレングリコール1500(PEG 1500)1mLを加え、37°Cに予め加温し、チューブの底部を穏やかに回転させながら45秒間かけて緩めた細胞ペレットにスポイトを用いて滴下した。
10. 37°Cに予温したDMEM1 mLを上記の混合物に90秒間かけてゆっくりと加え、続いてさらに30 mLの新鮮なDMEMを加えます。融合チューブを37°Cの水浴に30分間入れます。
11. 温浴中でインキュベートした後、細胞を回収し、HAT培地に再懸濁する。その後、腹膜マクロファージを接種した96ウェルプレートで培養する。
12. 5日後、100 μLの新鮮なHAT培地を各ウェルに加え、プレートをさらに5日間インキュベートした後、培地をHT培地(DMEMに10%FBSと1x HTサプリメントを添加したもの)と交換します。
13. 0.05 M PBS(pH 9.6)で希釈した5 μg/mL APNタンパク質でコーティングしたマイクロタイタープレートを使用して、ELISAアッセイを使用してハイブリドーマ上清中のモノクローナル抗体を分析します。
    1. 96ウェルプレートのウェル内の培地が黄色に変わったら(細胞増殖と代謝産物の放出により、培地中のpHが6.8に低下し、フェノールレッドがフクシアから黄色に変わる)、または細胞クラスターが観察されたら、選択したウェルから100 μLの上清を取得し、コーティングされたELISAプレートのウェルに追加します。マイクロプレートリーダーを使用してOD450の値を測定します。
    2. APNおよび非感染マウス血清に対するポリクローナル抗体をそれぞれ陽性および陰性対照として使用し、PBSをブランク対照として使用する。本研究では、陰性対照に対するサンプルのOD450比(P/N)≥2.1が陽性選択基準として認められた。
14. 3回連続したポジティブ選択ラウンドの後、限られた希釈アッセイのためにAPNタンパク質に対する血清学的応答の増加を示すハイブリドーマを選択します。
    1. 前述のように、腹膜マクロファージとシードを96ウェルプレートで調製します。
    2. ハイブリドーマ細胞をHT培地中で1ウェル当たり平均0.5-2細胞で懸濁し、37°C、6%_CO2 インキュベーター内で培養する。ELISAイムノアッセイで示される陽性率が100%に達するまで、この手順を3〜4回繰り返します。
15. 連続凍結融解の圧力下で、抗APN抗体を安定して分泌し、正常に増殖できる陽性ハイブリドーマ細胞を選択します。
    1. 各マウスに0.3 mLのプリスタンの単回i.p.注射を投与します(8〜10週間)。手付かずの投与後10日目に、各マウスに0.5mLのPBS(pH 7.2)中の2〜5 x 10⁵ ハイブリドーマ細胞を注射する。
    2. 注射後8〜10日目にこれらのマウスの腹腔から腹水を注意深く収集する。
    3. 5,000 × gで15分間遠心分離して上清を回収し、33%飽和硫酸アンモニウム[(_NH4)2SO4]沈殿およびプロテインAアガロースを用いて上清中の抗体を精製します。

4. APNタンパク質に対するモノクローナル抗体の特性評価

1. SBAクロノタイピングシステム-HRP²⁰を使用して、収集されたモノクローナル抗体の免疫グロブリンサブタイプを決定します。SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを使用して、モノクローナル抗体の純度と特異性を評価します。
2. ELISA²¹を用いてAPNタンパク質に対するmAbエピトープ特異性を解析します。加法値(AV)は、OD mAbs(a+b)と(OD_{mAbs-a+OD mAbs-b)}の比であり、モノクローナル抗体が同じ抗原部位を認識するかどうかを評価するために使用されます。OD mAbs-aおよびOD mAbs-bはAPN単独に対する異なるモノクローナル抗体のOD450値を表し、OD_mAbs(a+b)はAPNに対する2つのモノクローナル抗体の1:1混合物のOD450値を表します。
   1. 各サンプルを少なくとも4回の反復で評価し、実験全体を少なくとも3回繰り返します。

5. APNに対するラブの発現

1. APN免疫マウスの上記のハイブリドーマ細胞および脾臓から全RNAを抽出する(例えば、TRIzol)²²。製造元の指示に従って、cDNA合成キットを使用して相補的DNA(cDNA)を合成します。
2. ネストされたPCRを使用してモノクローナル抗体の可変領域を増幅し、シーケンシングを使用して重鎖(VH)および軽鎖(VL)配列を決定します。IMGTマウスゲノム解析ツールを用いてVHおよびVLをコードする遺伝子を解析する(http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php)。
3. VH遺伝子とVL遺伝子をリーダー配列と組み合わせ、シームレスなクローニング技術を使用して、それぞれpET28a(+)およびpIRES2-ZsGreen1ベクターに順次サブクローニングして、傷のないDNAフラグメント挿入を可能にします。具体的なプライマーを 表1に記載する。
4. pET28a(+)-rAbs-APN-BL21形質転換細菌を、0.4 mM IPTG存在下、オービタルシェーカー中で37°Cで10時間増殖させます。次に、ルーチンのタンパク質精製を使用して、rAbsタンパク質の発現を誘導、精製、および評価します。
5. ウェルあたり100 μL 0.5 x 10⁵ CHO細胞を96ウェルプレートに播種し、6%_CO2 雰囲気中で37°Cで18〜24時間インキュベートします。細胞が80-90%のコンフルエントに達したら、pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APNプラスミドをOpti-MEMで最終濃度0.1 μg/μLに希釈し、室温で5分間インキュベートしてからトランスフェクションに使用します。
6. 50 μLの希釈pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APNプラスミドを1 μLのリポフェクタミン2000および49 μLのOpti-MEMと穏やかに混合し、室温でさらに20分間インキュベートします。CHO細胞を含む96ウェルプレートの各ウェルに100 μLの混合物を添加し、6%_CO2 雰囲気中37°Cで4〜6時間インキュベートします。
7. トランスフェクション後4〜6時間で、培地を10%FBSを添加したDMEM-F12培地と交換し、プレートをさらに48時間インキュベートします。次に、400 μg/mL G418を各ウェルに追加し、安定にトランスフェクトされた細胞を選択します。
8. 10%FBSおよび400 μg/mL G418を添加したDMEM-F12培地を用いて10日間選択した後、蛍光活性化細胞ソーティングにより細胞(3.0×10⁷ 細胞/mL)をソーティングします。細胞集団の約10〜15%が陽性であった。
9. 回収した陽性細胞を段階的に希釈し、96ウェルプレート中でウェル当たり平均0.5〜2細胞で播種し、37°C、6%_CO2 インキュベーター内で培養した。G418(200 μg/mL)による選択を使用して、安定にトランスフェクトされたpIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO細胞を維持します。
10. 上述の細胞培養培地中のFBS濃度は、3週間の期間にわたって対数増殖期の間に10%から0%に徐々に減少する。次いで、接着したCHO細胞を無血清培地中での懸濁増殖に適応させる。
11. 播種したpIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO細胞を無血清培地中で0.8-1.0×10⁵ 細胞/mLの密度で、振とうフラスコ中で80-110 rpmの振とう速度、37°C、6%_CO2で培養します。
12. 12時間ごとに細胞懸濁液を採取し、製造元の指示に従って細胞計数キット(CCK-8など)を使用して細胞の生存率と活力の変化を測定します。
13. 抗体発現は、細胞生存率が80%に低下し、細胞密度が10⁶ 細胞/mL×1.0〜2.0に達するとピークレベルに達します。遠心分離を用いて細胞上清を回収し、0.22 μmポリテトラフルオロエチレンメンブレンフィルターを用いてフィルターし、プロテインAアガロースを用いて精製する。
14. 間接免疫蛍光アッセイ(IFA)を用いてAPN特異的抗体の産生を確認します。
15. 抗体価および結合親和性は、前述のようにELISAアッセイを用いて決定する。²³ ソフトウェアを用いて抗体の平衡解離定数(_KD 値)を4パラメータロジスティック方程式で計算する。

結果

この研究では、精製された可溶性APNタンパク質(2.12 mg / mL)をマウスの免疫に使用しました。APNタンパク質を14日間隔で4回免疫したマウスは、血清中のAPNに対するより高い抗体価を示した。融合実験により14個のハイブリドーマが得られたが、3回の連続凍結融解サイクルを生き延びたハイブリドーマは9個のみであり、APNに対する抗体を分泌する9個の安定クローンが得られた。これらのセルはす...

ディスカッション

粘膜免疫の誘導は、病原体に対抗し、さまざまな疾患の予防と治療において最も効果的なアプローチの1つです。腸粘膜で高発現する膜結合タンパク質であるAPNは、適応免疫応答の誘導および受容体媒介性のウイルスおよび細菌のエンドサイトーシスに関与しています^1,5,8。APNは、抗原負荷およびワクチン送達の多くの形態...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Animal immunization
DAPI	Beyotime  Biotechnology	C1002	Nuclear counterstain
DMEM	Gibco	11965092	Cell culture
DMEM-F12	Gibco	12634010	Cell culture
Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody	Abbkine	A23310	Indirect immunofluorescence analysis
Enhanced Cell Counting Kit-8	Beyotime  Biotechnology	C0042	Measurement of cell viability and vitality
Fetal bovine serum	Gibco	10091	Cell culture
Geneticin Selective Antibiotic	Gibco	11811098	Selective antibiotic
GraphPad Prism 8.0 software	GraphPad	8.0	Scientific data analysis and graphing
HAT Supplement (50X)	Gibco	21060017	Cell selection
HT Supplement (100X)	Gibco	11067030	Cell selection
Incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Animal immunization
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside	Sigma-Aldrich	I5502	Protein expression
kanamycin	Beyotime  Biotechnology	ST102	Bactericidal antibiotic
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems	SP8 STED	Fluorescence imaging
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermofisher	11668019	Transfection
LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting	BD	FACS LSRFortessa	Flow cytometry
Microplate reader	BioTek	BOX 998	ELISA analysis
Micro spectrophotometer	Thermo Fisher	Nano Drop one	Nucleic acid concentration detection
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	Culture broth
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	Culture broth
Opti-MEM	Gibco	31985088	Cell culture
Polyethylene glycol 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Cell fusion
PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit	Takara Bio	RR047	qPCR
protein A agarose	Beyotime  Biotechnology	P2006	Antibody protein purification
Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns	MACHEREY-NAGEL	745120.5	Protein purification
SBA Clonotyping System-HRP	Southern Biotech	May-00	Isotyping of mouse monoclonal antibodies
Seamless Cloning Kit	Beyotime  Biotechnology	D7010S	Construction of plasmids
Shake flasks	Beyotime  Biotechnology	E3285	Cell culture
Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer	Beyotime  Biotechnology	C0221A	Cell culture
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	170-3940	Western blot
Tryptone	Oxoid	LP0042	Culture broth
Ultrasonic Homogenizer	Ningbo Xinzhi Biotechnology	JY92-IIN	Sample homogenization
Yeast extract	Oxoid	LP0021	Culture broth
96-well microplate	Corning	3599	Cell culture