猪肠粘膜上皮中靶向氨基肽酶N的单克隆抗体的生产

摘要

pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO细胞表达的重组抗体蛋白和采用传统杂交瘤技术生产的单克隆抗体可以识别并与猪氨基肽酶N（APN）蛋白结合。

摘要

猪氨基肽酶N（APN）是一种大量存在于小肠粘膜中的膜结合金属肽酶，可以启动粘膜免疫反应，而不会受到任何干扰，例如低蛋白表达，酶缺乏活性或结构变化。这使得APN成为选择性靶向粘膜上皮的疫苗开发的一个有吸引力的候选者。先前的研究表明，APN是产肠毒素 大 肠杆菌（大肠杆菌）F4和传染性胃肠炎病毒的受体蛋白。因此，APN在开发基于APN特异性抗体的抗体-药物偶联物或新型疫苗方面显示出前景。在这项研究中，我们比较了使用传统杂交瘤技术和重组抗体表达方法生产的APN特异性单克隆抗体（mAb）。我们还使用pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN和含有pET28a （+）-rAbs-APN载体的大 肠杆菌 表达BL21（DE3）菌株建立了稳定转染的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系。结果表明，在pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO细胞中表达的抗体以及使用杂交瘤产生的mAb可以识别并与APN蛋白结合。这为进一步阐明APN受体功能提供了基础，以开发针对不同APN特异性表位的疗法。

引言

氨基肽酶 N （APN） 是一种属于金属蛋白酶 M1 家族的月光酶，通过酶依赖性和酶依赖性途径充当肿瘤标志物、受体和信号分子^1，2。APN除了裂解各种生物活性肽的N端氨基酸残基以调节其生物活性外，在各种炎症性疾病的发病机制中起着重要作用。APN 通过与主要组织相容性复合物 II 类分子^2，3 紧密结合的修剪肽参与抗原加工和呈递。APN 还通过与参与多种信号转导的 G 蛋白偶联受体结合、调节细胞因子分泌以及促进免疫应答中 Fc γ 受体介导的吞噬作用来发挥抗炎作用⁴，⁵，^6，7。

作为一种广泛分布的膜结合外切肽酶，APN在猪小肠粘膜中含量丰富，与受体介导的内^吞作用1，^5，8密切相关。APN识别并结合传染性胃肠炎病毒的刺突蛋白进入细胞，并直接与产肠毒素大肠杆菌F4菌毛的FaeG亚基相互作用，影响细菌与^{宿主细胞9}，^10，11的粘附。因此，APN是治疗病毒和细菌传染病的潜在治疗靶点。

自1975年开发杂交瘤技术和其他单克隆抗体（mAb）生产策略以来，mAb已广泛用于免疫治疗、药物递送和诊断¹²，^13，14。目前，mAb已成功用于治疗癌症、炎症性肠病和多发性硬化症等疾病^12，15。由于其强大的亲和力和特异性，mAb可以成为抗体-药物偶联物（ADC）或新疫苗开发的理想靶标^16，17。APN蛋白对于选择性地将抗原递送到特定细胞至关重要，并且可以引发针对病原体的特异性和强大的粘膜免疫反应，而不会受到任何干扰，包括低蛋白表达，酶无活性或^{结构变化5}，^8，18。因此，基于APN特异性单克隆抗体的治疗产品有望对抗细菌和病毒感染。在这项研究中，我们描述了使用杂交瘤技术生产APN特异性mAb，以及使用原核和真核载体表达抗APN重组抗体（rAb）。结果表明，pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO细胞和杂交瘤衍生的mAb均能识别APN蛋白。

研究方案

本研究中的所有动物实验均获得扬州大学机构动物护理和使用委员会（SYXK20200041）的批准。

1.猪APN蛋白抗原的制备

注意:pET28a （+）-APN-BL21 （DE3） 菌株和 APN 稳定表达的细胞 pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 是在先前的研究¹¹ 中构建的。

1. 从冷冻甘油原液中回收细菌，并划线到含有 50 μg/mL 卡那霉素 （Km⁺） 的 Luria-Bertani （LB） 平板上进行单菌落分离。
2. 从新鲜条纹的平板中选择一个菌落，在补充有Km⁺ （50μg/ mL）的4mLLB培养基（10g / L胰蛋白胨，10g / L氯化钠（NaCl）和5g / L酵母提取物，pH 7.2）中培养，并在37°C下搅拌（178rpm）生长过夜（12-16小时）。
3. 在新鲜的Km⁺ LB肉汤中以1:100稀释制备的细菌，并在37°C下振荡孵育2-3小时，直到OD₆₀₀ 达到0.4-0.6。
4. 向培养基中加入异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.4mM，并将培养物在16°C下再孵育10小时。
5. 因此，使用IPTG诱导（10，000×g，4°C15分钟）离心并收获细菌。
6. 使用含有 5 mL 的 LEW（裂解/平衡/洗涤）缓冲液（50 mM 无水磷酸二氢钠 （NaH₂PO₄） 和 300 mM NaCl，pH 8.0）重悬细胞沉淀，含有 1 mg/mL 溶菌酶。将细菌悬浮液在冰上搅拌30分钟，并使用超声均质器完全超声处理（15秒脉冲和20秒关闭，15分钟）。
7. 将粗细胞裂解物在4°C和10，000×g下离心30分钟以除去细胞碎片。将上清液转移到预平衡柱中，并在重力引流前孵育1-2分钟。重复此步骤三次。
8. 使用 20 mL LEW 缓冲液洗涤色谱柱，并用重力沥干。使用 9 mL 洗脱缓冲液（50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl 和 250 mM 咪唑，pH 8.0）洗脱组氨酸标记的 APN 蛋白并收集到透析管中。
9. 将蛋白质溶液在碳酸钠 - 碳酸氢钠（PBS，135mM NaCl，4.7mM氯化钾，2mM_NaH2 PO₄和10mM十二水合磷酸钠二元，pH 7.2）缓冲液中透析过夜。
10. 使用 12.0% SDS-PAGE 凝胶和蛋白质印迹进行分析，以评估 APN 蛋白的纯度。
    1. 将5μg蛋白质加载到凝胶的每个孔中，并在110V下运行1.5小时。然后，在15V下将蛋白质转移到PVDF膜上50分钟.使用BCA测定法确定纯化蛋白质的浓度。

2. 动物免疫

1. 皮下（皮下）注射雌性BALB / c小鼠，6-8周龄，每2周一次，用50μgAPN蛋白或PBS（阴性对照）与佐剂混合一次。使用含有热杀灭分枝杆菌的完整弗氏佐剂进行初始免疫接种，并使用不完全弗氏佐剂进行加强免疫。分别混合等体积的APN蛋白（或PBS）和弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。
2. 使用涂有 5 μg/mL APN 蛋白的微量滴定板，通过间接酶联免疫吸附测定 （ELISA） 检测这些小鼠血清中针对 APN 的抗体滴度，该蛋白涂有 5 μg/mL APN 蛋白，稀释在 0.05 M PBS （pH 9.6）。.

3. 杂交瘤技术生产APN单克隆抗体

1. 腹膜内（ip）将100μgAPN蛋白注射到选定的小鼠中以进行最终抗原增强。
2. 三天后，使用戊巴比妥钠（50mg / kg，v / v，腹膜内）和颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
3. 收集脾脏，并用DMEM清洗两次以去除血液和脂肪细胞。使用200目铜网格过滤脾细胞悬液以去除组织碎片，并使用离心（1500×g，10分钟）收获脾细胞以去除脾脏膜。
4. 将小鼠骨髓瘤SP2 / 0细胞接种在含有5mL补充有6%胎牛血清（FBS）的DMEM的25cm 2烧瓶中，并在37°C，6%CO₂气氛下培养以维持细胞活力。培养5-6天后，复苏后细胞达到80%-90%汇合，处于生长对数期。在显微镜下，细胞是圆形、明亮和透明的。
5. 杂交前一天，根据先前发表的方法^12，19从小鼠腹膜腔收集巨噬细胞。
6. 在 96 孔板中以 0.1-0.2 × 10⁵/mL 的密度接种腹膜巨噬细胞，每个孔含有 100 μL HAT 培养基（DMEM 补充有 10% FBS 和 1x HAT 补充剂），并在 37 °C、6% CO₂ 加湿气氛中孵育过夜。
7. 对于杂交，用移液管从 8-10 瓶中轻轻吸出 SP2/0 细胞，并悬浮在 10 mL 无血清 DMEM 培养基中。用新鲜DMEM洗涤细胞，离心（1500×g，10分钟）两次，然后重新悬浮在10mL的DMEM中。
8. 将定量的脾脏细胞与SP2 / 0细胞以10:1的比例混合，并转移到50 mL管中。离心（1500×g，10分钟）并弃去上清液。收集管底部的细胞沉淀，并在杂交前用手掌敲击以松开沉淀。
9. 加入1mL聚乙二醇1500（PEG 1500），预热至37°C，在45秒的时间内使用滴管滴加到松散的细胞沉淀中，同时轻轻旋转管的底部。
10. 在90秒的时间内缓慢加入1mL预热至37°C的DMEM到上述混合物中，然后再加入30mL新鲜DMEM。将融合管放入37°C水浴中30分钟。
11. 在温水浴中孵育后，收获细胞并重新悬浮在HAT培养基中。然后在接种有腹膜巨噬细胞的 96 孔板中培养。
12. 5 天后，向每个孔中加入 100 μL 新鲜 HAT 培养基，并将板再孵育 5 天，然后用 HT 培养基替换培养基（DMEM 补充有 10% FBS 和 1x HT 补充剂）。
13. 使用涂有 5 μg/mL APN 蛋白的微量滴定板，在 0.05 M PBS （pH 9.6） 中稀释，使用 ELISA 测定法分析杂交瘤上清液中的单克隆抗体。
    1. 当96孔板孔中的培养基变黄（由于细胞生长和代谢物释放，培养基中的pH降至6.8，酚红从紫红色变为黄色）或观察到细胞簇时，从所选孔中获取100μL上清液并添加到包被的ELISA板的孔中。使用酶标仪测量OD 450值。
    2. 分别使用针对APN和未感染小鼠血清的多克隆抗体作为阳性和阴性对照，并使用PBS作为空白对照。在这项研究中，OD450与阴性对照（P / N）≥2.1的比率被认为是阳性选择标准。
14. 连续三轮阳性选择后，选择对APN蛋白的血清学反应增加的杂交瘤进行有限的稀释测定。
    1. 如前所述，在96孔板中制备腹膜巨噬细胞和种子。
    2. 将杂交瘤细胞悬浮在HT培养基中，平均每孔0.5-2个细胞，并在37°C，6%CO₂ 培养箱中培养。重复此步骤三到四次，直到ELISA免疫测定指示的阳性率达到100%。
15. 在连续冻融的压力下，选择能够稳定分泌抗APN抗体并正常增殖的阳性杂交瘤细胞。
    1. 向每只小鼠单次腹腔注射0.3mL原始烷（8-10周）。在接受原始药物后10天，将每只小鼠注射2-5 x 10⁵ 杂交瘤细胞在0.5mL PBS（pH 7.2）中。
    2. 注射后8至10天小心地从这些小鼠的腹膜腔收集腹膜液。
    3. 通过以5，000×g离心15分钟收获上清液，并使用33%饱和硫酸铵[（NH₄）₂SO₄]沉淀和蛋白A琼脂糖纯化上清液中的抗体。

4. 单克隆抗体对APN蛋白的表征

1. 使用 SBA 克隆分型系统 HRP²⁰ 确定所收集 mAb 的免疫球蛋白亚型。使用SDS-PAGE和蛋白质印迹法评估mAb纯度和特异性。
2. 使用 ELISA²¹ 分析 mAb 表位对 APN 蛋白的特异性。添加剂值（AV）是OD mAbs（a+b）与（OD mAbs-a+OD_mAbs-b）的比值，用于评估_mAb是否识别相同的抗原位点;OD_mAbs-a 和 OD_mAbs-b 代表单独针对 APN 的不同单克隆抗体的 OD450 值，OD mAb_{（a+b） 代表两种 mAb} 针对 APN 的 1:1 混合物的 OD450 值。
   1. 评估每个样品至少四次重复，并重复整个实验至少三次。

5. rAbs对APN的表达

1. 从上述APN免疫小鼠（例如TRIzol）的杂交瘤细胞和脾脏中提取总^RNA22。按照制造商的说明使用 cDNA 合成试剂盒合成互补 DNA （cDNA）。
2. 使用嵌套PCR扩增mAb的可变区域，并使用测序确定重链（VH）和轻链（VL）序列。使用IMGT小鼠基因组分析工具（http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php）分析编码VH和VL的基因。
3. 使用无缝克隆技术将VH和VL基因与前导序列结合，并分别将它们顺序亚克隆到pET28a （+）和pIRES2-ZsGreen1载体中，以实现无疤痕DNA片段插入。具体引物列于 表1。
4. 在37°C的轨道振荡器中以0.4mM IPTG存在下培养pET28a（+）-rAbs-APN-BL21转化的细菌10小时。然后使用常规蛋白质纯化诱导、纯化和评估 rAbs 蛋白的表达。
5. 将每孔100μL 0.5 x 10⁵ CHO细胞接种到96孔板中，并在37°C下在6%CO₂ 气氛中孵育18-24小时。当细胞达到80-90%汇合时，用Opti-MEM稀释pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN质粒至终浓度0.1μg/μL，并在室温下孵育5分钟，然后用于转染。
6. 将 50 μL 稀释的 pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN 质粒与 1 μL 脂质胺 2000 和 49 μL Opti-MEM 轻轻混合，并将混合物在室温下再孵育 20 分钟。向含有CHO细胞的96孔板的每个孔中加入100μL混合物，并在37°C下在6%CO₂ 气氛中孵育4-6小时。
7. 在转染后4-6小时，用补充有10%FBS的DMEM-F12培养基替换培养基，并将板再孵育48小时。然后，向每个孔中加入400μg/ mL G418以选择稳定转染的细胞。
8. 使用补充有 10% FBS 和 400 μg/mL G418 的 DMEM-F12 培养基选择 10 天后，通过荧光激活细胞分选对细胞 （3.0 × 10⁷ 个细胞/mL） 进行分选。大约10-15%的细胞群是阳性的。
9. 连续稀释收获的阳性细胞，在96孔板中平均每孔接种0.5-2个细胞，并在37°C，6%CO₂ 培养箱中培养。使用G418（200μg/ mL）选择保持稳定转染的pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO细胞。
10. 在3周的时间内，上述细胞培养基中的FBS浓度在对数生长期从10%逐渐降低到0%。然后，使贴壁CHO细胞适应无血清培养基中的悬浮生长。
11. 在无血清培养基中以0.8-1.0×10 5个细胞/mL的密度在无血清培养基中以0.8-1.010⁵ 个细胞/mL的密度以80-110rpm振荡速度和37°C，6%CO₂培养接种的pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO细胞。
12. 根据制造商的说明，每12小时收集一次细胞悬液，以确定细胞计数试剂盒（例如CCK-8）的细胞活力和活力的变化。
13. 当细胞活力降至80%且细胞密度达到1.0-2.0×10⁶ 个细胞/mL时，抗体表达达到峰值水平。使用离心收获细胞上清液，使用0.22μm聚四氟乙烯膜过滤器过滤，并使用蛋白A琼脂糖纯化。
14. 使用间接免疫荧光测定 （IFA） 确认 APN 特异性抗体的产生。
15. 如前所述，使用ELISA测定法测定抗体滴度和结合亲和力。²³ 使用软件用四参数逻辑方程计算抗体的平衡解离常数（K_D 值）。

结果

在本研究中，纯化的可溶性APN蛋白（2.12 mg / mL）用于小鼠免疫。每隔14天接种APN蛋白四次的小鼠在其血清中表现出更高的APN抗体滴度。尽管使用融合实验获得了14个杂交瘤，但只有9个杂交瘤在三个连续冻融循环中幸存下来，从而产生了9个分泌APN抗体的稳定克隆。所有这些细胞都是圆形、明亮和透明的（图1）。经SDS-PAGE确认纯化的mAb具有重链和轻链（分别为50 kDa和25 kDa），并?...

讨论

诱导粘膜免疫是对抗病原体和预防和治疗各种疾病的最有效方法之一。APN是肠粘膜中一种高表达的膜结合蛋白，参与诱导适应性免疫反应和受体介导的病毒和细菌内吞作用¹，^5，8。APN 在多种形式的抗原加载和疫苗递送中用作抗原颗粒。口服APN靶向抗体也可以引发有效的免疫反应¹⁸，²⁴

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Animal immunization
DAPI	Beyotime  Biotechnology	C1002	Nuclear counterstain
DMEM	Gibco	11965092	Cell culture
DMEM-F12	Gibco	12634010	Cell culture
Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody	Abbkine	A23310	Indirect immunofluorescence analysis
Enhanced Cell Counting Kit-8	Beyotime  Biotechnology	C0042	Measurement of cell viability and vitality
Fetal bovine serum	Gibco	10091	Cell culture
Geneticin Selective Antibiotic	Gibco	11811098	Selective antibiotic
GraphPad Prism 8.0 software	GraphPad	8.0	Scientific data analysis and graphing
HAT Supplement (50X)	Gibco	21060017	Cell selection
HT Supplement (100X)	Gibco	11067030	Cell selection
Incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Animal immunization
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside	Sigma-Aldrich	I5502	Protein expression
kanamycin	Beyotime  Biotechnology	ST102	Bactericidal antibiotic
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems	SP8 STED	Fluorescence imaging
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermofisher	11668019	Transfection
LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting	BD	FACS LSRFortessa	Flow cytometry
Microplate reader	BioTek	BOX 998	ELISA analysis
Micro spectrophotometer	Thermo Fisher	Nano Drop one	Nucleic acid concentration detection
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	Culture broth
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	Culture broth
Opti-MEM	Gibco	31985088	Cell culture
Polyethylene glycol 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Cell fusion
PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit	Takara Bio	RR047	qPCR
protein A agarose	Beyotime  Biotechnology	P2006	Antibody protein purification
Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns	MACHEREY-NAGEL	745120.5	Protein purification
SBA Clonotyping System-HRP	Southern Biotech	May-00	Isotyping of mouse monoclonal antibodies
Seamless Cloning Kit	Beyotime  Biotechnology	D7010S	Construction of plasmids
Shake flasks	Beyotime  Biotechnology	E3285	Cell culture
Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer	Beyotime  Biotechnology	C0221A	Cell culture
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	170-3940	Western blot
Tryptone	Oxoid	LP0042	Culture broth
Ultrasonic Homogenizer	Ningbo Xinzhi Biotechnology	JY92-IIN	Sample homogenization
Yeast extract	Oxoid	LP0021	Culture broth
96-well microplate	Corning	3599	Cell culture