돼지 장 점막 상피에서 아미노펩티다아제 N을 표적으로 하는 단클론 항체 생산

요약

pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO 세포에서 발현되는 재조합 항체 단백질과 전통적인 하이브리도마 기술을 사용하여 생산된 단클론 항체는 돼지 아미노펩티다아제 N(APN) 단백질을 인식하고 결합할 수 있습니다.

초록

소장 점막에 풍부하게 존재하는 막 결합 메탈로펩티다아제인 돼지 아미노펩티다아제 N(APN)은 낮은 단백질 발현, 효소 비활성 또는 구조적 변화와 같은 간섭 없이 점막 면역 반응을 시작할 수 있습니다. 따라서 APN은 점막 상피를 선택적으로 표적으로 하는 백신 개발에서 매력적인 후보가 됩니다. 이전 연구에서는 APN이 장독소성 대장균 (E. coli) F4와 전염성 위장염 바이러스 모두에 대한 수용체 단백질임을 보여주었습니다. 따라서 APN은 APN 특이적 항체를 기반으로 하는 항체-약물 접합체 또는 새로운 백신 개발에 대한 가능성을 보여줍니다. 본 연구에서는 전통적인 하이브리도마 기술과 재조합 항체 발현 방법을 이용한 APN 특이적 단일클론항체(mAb)의 생산을 비교하였다. 우리는 또한 pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN 및 pET28a(+)-rAbs-APN 벡터를 보유하는 대장균 발현 BL21(DE3) 균 주를 사용하여 안정적으로 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주를 확립했습니다. 상기 결과는 하이브리도마를 사용하여 생산된 pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO 세포 및 mAbs에서 발현된 항체가 APN 단백질을 인식하고 결합할 수 있음을 보여줍니다. 이는 다양한 APN 특이적 에피토프를 표적으로 하는 치료제 개발을 위한 APN 수용체 기능의 추가 설명의 기초를 제공합니다.

서문

메탈로프로테이나제 M1 계열에 속하는 달빛 효소인 아미노펩티다아제 N(APN)은 효소 의존성 및 효소 비의존성 경로를 통해 종양 표지자, 수용체 및 신호 분자로 작용합니다 ^1,2. APN은 생물학적 활성을 조절하기 위해 다양한 생리활성 펩타이드의 N-말단 아미노산 잔기를 절단하는 것 외에도 다양한 염증성 질환의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. APN은 주요 조직 적합성 복합체 클래스 II 분자 ^2,3에 밀접하게 결합하는 절제된 펩타이드에 의한 항원 처리 및 제시에 참여합니다. APN은 또한 다중 신호 전달에 참여하는 G 단백질 결합 수용체와 결합하여 사이토카인 분비를 조절하고 면역 반응에서 Fc 감마 수용체 매개 식균 작용에 기여함으로써 항염증 효과를 발휘합니다 4,5,6,7.

널리 분포된 막 결합 엑소펩티....

프로토콜

본 연구의 모든 동물 실험은 양저우 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(SYXK20200041)의 승인을 받았습니다.

1. 돼지 APN 단백질 항원의 제조

참고: pET28a(+)-APN-BL21(DE3) 균주와 APN이 안정적으로 발현된 세포인 pEGFP-C1-APN-IPEC-J2를 이전 연구¹¹에서 구성하였다.

1. 냉동 글리세롤 스톡에서 박테리아를 회수하고 단일 집락 분리를 위해 50μg/mL 카나마이신(Km⁺)이 포함된 Luria-Bertani(LB) 플레이트에 줄무늬를 붙입니다.
2. 갓 줄무늬가 있는 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 Km⁺ (50μg/mL)가 보충된 LB 배지(10g/L 트립톤, 10g/L 염화나트륨(NaCl) 및 5g/L 효모 추출물, pH 7.2) 4mL에서 배양하고 37°C에서 교반(178rpm)하여 밤새(12-16시간) 성장하도록 둡니다.
3. 준비된 박테리아를 신선한 Km⁺ LB 배지에 1:100으로 희석하고 OD₃₇ 이 2-3에 도달할 때까지 0.4-0.6시간 동안 진탕하면서 0.4°C에서 배양....

결과

이 연구에서는 정제된 가용성 APN 단백질(2.12mg/mL)을 마우스 면역에 사용했습니다. APN 단백질로 14일 간격으로 4회 면역화된 마우스는 혈청에서 APN에 대해 더 높은 항체 역가를 나타냈다. 융합 실험을 사용하여 14개의 하이브리도마를 얻었지만, 3개의 연속 동결-해동 주기에서 9개의 하이브리도마만이 살아남았고, 그 결과 APN에 대한 항체를 분비하는 9개의 안정적인 클론이 생성되었습니다. 이 모든 ?.......

토론

점막 면역의 유도는 병원체에 대항하고 다양한 질병의 예방 및 치료에 가장 효과적인 접근법 중 하나입니다. 장 점막에서 고도로 발현되는 막 결합 단백질인 APN은 적응 면역 반응의 유도와 수용체 매개 바이러스 및 박테리아 엔도사이토시스에 관여한다 ^1,5,8. APN은 다양한 형태의 항원 로딩 및 백신 전달에서 항원 미립자로 사?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Animal immunization
DAPI	Beyotime  Biotechnology	C1002	Nuclear counterstain
DMEM	Gibco	11965092	Cell culture
DMEM-F12	Gibco	12634010	Cell culture
Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody	Abbkine	A23310	Indirect immunofluorescence analysis
Enhanced Cell Counting Kit-8	Beyotime  Biotechnology	C0042	Measurement of cell viability and vitality
Fetal bovine serum	Gibco	10091	Cell culture
Geneticin™ Selective Antibiotic	Gibco	11811098	Selective antibiotic
HAT Supplement (50X)	Gibco	21060017	Cell selection
HT Supplement (100X)	Gibco	11067030	Cell selection
Incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Animal immunization
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside	Sigma-Aldrich	I5502	Protein expression
kanamycin	Beyotime  Biotechnology	ST102	Bactericidal antibiotic
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems	SP8 STED	Fluorescence imaging
Lipofectamine® 2000 Reagent	Thermofisher	11668019	Transfection
LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting	BD	FACS LSRFortessa	Flow cytometry
Microplate reader	BioTek	BOX 998	ELISA analysis
Micro spectrophotometer	Thermo Fisher	Nano Drop one	Nucleic acid concentration detection
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	Culture broth
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	Culture broth
Opti-MEM	Gibco	31985088	Cell culture
Polyethylene glycol 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Cell fusion
PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit	Takara Bio	RR047	qPCR
protein A agarose	Beyotime  Biotechnology	P2006	Antibody protein purification
Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns	MACHEREY-NAGEL	745120.5	Protein purification
SBA Clonotyping System-HRP	Southern Biotech	May-00	Isotyping of mouse monoclonal antibodies
Seamless Cloning Kit	Beyotime  Biotechnology	D7010S	Construction of plasmids
Shake flasks	Beyotime  Biotechnology	E3285	Cell culture
Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer	Beyotime  Biotechnology	C0221A	Cell culture
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	170-3940	Western blot
Tryptone	Oxoid	LP0042	Culture broth
Ultrasonic Homogenizer	Ningbo Xinzhi Biotechnology	JY92-IIN	Sample homogenization
Yeast extract	Oxoid	LP0021	Culture broth
96-well microplate	Corning	3599	Cell culture