JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Белок рекомбинантных антител, экспрессируемый в клетках pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO, и моноклональные антитела, полученные с использованием традиционной гибридомной технологии, могут распознавать и связываться с белком N-аминопептидазы свиней (APN).

Аннотация

Свиная аминопептидаза N (APN), связанная с мембраной металлопептидаза, в изобилии присутствующая в слизистой оболочке тонкой кишки, может инициировать иммунный ответ слизистой оболочки без каких-либо помех, таких как низкая экспрессия белка, неактивность ферментов или структурные изменения. Это делает APN привлекательным кандидатом при разработке вакцин, которые избирательно нацелены на эпителий слизистой оболочки. Предыдущие исследования показали, что APN является рецепторным белком как для энтеротоксигенной Escherichia coli (E. coli) F4, так и для трансмиссивного вируса гастроэнтерита. Таким образом, APN показывает перспективность в разработке конъюгатов антитело-лекарственное средство или новых вакцин на основе APN-специфических антител. В этом исследовании мы сравнили продукцию APN-специфических моноклональных антител (mAb) с использованием традиционной гибридомной технологии и метода экспрессии рекомбинантных антител. Мы также создали стабильно трансфицированную клеточную линию яичников китайского хомяка (CHO) с использованием pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN и штамма экспрессии E. coli BL21 (DE3), содержащего вектор pET28a (+)-rAbs-APN. Результаты показывают, что антитела, экспрессируемые в клетках pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO и mAb, продуцированных с использованием гибридом, могут распознавать и связываться с белком APN. Это обеспечивает основу для дальнейшего выяснения функции рецептора APN для разработки терапевтических средств, нацеленных на различные APN-специфические эпитопы.

Введение

Аминопептидаза N (APN), фермент подработки, принадлежащий к семейству металлопротеиназ M1, действует как онкомаркер, рецептор и сигнальная молекула через ферментозависимые и ферментнезависимые пути 1,2. Помимо расщепления N-концевых аминокислотных остатков различных биологически активных пептидов для регуляции их биологической активности, АПН играет важную роль в патогенезе различных воспалительных заболеваний. APN участвует в процессинге и презентации антигена обрезанными пептидами, которые плотно связываются с основными молекулами комплекса гистосовместимости II класса 2,3. APN также оказывает противовоспалительное действие, связываясь с рецепторами, связанными с G-белком, участвующими в множественной передаче сигнала, модулирующими секрецию цитокинов и способствующими фагоцитозу, опосредованному гамма-рецептором Fc в иммунном ответе 4,5,6,7.

Как широко распространенная мембраносвязанная экзопептидаза, APN в изобилии присутствует в слизистой оболочке тонкой кишки свиньи и тесно связана с рецептор-опосредованным эндоцитозом 1,5,8. APN распознает и связывает спайковый белок трансмиссивного вируса гастроэнтерита для проникновения в клетки и напрямую взаимодействует с субъединицей FaeG энтеротоксигенных фимбрий Escherichia coli F4, влияя на бактериальную адгезию с клетками-хозяевами 9,10,11. Таким образом, АПН является потенциальной терапевтической мишенью при лечении вирусных и бактериальных инфекционных заболеваний.

С момента разработки гибридомной технологии и других стратегий производства моноклональных антител (mAb) в 1975 году мАТ широко используются в иммунотерапии, доставке лекарств и диагностике12,13,14. В настоящее время мАТ успешно используются для лечения таких заболеваний, как рак, воспалительные заболевания кишечника и рассеянный склероз12,15. Из-за их сильного сродства и специфичности мАТ могут быть идеальными мишенями при разработке конъюгатов антитело-лекарственное средство (АЦП) или новых вакцин16,17. Белок APN имеет решающее значение для селективной доставки антигенов в определенные клетки и может вызывать специфический и сильный иммунный ответ слизистой оболочки против патогенов без какого-либо вмешательства, включая низкую экспрессию белка, неактивность ферментов или структурные изменения 5,8,18. Таким образом, терапевтические продукты на основе APN-специфических мАТ показывают многообещающие результаты против бактериальных и вирусных инфекций. В этом исследовании мы описываем продукцию APN-специфических mAb с использованием гибридомной технологии и экспрессию анти-APN-рекомбинантных антител (rAb) с использованием прокариотических и эукариотических векторов. Результат указывает на то, что белок APN был распознан как rAb, экспрессируемыми в клетках pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO, так и mAb, полученными из гибридомы.

протокол

Все эксперименты на животных в этом исследовании были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Янчжоу (SYXK20200041).

1. Получение антигена белка APN свиньи

ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) и стабильно экспрессируемые клетки APN pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 были построены в предыдущем исследовании11.

  1. Извлеките бактерии из замороженного глицерина и нанесите на пластины Лурия-Бертани (LB), содержащие 50 мкг/мл канамицина (Km+) для выделения одной колонии.
  2. Выберите одну колонию из свежепрожилочной пластины, культивируйте в 4 мл среды LB (10 г / л триптона, 10 г / л хлорида натрия (NaCl) и 5 г / л дрожжевого экстракта, pH 7,2) с добавлением Km + (50 мкг / мл) и оставьте расти на ночь (12-16 часов) при перемешивании (178 об/мин) при 37 ° C.
  3. Разведите приготовленные бактерии в соотношении 1:100 в свежем бульоне Km+ LB и инкубируйте при 37 °C при встряхивании в течение 2-3 ч, пока OD600 не достигнет 0,4-0,6.
  4. Добавляют изопропил β-d-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в среду до конечной концентрации 0,4 мМ и инкубируют культуры еще 10 ч при 16 °C.
  5. Следовательно, центрифугируют и собирают бактерии с помощью индукции IPTG (10 000 × г, 4 ° C 15 мин).
  6. Ресуспендируют клеточную гранулу, используя 5 мл буфера LEW (лизис/уравновешивание/промывка) (50 мМ безводного одноосновного фосфата натрия (2PO4) и 300 мМ NaCl, pH 8,0), содержащего 1 мг / мл лизоцима. Перемешайте бактериальную суспензию в течение 30 минут на льду и полностью обработайте ультразвуком (импульс 15 с и выключение 20 с, 15 минут) с использованием ультразвукового гомогенизатора.
  7. Центрифугируют сырой клеточный лизат при 4 °C и 10 000 × г в течение 30 мин для удаления клеточного мусора. Переложить надосадочную жидкость в предварительно уравновешенную колонну и инкубировать 1-2 мин до самотечного дренажа. Повторите этот шаг три раза.
  8. Промойте колонку, используя 20 мл буфера LEW, и слейте воду под действием силы тяжести. Разбавьте белок APN, меченный гистидином, используя 9 мл элюирующего буфера (50 мМ2PO4, 300 мМ NaCl и 250 мМ имидазола, pH 8,0) и соберите в диализную трубку.
  9. Диализируйте белковый раствор в течение ночи при 4 ° C в буфере карбонат натрия-бикарбонат натрия (PBS, 135 мМ NaCl, 4,7 мМ хлорид калия, 2 мМ 2 PO4 и 10 мМ додекагидрат двуосновного фосфата натрия, рН7,2).
  10. Проведите анализ с использованием 12,0% геля SDS-PAGE и вестерн-блоттинга для оценки чистоты белка APN.
    1. Загрузите по 5 мкг белка в каждую лунку геля и дайте поработать при напряжении 110 В в течение 1,5 ч. Затем перенесите белок на мембрану PVDF в течение 50 мин при 15 В. Определите концентрацию очищенного белка с помощью анализа BCA.

2. Иммунизация животных

  1. Подкожно (s.c) вводят самкам мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель 50 мкг белка APN или PBS (отрицательный контроль) один раз в 2 недели. Используйте полный адъювант Фройнда, который содержит убитые теплом микобактерии для первоначальной иммунизации, и неполный адъювант Фройнда для бустерной иммунизации. Смешайте равные объемы белка APN (или PBS) и адъюванта Фройнда или неполного адъюванта Фройнда соответственно.
  2. Определите титры антител против APN в сыворотках этих мышей с помощью непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием микротитровальной пластины, покрытой белком APN 5 мкг/мл, разбавленным в 0,05 М PBS (рН 9,6). .

3. Гибридомная технология получения моноклональных антител против APN

  1. Внутрибрюшинно (внутривенно) вводят 100 мкг белка APN выбранным мышам для окончательного повышения антигена.
  2. Через три дня усыпляют мышей с помощью пентобарбитала натрия (50 мг / кг, об./об., внутрибрюшинно) и вывиха шейки матки.
  3. Соберите селезенку и дважды промойте DMEM, чтобы удалить кровь и жировые клетки. Отфильтруйте суспензию клеток селезенки с помощью медной сетки 200 меш для удаления тканевого мусора и соберите клетки селезенки с помощью центрифугирования (1500 × г, 10 мин) для удаления мембраны селезенки.
  4. Семенные клетки миеломы мыши SP2/0 в колбе размером 25см2 , содержащей 5 мл DMEM с добавлением 6% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и культуры при 37 °C, 6% атмосфере CO2 для поддержания жизнеспособности клеток. После 5-6 дней культивирования клетки достигают 80-90% слияния после реанимации и находятся в фазе логарифма роста. Под микроскопом клетки получаются круглыми, яркими и четкими.
  5. За сутки до гибридизации собирают макрофаги из брюшных полостей мышей по ранее опубликованному методу12,19.
  6. Семенные перитонеальные макрофаги плотностью 0,1-0,2 × 105 / мл в 96-луночных планшетах, каждая лунка содержит 100 мкл среды HAT (DMEM с добавлением 10% FBS и 1x добавки HAT), и инкубируют при 37 ° C, 6% CO2 увлажненной атмосфере в течение ночи.
  7. Для гибридизации аккуратно аспирируют клетки SP2/0 пипеткой из 8-10 флаконов и суспендируют в 10 мл безсывороточной среды DMEM. Промойте клетки свежим DMEM, центрифугой (1500 × г, 10 мин) дважды, а затем повторно суспендируйте в 10 мл DMEM.
  8. Смешайте количественно выраженные клетки селезенки с клетками SP2/0 в соотношении 10:1 и перенесите в пробирки объемом 50 мл. Центрифугу (1500 × г, 10 мин) и выбросьте надосадочную жидкость. Соберите гранулы клеток на дне пробирок и постучите ладонью, чтобы ослабить гранулы перед гибридизацией.
  9. Добавьте 1 мл полиэтиленгликоля 1500 (ПЭГ 1500), предварительно нагретого до 37 °C, по каплям с помощью пипетки к разрыхленной грануле ячейки в течение 45 с, осторожно вращая дно пробирки.
  10. Медленно добавьте 1 мл предварительно нагретого до 37 ° C DMEM в вышеуказанную смесь в течение 90 с, а затем еще 30 мл свежего DMEM. Поместите термосварную трубку на водяную баню с температурой 37 °C на 30 минут.
  11. После инкубации в теплой ванне заготавливают ячейки и повторно суспендируют в среде HAT. Затем посев в 96-луночную пластину инокулируют перитонеальными макрофагами.
  12. Через пять дней добавьте 100 мкл свежей среды HAT в каждую лунку и инкубируйте пластину еще 5 дней, после чего замените среду средой HT (DMEM с добавлением 10% FBS и 1x добавки HT).
  13. Используйте микротитровальную пластину, покрытую белком APN 5 мкг/мл, разбавленным в 0,05 М PBS (рН 9,6), для анализа моноклональных антител в надосадочной жидкости гибридомы с помощью анализа ИФА.
    1. Когда среда в лунках 96-луночной пластины становится желтой (из-за роста клеток и высвобождения метаболитов рН в среде снижается до 6,8, а фенольный красный цвет превращается из фуксии в желтый) или наблюдаются клеточные кластеры, приобретают 100 мкл надосадочной жидкости из выбранных лунок и добавляют в лунки покрытой ИФА пластины. Используйте считыватель микропланшетов для измерения значений OD450.
    2. Используйте поликлональные антитела против APN и неинфицированной мышиной сыворотки в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно и используйте PBS в качестве пустого контроля. В этом исследовании отношение OD450 образца к отрицательному контролю (P/N) ≥ 2,1 было признано положительным стандартом отбора.
  14. После трех последовательных положительных раундов отбора выберите гибридому, демонстрирующую повышенный серологический ответ против белка APN, для анализа ограниченного разведения.
    1. Подготовьте перитонеальные макрофаги и семена в 96-луночные пластины, как описано ранее.
    2. Суспендировать клетки гибридомы в среде HT в среднем 0,5-2 клетки на лунку и культивировать в инкубаторе 37 °C, 6% CO2 . Повторите этот шаг три или четыре раза, пока положительный показатель, указанный иммуноферментным анализом ИФА, не достигнет 100%.
  15. Под давлением непрерывного замораживания и оттаивания отбирают положительные клетки гибридомы, способные стабильно секретировать антитела против APN и нормально размножаться.
    1. Вводят однократную внутривенную инъекцию 0,3 мл пристана каждой мыши (8-10 недель). Через 10 дней после приема первозданности вводят каждой мыши 2-5 х 10,5 клеток гибридомы в0,5 мл PBS (рН 7,2).
    2. Осторожно собирают перитонеальную жидкость из брюшной полости этих мышей через 8 - 10 дней после инъекции.
    3. Собирают надосадочные жидкости центрифугированием при 5000 × г в течение 15 мин и очищают антитела в надосадочных продуктах, используя 33% насыщенный сульфат аммония [(NH)2SO4] осаждение и белок А агарозы.

4. Характеристика мАТ по отношению к белку APN

  1. Определите подтип иммуноглобулина собранных мАТ с помощью системы клонотипирования SBA-HRP20. Используйте SDS-PAGE и вестерн-блоттинг для оценки чистоты и специфичности mAb.
  2. Проанализируйте специфичность эпитопа mAb по отношению к белку APN с помощью ИФА21. Значение аддитивности (AV) - это отношение ODmAbs (a+b) к (OD mAbs-a+ODmAbs-b), которое используется для оценки того, распознают ли мАТ один и тот же антигенный сайт; OD mAbs-a и ODmAbs-b представляют собой значения OD450 различных моноклональных антител только против APN, аOD mAb (a + b) представляют значения OD450 смеси 1: 1 из двух mAb против APN.
    1. Оцените каждый образец не менее четырех повторений и повторите весь эксперимент не менее трех раз.

5. Выражение rAbs против APN

  1. Извлеките общую РНК из вышеупомянутых клеток гибридомы и селезенки мышей, иммунизированных APN (например, TRIzol)22. Синтезируйте комплементарную ДНК (кДНК) с помощью набора для синтеза кДНК в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Амплифицируйте вариабельные области мАТ с помощью вложенной ПЦР и определяйте последовательности тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL) с помощью секвенирования. Проанализируйте гены, кодирующие VH и VL, с помощью инструмента анализа генома мыши IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
  3. Объедините гены VH и VL с лидерными последовательностями и последовательно субклонируйте их в векторы pET28a (+) и pIRES2-ZsGreen1 соответственно, используя технологию бесшовного клонирования, чтобы обеспечить вставку фрагментов ДНК без рубцов. Конкретные грунтовки перечислены в таблице 1.
  4. Выращивайте pET28a (+)-rAbs-APN-BL21-трансформированные бактерии в присутствии 0,4 мМ IPTG в орбитальных шейкерах при 37 ° C в течение 10 часов. Затем индуцируют, очищают и оценивают экспрессию белка rAbs с помощью обычной очистки белка.
  5. Засейте 100 мкл 0,5 x 105 клеток СНО в лунку в 96-луночную пластину и инкубируйте при 37 ° C в атмосфере 6% CO2 в течение 18-24 часов. Когда клетки достигнут слияния 80-90%, разбавьте плазмиду pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN с помощью Opti-MEM до конечной концентрации 0,1 мкг/мкл и инкубируйте 5 мин при комнатной температуре перед использованием для трансфекции.
  6. Аккуратно смешайте 50 мкл разбавленной плазмиды pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN с 1 мкл липофектамина 2000 и 49 мкл Opti-MEM и инкубируйте смесь еще 20 минут при комнатной температуре. Добавьте по 100 мкл смеси в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего ячейки СНО, и инкубируйте при 37 °C в атмосфере 6% CO2 в течение 4-6 часов.
  7. Через 4-6 ч после трансфекции замените среду средой DMEM-F12 с добавлением 10% FBS и инкубируйте планшет еще 48 ч. Затем добавьте 400 мкг/мл G418 в каждую лунку, чтобы выбрать стабильно трансфицированные клетки.
  8. После 10 дней отбора с использованием среды DMEM-F12 с добавлением 10% FBS и 400 мкг/мл G418 отсортируйте клетки (3,0 × 107 клеток/мл) путем сортировки клеток, активированной флуоресценцией. Примерно 10-15% клеточной популяции были положительными.
  9. Серийно разбавляют собранные положительные клетки, высевают в среднем 0,5-2 клетки на лунку в 96-луночном планшете и культивируют в инкубаторе 37 °C, 6% CO2 . Поддерживайте стабильно трансфицированные клетки pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO с помощью отбора с помощью G418 (200 мкг / мл).
  10. Концентрация ФБС в вышеописанной среде для культивирования клеток постепенно снижается с 10% до 0% в течение логарифмической фазы роста в течение 3 недель. Затем адаптируют адгезивные клетки СНО к росту суспензии в среде, не содержащей сыворотки.
  11. Культивируют засеянные клетки pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO в фазе логарифмического роста в безсывороточной среде при плотности 0,8-1,0 ×10,5 клеток/мл в встряхивающих колбах при скорости встряхивания 80-110 об/мин и 37°С, 6%СО2.
  12. Собирайте клеточную суспензию каждые 12 часов, чтобы определить изменения жизнеспособности и жизнеспособности клеток, используя набор для подсчета клеток (например, CCK-8) в соответствии с инструкциями производителя.
  13. Экспрессия антител достигает пиковых уровней, когда жизнеспособность клеток снижается до 80%, а плотность клеток достигает 1,0-2,0 ×10,6 клеток/мл. Собирают надосадочные жидкости клеток с помощью центрифугирования, фильтруют с помощью мембранного фильтра из политетрафторэтилена 0,22 мкм и очищают с помощью агарозы белка А.
  14. Подтвердите выработку APN-специфических антител с помощью непрямых иммунофлюоресцентных анализов (IFA).
  15. Определите титры антител и сродство связывания с помощью анализа ИФА, как описано ранее. 23 Рассчитайте константу равновесной диссоциации (значениеKD ) антител с помощью четырехпараметрического логистического уравнения с помощью программного обеспечения.

Результаты

В этом исследовании очищенный растворимый белок APN (2,12 мг / мл) использовался для иммунизации мышей. Мыши, иммунизированные белком APN четыре раза с интервалом в 14 дней, показали более высокий титр антител против APN в сыворотке крови. Хотя 14 гибридом были получены с помощью экспериментов по...

Обсуждение

Индукция иммунитета слизистой оболочки является одним из наиболее эффективных подходов в противодействии болезнетворным микроорганизмам, а также в профилактике и лечении различных заболеваний. APN, высокоэкспрессируемый мембраносвязанный белок в слизистой оболочке кишечника, участ?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Все авторы одобрили и дали свое явное согласие на публикацию рукописи.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом Китайского национального научного фонда (No 32072820, 31702242), грантами Стипендии правительства Цзянсу для зарубежных исследований (JS20190246) и Научно-исследовательским фондом «Таланты высокого уровня Университета Янчжоу», проектом, основанным Приоритетной академической программой развития высшего учебного заведения провинции Цзянсу.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Complete Freund’s adjuvantSigma-AldrichF5881Animal immunization
DAPIBeyotime  BiotechnologyC1002Nuclear counterstain
DMEMGibco11965092Cell culture
DMEM-F12Gibco12634010Cell culture
Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibodyAbbkineA23310Indirect immunofluorescence analysis
Enhanced Cell Counting Kit-8Beyotime  BiotechnologyC0042Measurement of cell viability and vitality
Fetal bovine serumGibco10091Cell culture
Geneticin Selective AntibioticGibco11811098Selective antibiotic
GraphPad Prism 8.0 softwareGraphPad8.0Scientific data analysis and graphing
HAT Supplement (50X)Gibco21060017Cell selection
HT Supplement (100X)Gibco11067030Cell selection
Incomplete Freund’s adjuvantSigma-AldrichF5506Animal immunization
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosideSigma-AldrichI5502Protein expression
kanamycinBeyotime  BiotechnologyST102Bactericidal antibiotic
Leica TCS SP8 STED confocal microscopeLeica Microsystems SP8 STEDFluorescence imaging
Lipofectamine 2000 ReagentThermofisher11668019Transfection
LSRFortessa fluorescence-activated cell sortingBDFACS LSRFortessaFlow cytometry
Microplate readerBioTekBOX 998ELISA analysis
Micro spectrophotometerThermo FisherNano Drop oneNucleic acid concentration detection
NaClSinopharm Chemical Reagent10019308Culture broth
(NH4)2SO4Sinopharm Chemical Reagent10002917Culture broth
Opti-MEMGibco31985088Cell culture
Polyethylene glycol 1500Roche Diagnostics10783641001Cell fusion
PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis KitTakara BioRR047qPCR
protein A agaroseBeyotime  BiotechnologyP2006Antibody protein purification
Protino Ni+-TED 2000 Packed ColumnsMACHEREY-NAGEL745120.5Protein purification
SBA Clonotyping System-HRPSouthern BiotechMay-00Isotyping of mouse monoclonal antibodies
Seamless Cloning KitBeyotime  BiotechnologyD7010SConstruction of plasmids
Shake flasksBeyotime  BiotechnologyE3285Cell culture
Sodium carbonate-sodium bicarbonate bufferBeyotime  BiotechnologyC0221ACell culture
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-rad 170-3940Western blot
TryptoneOxoidLP0042Culture broth
Ultrasonic HomogenizerNingbo Xinzhi BiotechnologyJY92-IINSample homogenization
Yeast extractOxoidLP0021Culture broth
96-well microplateCorning3599Cell culture

Ссылки

  1. Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
  2. Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
  3. Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
  4. Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
  5. Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
  6. Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).
  7. Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
  8. Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
  9. Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
  10. Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
  11. Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
  12. Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
  13. Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
  14. Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  15. El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient's need. British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).
  16. Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
  17. Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
  18. Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
  19. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
  20. Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
  21. Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
  22. Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
  23. Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
  24. Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
  25. Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
  26. Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE171N

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены