Produção de anticorpos monoclonais contra aminopeptidase N no epitélio da mucosa intestinal suína

Resumo

A proteína de anticorpos recombinantes expressa em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e anticorpos monoclonais produzidos usando a tecnologia tradicional de hibridoma pode reconhecer e ligar-se à proteína N aminopeptidase suína (APN).

Resumo

A aminopeptidase N suína (PNA), uma metalopeptidase ligada à membrana abundantemente presente na mucosa do intestino delgado, pode iniciar uma resposta imune mucosa sem qualquer interferência, como baixa expressão proteica, inatividade enzimática ou alterações estruturais. Isso torna a APN uma candidata atraente no desenvolvimento de vacinas que visam seletivamente o epitélio da mucosa. Estudos anteriores mostraram que a PNA é uma proteína receptora tanto para Escherichia coli (E. coli) F4 enterotoxigênica quanto para o vírus da gastroenterite transmissível. Assim, a APN mostra-se promissora no desenvolvimento de conjugados anticorpo-droga ou novas vacinas baseadas em anticorpos específicos da APN. Neste estudo, comparamos a produção de anticorpos monoclonais específicos para APN (mAbs) usando a tecnologia tradicional de hibridoma e o método de expressão de anticorpos recombinantes. Nós também estabelecemos uma linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO) transfectada de forma estável usando pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN e uma cepa BL21(DE3) de expressão de E. coli abrigando o vetor pET28a (+)-rAbs-APN. Os resultados mostram que anticorpos expressos em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e mAbs produzidos usando hibridomas podem reconhecer e se ligar à proteína APN. Isso fornece a base para uma maior elucidação da função do receptor de APN para o desenvolvimento de terapêuticas direcionadas a diferentes epítopos específicos de APN.

Introdução

A aminopeptidase N (APN), enzima pertencente à família das metaloproteinases M1, atua como marcador, receptor e molécula sinalizadora tumoral por vias dependentes e independentes de enzimas ^1,2. Além de clivar os resíduos de aminoácidos N-terminais de vários peptídeos bioativos para a regulação de sua atividade biológica, a PNA desempenha um papel importante na patogênese de várias doenças inflamatórias. A PNA participa do processamento e apresentação de antígenos por peptídeos aparados que se ligam firmemente a moléculas de classe II do complexo principal de histocompatibilidade ^2,3. A PNA também exerce efeitos anti-inflamatórios ao se ligar a receptores acoplados à proteína G, participando de transdução de múltiplos sinais, modulando a secreção de citocinas e contribuindo para a fagocitose mediada pelo receptor gama Fc na resposta imune 4,5,6,7.

Como uma exopeptidase ligada à membrana amplamente distribuída, a PNA é abundante na mucosa do intestino delgado suíno e está intimamente associada à endocitose mediada por receptores ^1,5,8. A PNA reconhece e liga a proteína spike do vírus da gastroenterite transmissível para entrada celular e interage diretamente com a subunidade FaeG das fímbrias F4 de Escherichia coli enterotoxigênicas para afetar a aderência bacteriana com as células hospedeiras 9,10,11. Assim, a PNA é um potencial alvo terapêutico no tratamento de doenças infecciosas virais e bacterianas.

Desde o desenvolvimento da tecnologia de hibridoma e outras estratégias para a produção de anticorpos monoclonais (mAbs) em 1975, os mAbs têm sido amplamente utilizados em imunoterapia, liberação de fármacos e diagnóstico^12,13,14. Atualmente, os mAbs são utilizados com sucesso no tratamento de doenças, como câncer, doença inflamatória intestinal e esclerose^{múltipla12,15}. Devido à sua forte afinidade e especificidade, os mAbs podem ser alvos ideais no desenvolvimento de conjugados anticorpo-droga (ADC) ou novas vacinas^16,17. A proteína APN é crítica para a entrega seletiva de antígenos a células específicas, podendo provocar uma resposta imune específica e forte da mucosa contra patógenos sem qualquer interferência, incluindo baixa expressão proteica, inatividade enzimática ou alterações estruturais ^5,8,18. Portanto, produtos terapêuticos à base de mAbs específicos para APN mostram-se promissores contra infecções bacterianas e virais. Neste estudo, descrevemos a produção de mAbs específicos para APN usando tecnologia de hibridoma e a expressão de anticorpos recombinantes anti-APN (rAbs) usando vetores procarióticos e eucarióticos. O resultado indica que a proteína APN foi reconhecida tanto por rAbs expressos em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO quanto por mAbs derivados de hibridomas.

Protocolo

Todos os experimentos com animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yangzhou (SYXK20200041).

1. Preparação do antígeno da proteína APN suína

NOTA: A cepa pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) e as células pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 expressas de APN foram construídas em um estudo anterior¹¹.

1. Recuperar bactérias de um estoque congelado de glicerol e estriar em placas de Luria-Bertani (LB) contendo 50 μg/mL de canamicina (Km⁺) para isolamento de colônia única.
2. Selecionar uma única colônia da placa recém-estriada, cultivar em 4 mL de meio LB (10 g/L de triptona, 10 g/L de cloreto de sódio (NaCl) e 5 g/L de extrato de levedura, pH 7,2) suplementado com Km⁺ (50 μg/mL), e deixar crescer durante a noite (12-16 h) com agitação (178 rpm) a 37 °C.
3. Diluir as bactérias preparadas a 1:100 em caldo fresco Km⁺ LB e incubar a 37 °C com agitação durante 2-3 h até que o OD₆₀₀ atinja 0,4-0,6.
4. Adicionar isopropil β-d-1-thiogalactopiranosídeo (IPTG) ao meio até uma concentração final de 0,4 mM e incubar as culturas por mais 10 h a 16 °C.
5. Consequentemente, centrifugar e colher as bactérias usando indução IPTG (10.000 × g, 4 °C 15 min).
6. Ressuspender o pellet celular usando 5 mL de tampão LEW (Lysis/Equilibration/Wash) (50 mM de fosfato de sódio anidro monobásico (NaH₂PO₄) e NaCl 300 mM, pH 8,0) contendo 1 mg/mL de lisozima. Agite a suspensão bacteriana por 30 min no gelo e sonicate completamente (15 s pulso e 20 s desligado, 15 min) usando um homogeneizador ultra-sônico.
7. Centrifugar o lisado celular bruto a 4 °C e 10.000 × g durante 30 minutos para remover os detritos celulares. Transfira o sobrenadante para uma coluna pré-equilibrada e incube 1-2 min antes da drenagem por gravidade. Repita esta etapa três vezes.
8. Lavar a coluna com 20 mL de tampão LEW e drenar por gravidade. Eluir a proteína APN marcada com histidina usando 9 mL de tampão de eluição (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl e 250 mM imidazol, pH 8,0) e coletar em tubos de diálise.
9. Diálise da solução proteica durante a noite a 4 °C em tampão carbonato de sódio-bicarbonato de sódio (PBS, NaCl 135 mM, cloreto de potássio 4,7 mM, NaH 2 PO₄ mM e fosfato de sódio dibásico dodecahidratado 10 mM, pH_7,2).
10. Analisar usando um gel de SDS-PAGE a 12,0% e western blotting para avaliar a pureza da proteína APN.
    1. Coloque 5 μg de proteína em cada poço do gel e deixe correr a 110 V por 1,5 h. Em seguida, transfira a proteína para uma membrana de PVDF por 50 min a 15 V. Determine a concentração da proteína purificada usando um ensaio de BCA.

2. Imunização animal

1. Subcutâneo (s.c) injetar camundongos BALB/c fêmeas, 6-8 semanas de idade, com 50 μg de proteína APN ou PBS (controle negativo) misturado com adjuvantes uma vez a cada 2 semanas. Use o adjuvante de Freund completo que contém as micobactérias mortas pelo calor para a imunização inicial, e o adjuvante de Freund incompleto para as imunizações de reforço. Misturar volumes iguais de proteína APN (ou PBS) e adjuvante de Freund ou adjuvante de Freund incompleto, respectivamente.
2. Detectar títulos de anticorpos contra APN no soro desses camundongos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) usando uma placa de microtitulação revestida com 5 μg/mL de proteína APN diluída em PBS 0,05 M (pH 9,6). .

3. Tecnologia de hibridoma para produção de anticorpos monoclonais contra PNA

1. Intraperitonealmente (i.p.) injetar 100 μg de proteína APN nos camundongos selecionados para um reforço final do antígeno.
2. Três dias depois, eutanasiar os camundongos com pentobarbital sódico (50 mg/kg, v/v, intraperitoneal) e luxação cervical.
3. Colete baços e lave com DMEM duas vezes para remover o sangue e as células de gordura. Filtrar a suspensão de células do baço usando uma grade de cobre de 200 malhas para remover detritos de tecido e colher células do baço usando centrifugação (1500 × g, 10 min) para remover a membrana do baço.
4. Células SP2/0 de mieloma múltiplo de camundongo em frasco de 25^cm2 contendo 5 mL de DMEM suplementado com 6% de soro fetal bovino (SFB) e cultura a 37 °C, atmosfera de 6% de CO₂ para manter a viabilidade celular. Após 5-6 dias de cultura, as células atingem 80%-90% de confluência pós-ressuscitação e estão em fase log de crescimento. Sob o microscópio, as células são redondas, brilhantes e claras.
5. Um dia antes da hibridização, coletar macrófagos das cavidades peritoneais dos camundongos de acordo com método previamente publicado^12,19.
6. Macrófagos peritoneais de sementes a uma densidade de 0,1-0,2 × 10⁵/mL em placas de 96 poços, cada poço contendo 100 μL de meio HAT (DMEM suplementado com 10% FBS e 1x HAT Supplement), e incubam a 37 °C, 6 % CO₂ atmosfera umidificada durante a noite.
7. Para hibridização, aspirar suavemente as células SP2/0 com uma pipeta de 8-10 frascos e suspender em 10 mL de meio DMEM sem soro. Lavar as células com DMEM fresco, centrifugar (1500 × g, 10 min) duas vezes e, em seguida, ressuspender em 10 mL de DMEM.
8. Misturar as células quantificadas do baço com as células SP2/0 na proporção de 10:1 e transferir para tubos de 50 ml. Centrifugar (1500 × g, 10 min) e descartar o sobrenadante. Colete os pellets de células no fundo dos tubos e bata com a palma da mão para soltar os pellets antes da hibridização.
9. Adicionar 1 mL de polietilenoglicol 1500 (PEG 1500), pré-aquecido a 37 °C, gota a gota, usando um conta-gotas para a pastilha de célula solta durante o período de tempo de 45 s, girando suavemente o fundo do tubo.
10. Adicionar lentamente 1 mL de DMEM pré-aquecido a 37 °C à mistura acima durante o período de 90 s, seguido por mais 30 mL de DMEM fresco. Colocar o tubo de fusão num banho-maria a 37 °C durante 30 minutos.
11. Após a incubação no banho quente, colher as células e ressuspender em meio HAT. Em seguida, cultura em placa de 96 poços inoculada com macrófagos peritoneais.
12. Cinco dias depois, adicionar 100 μL de meio HAT fresco a cada poço e incubar a placa por mais 5 dias, após o que substituir o meio por meio HT (DMEM suplementado com 10% FBS e 1x HT Supplement).
13. Utilizar uma placa de microtitulação revestida com 5 μg/mL de proteína APN diluída em PBS 0,05 M (pH 9,6) para analisar anticorpos monoclonais no sobrenadante do hibridoma usando ensaio ELISA.
    1. Quando o meio nos poços da placa de 96 poços fica amarelo (devido ao crescimento celular e liberação de metabólitos, o pH no meio diminui para 6,8 e o vermelho fenólico passa de fúcsia para amarelo) ou aglomerados celulares são observados, adquira 100 μL de sobrenadante dos poços selecionados e adicione aos poços da placa ELISA revestida. Use um leitor de microplacas para medir os valores OD450.
    2. Usar os anticorpos policlonais contra PNA e soro de camundongos não infectados como controle positivo e negativo, respectivamente, e usar PBS como controle em branco. Neste estudo, a razão OD450 amostra/controle negativo (P/R) ≥ 2,1 foi reconhecida como padrão de seleção positiva.
14. Após três rodadas consecutivas de seleção positiva, selecione o hibridoma que apresenta resposta sorológica aumentada contra a proteína APN para um ensaio de diluição limitada.
    1. Preparar macrófagos peritoneais e sementes em placas de 96 poços, conforme descrito anteriormente.
    2. Suspender células de hibridoma em meio HT a uma média de 0,5-2 células por poço e cultivar em estufa a 37 °C, 6% CO₂ . Repita essa etapa três ou quatro vezes até que a taxa de positividade indicada pelo imunoensaio ELISA atinja 100%.
15. Sob a pressão de congelamento e descongelamento contínuos, selecione as células positivas do hibridoma capazes de secretar de forma estável anticorpos anti-APN e proliferar normalmente.
    1. Administrar uma única injeção i.p. de 0,3 ml de pristano a cada rato (8-10 semanas). Aos 10 dias após receber o pristine, injetar em cada camundongo 2-5 x¹⁰ 5 células de hibridoma em 0,5 mL de PBS (pH 7,2).
    2. Coletar cuidadosamente líquido peritoneal da cavidade peritoneal desses camundongos 8 a 10 dias após a injeção.
    3. Colher os sobrenadantes por centrifugação a 5.000 × g por 15 min e purificar os anticorpos nos sobrenadantes usando precipitação de sulfato de amônio saturado a 33% [(NH 4)₂SO₄] e proteína A agarose.

4. Caracterização de mAbs contra proteína APN

1. Determinar o subtipo de imunoglobulina dos mAbs coletados usando um SBA Clonotyping System-HRP²⁰. Use SDS-PAGE e western blotting para avaliar a pureza e especificidade do mAb.
2. Analise a especificidade do epítopo mAb contra a proteína APN usando ELISA²¹. O valor de aditividade, AV, é a razão entre OD_mAbs (a+b) e (OD mAbs-a+OD_mAbs-b), que é usado para avaliar se os mAbs reconhecem o mesmo sítio antigênico; OD_mAbs-a e OD_mAbs-b representam os valores de OD450 de diferentes anticorpos monoclonais contra APN isoladamente, e OD mAbs_(a+b) representam os valores de OD450 de uma mistura 1:1 de dois mAbs contra APN.
   1. Avalie cada amostra pelo menos quatro repetições e repita todo o experimento pelo menos três vezes.

5. Expressão de rAbs contra APN

1. Extrair o RNA total das células e baços do hibridoma acima mencionados de camundongos imunizados com APN (por exemplo, TRIzol)²². Sintetize DNA complementar (cDNA) usando um kit de síntese de cDNA de acordo com as instruções do fabricante.
2. Amplificar regiões variáveis de mAbs usando nested PCR e determinar sequências de cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL) usando sequenciamento. Analisar os genes que codificam VH e VL usando a ferramenta de análise do genoma de camundongos IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
3. Combinar os genes VH e VL com sequências líderes e subcloná-los sequencialmente nos vetores pET28a (+) e pIRES2-ZsGreen1, respectivamente, usando tecnologia de clonagem contínua para permitir a inserção de fragmentos de DNA sem cicatrizes. Os primers específicos estão listados na Tabela 1.
4. Cultivar as bactérias transformadas em pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 na presença de IPTG 0,4 mM em agitadores orbitais a 37 °C por 10 h. Em seguida, induzir, purificar e avaliar a expressão da proteína rAbs usando purificação proteica de rotina.
5. Seme 100 μL 0,5 x 10⁵ células CHO por poço em uma placa de 96 poços e incube a 37 °C em uma atmosfera de 6% de CO₂ por 18-24 h. Quando as células atingirem 80-90% de confluência, diluir o plasmídeo pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN com Opti-MEM até uma concentração final de 0,1 μg/μL e incubar 5 min à temperatura ambiente antes de usar para transfecção.
6. Misturar suavemente 50 μL do plasmídeo pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN diluído com 1 μL de Lipofectamina 2000 e 49 μL de Opti-MEM e incubar a mistura durante mais 20 minutos à temperatura ambiente. Adicionar 100 μL de mistura a cada poço de uma placa de 96 poços contendo células CHO e incubar a 37 °C em atmosfera de CO₂ a 6% durante 4-6 horas.
7. Em 4-6 h pós-transfecção, substituir o meio por meio DMEM-F12 suplementado com 10% de SFB e incubar a placa por mais 48 h. Em seguida, adicionar 400 μg/mL de G418 a cada poço para selecionar as células transfectadas de forma estável.
8. Após 10 dias de seleção usando meio DMEM-F12 suplementado com FBS 10% e G418 400 μg/mL, classificar as células (3,0 × 10⁷ células/mL) por triagem celular ativada por fluorescência. Aproximadamente 10-15% da população celular foi positiva.
9. Diluir serialmente as células positivas colhidas, semear em média 0,5-2 células por poço em uma placa de 96 poços e cultura em uma incubadora de 37 °C e 6% de CO₂ . Manter as células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO transfectadas de forma estável usando seleção com G418 (200 μg/mL).
10. A concentração de FBS no meio de cultura celular descrito acima diminui gradualmente de 10% para 0% durante a fase de crescimento logarítmico ao longo do período de tempo de 3 semanas. Em seguida, adaptar as células CHO aderentes ao crescimento em suspensão em meio sem soro.
11. Cultivar as células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO semeadas na fase logarítmica de crescimento em meio livre de soro a uma densidade de 0,8-1,0 × 10⁵ células/mL em frascos de agitação a 80-110 rpm e 37°C, 6% CO₂.
12. Coletar a suspensão celular a cada 12 h para determinar mudanças na viabilidade e vitalidade celular usando um kit de contagem de células (por exemplo, CCK-8) de acordo com as instruções do fabricante.
13. A expressão de anticorpos atinge níveis máximos quando a viabilidade celular diminui para 80% e a densidade celular atinge 1,0-2,0 × 10⁶ células/mL. Colher sobrenadantes celulares usando centrifugação, filtrar usando um filtro de membrana de politetrafluoretileno de 0,22 μm e purificar usando a proteína A agarose.
14. Confirmar a produção de anticorpos específicos para PNA usando ensaios de imunofluorescência indireta (RIFI).
15. Determine os títulos de anticorpos e as afinidades de ligação usando o ensaio ELISA, conforme descrito anteriormente. ²³ Calcular a constante de dissociação de equilíbrio (valor de K_D ) dos anticorpos com uma equação logística de quatro parâmetros usando software.

Resultados

Neste estudo, a proteína solúvel purificada de APN (2,12 mg/mL) foi usada para imunização em camundongos. Camundongos imunizados com a proteína APN quatro vezes em intervalos de 14 dias exibiram um título mais alto de anticorpos contra APN em seus soros. Embora 14 hibridomas tenham sido obtidos usando os experimentos de fusão, apenas 9 hibridomas sobreviveram aos três ciclos contínuos de congelamento-descongelamento, resultando em 9 clones estáveis que secretaram anticorpos contra a PNA. Todas essas células s?...

Discussão

A indução da imunidade da mucosa é uma das abordagens mais eficazes no combate a patógenos e na prevenção e tratamento de várias doenças. A PNA, uma proteína ligada à membrana altamente expressa na mucosa intestinal, está envolvida na indução da resposta imune adaptativa e na endocitose viral e bacteriana mediada por receptores ^1,5,8. A PNA é usada como particulada antigênica em muitos formatos de carregamento de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Animal immunization
DAPI	Beyotime  Biotechnology	C1002	Nuclear counterstain
DMEM	Gibco	11965092	Cell culture
DMEM-F12	Gibco	12634010	Cell culture
Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody	Abbkine	A23310	Indirect immunofluorescence analysis
Enhanced Cell Counting Kit-8	Beyotime  Biotechnology	C0042	Measurement of cell viability and vitality
Fetal bovine serum	Gibco	10091	Cell culture
Geneticin Selective Antibiotic	Gibco	11811098	Selective antibiotic
GraphPad Prism 8.0 software	GraphPad	8.0	Scientific data analysis and graphing
HAT Supplement (50X)	Gibco	21060017	Cell selection
HT Supplement (100X)	Gibco	11067030	Cell selection
Incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Animal immunization
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside	Sigma-Aldrich	I5502	Protein expression
kanamycin	Beyotime  Biotechnology	ST102	Bactericidal antibiotic
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems	SP8 STED	Fluorescence imaging
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermofisher	11668019	Transfection
LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting	BD	FACS LSRFortessa	Flow cytometry
Microplate reader	BioTek	BOX 998	ELISA analysis
Micro spectrophotometer	Thermo Fisher	Nano Drop one	Nucleic acid concentration detection
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	Culture broth
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	Culture broth
Opti-MEM	Gibco	31985088	Cell culture
Polyethylene glycol 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Cell fusion
PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit	Takara Bio	RR047	qPCR
protein A agarose	Beyotime  Biotechnology	P2006	Antibody protein purification
Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns	MACHEREY-NAGEL	745120.5	Protein purification
SBA Clonotyping System-HRP	Southern Biotech	May-00	Isotyping of mouse monoclonal antibodies
Seamless Cloning Kit	Beyotime  Biotechnology	D7010S	Construction of plasmids
Shake flasks	Beyotime  Biotechnology	E3285	Cell culture
Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer	Beyotime  Biotechnology	C0221A	Cell culture
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	170-3940	Western blot
Tryptone	Oxoid	LP0042	Culture broth
Ultrasonic Homogenizer	Ningbo Xinzhi Biotechnology	JY92-IIN	Sample homogenization
Yeast extract	Oxoid	LP0021	Culture broth
96-well microplate	Corning	3599	Cell culture