Domuz Bağırsak Mukozal Epitelinde Aminopeptidaz N'yi Hedef Alan Monoklonal Antikorların Üretimi

Özet

pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerinde eksprese edilen rekombinant antikor proteini ve geleneksel hibridoma teknolojisi kullanılarak üretilen monoklonal antikorlar, domuz aminopeptidaz N (APN) proteinini tanıyabilir ve bağlanabilir.

Özet

İnce bağırsak mukozasında bol miktarda bulunan membrana bağlı bir metallopeptidaz olan domuz aminopeptidaz N (APN), düşük protein ekspresyonu, enzim hareketsizliği veya yapısal değişiklikler gibi herhangi bir müdahale olmaksızın mukozal bir bağışıklık tepkisi başlatabilir. Bu, APN'yi mukozal epiteli seçici olarak hedef alan aşıların geliştirilmesinde çekici bir aday haline getirmektedir. Önceki çalışmalar, APN'nin hem enterotoksijenik Escherichia coli (E. coli) F4 hem de bulaşıcı gastroenterit virüsü için bir reseptör proteini olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, APN, antikor-ilaç konjugatlarının veya APN'ye özgü antikorlara dayanan yeni aşıların geliştirilmesinde umut vaat etmektedir. Bu çalışmada, APN'ye özgü monoklonal antikorların (mAbs) üretimini geleneksel hibridoma teknolojisi ve rekombinant antikor ekspresyon yöntemi kullanılarak karşılaştırdık. Ayrıca, pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN ve pET28a (+)-rAbs-APN vektörünü barındıran bir E. coli ekspresyonu BL21 (DE3) suşu kullanarak kararlı bir şekilde transfekte edilmiş bir Çin hamster yumurtalık (CHO) hücre hattı oluşturduk. Sonuçlar, pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerinde eksprese edilen antikorların ve hibridomlar kullanılarak üretilen mAbs'nin APN proteinini tanıyabileceğini ve bağlanabileceğini göstermektedir. Bu, farklı APN'ye özgü epitopları hedef alan terapötiklerin geliştirilmesi için APN reseptör fonksiyonunun daha fazla aydınlatılması için temel sağlar.

Giriş

Metalloproteinaz M1 ailesine ait bir ay ışığı enzimi olan Aminopeptidaz N (APN), enzime bağımlı ve enzimden bağımsız yollar^1,2 aracılığıyla bir tümör belirteci^, reseptör ve sinyal molekülü olarak işlev görür. APN, biyolojik aktivitelerinin düzenlenmesi için çeşitli biyoaktif peptitlerin N-terminal amino-asit kalıntılarını ayırmanın yanı sıra, çeşitli enflamatuar hastalıkların patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır. APN, majör histokompatibilite kompleksi sınıf II molekülleri ^2,3'e sıkıca bağlanan kesilmiş peptitler tarafından antijen işleme ve sunum....

Protokol

Bu çalışmadaki tüm hayvan deneyleri Yangzhou Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (SYXK20200041) tarafından onaylanmıştır.

1. Domuz APN protein antijeninin hazırlanması

NOT: pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) suşu ve APN kararlı bir şekilde eksprese edilen hücreler pEGFP-C1-APN-IPEC-J2, önceki bir çalışmada^{inşa edilmiştir 11}.

1. Dondurulmuş bir gliserol stoğundan bakterileri geri kazanın ve tek koloni izolasyonu için 50 μg / mL kanamisin (Km ⁺) içeren Luria-Bertani (LB) plakalarına çizin.
2. Taze çizgili plakadan tek bir koloni seçin, Km⁺ (50....

Sonuçlar

Bu çalışmada, fare bağışıklaması için saflaştırılmış çözünür APN proteini (2.12 mg / mL) kullanılmıştır. APN proteini ile 14 günlük aralıklarla dört kez aşılanan fareler, serumlarında APN'ye karşı daha yüksek bir antikor titresi sergiledi. Füzyon deneyleri kullanılarak 14 hibridom elde edilmesine rağmen, üç sürekli donma-çözülme döngüsünden sadece 9 hibridoma hayatta kaldı ve APN'ye karşı antikor salgılayan 9 kararlı klon ile sonuçlandı. Tüm bu hücreler yuvarlak, parla.......

Tartışmalar

Mukozal immünitenin indüklenmesi, patojenlere karşı koymada ve çeşitli hastalıkların önlenmesinde ve tedavisinde en etkili yaklaşımlardan biridir. Bağırsak mukozasında yüksek oranda eksprese edilen membrana bağlı bir protein olan APN, adaptif immün yanıtın indüklenmesinde ve reseptör aracılı viral ve bakteriyel endositozda rol oynar ^1,5,8. APN, antijen yüklemesi ve aşı dağıtımının birçok formatı.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Animal immunization
DAPI	Beyotime  Biotechnology	C1002	Nuclear counterstain
DMEM	Gibco	11965092	Cell culture
DMEM-F12	Gibco	12634010	Cell culture
Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody	Abbkine	A23310	Indirect immunofluorescence analysis
Enhanced Cell Counting Kit-8	Beyotime  Biotechnology	C0042	Measurement of cell viability and vitality
Fetal bovine serum	Gibco	10091	Cell culture
Geneticin™ Selective Antibiotic	Gibco	11811098	Selective antibiotic
HAT Supplement (50X)	Gibco	21060017	Cell selection
HT Supplement (100X)	Gibco	11067030	Cell selection
Incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	Animal immunization
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside	Sigma-Aldrich	I5502	Protein expression
kanamycin	Beyotime  Biotechnology	ST102	Bactericidal antibiotic
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems	SP8 STED	Fluorescence imaging
Lipofectamine® 2000 Reagent	Thermofisher	11668019	Transfection
LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting	BD	FACS LSRFortessa	Flow cytometry
Microplate reader	BioTek	BOX 998	ELISA analysis
Micro spectrophotometer	Thermo Fisher	Nano Drop one	Nucleic acid concentration detection
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	Culture broth
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	Culture broth
Opti-MEM	Gibco	31985088	Cell culture
Polyethylene glycol 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Cell fusion
PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit	Takara Bio	RR047	qPCR
protein A agarose	Beyotime  Biotechnology	P2006	Antibody protein purification
Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns	MACHEREY-NAGEL	745120.5	Protein purification
SBA Clonotyping System-HRP	Southern Biotech	May-00	Isotyping of mouse monoclonal antibodies
Seamless Cloning Kit	Beyotime  Biotechnology	D7010S	Construction of plasmids
Shake flasks	Beyotime  Biotechnology	E3285	Cell culture
Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer	Beyotime  Biotechnology	C0221A	Cell culture
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-rad	170-3940	Western blot
Tryptone	Oxoid	LP0042	Culture broth
Ultrasonic Homogenizer	Ningbo Xinzhi Biotechnology	JY92-IIN	Sample homogenization
Yeast extract	Oxoid	LP0021	Culture broth
96-well microplate	Corning	3599	Cell culture