リンゴパルプでFluo-4/AMで細胞質Ca2+ を染色する

要約

リンゴパルプ細胞の単離プロトプラストは、細胞質^Ca2+ 濃度を検出するためにカルシウム蛍光試薬を装填した。

要約

サイトソリック^Ca2+は、植物開発において重要な役割を果たしています。カルシウムイメージングは、細胞質における^Ca2+の動的変化を検出する最も汎用性の高い方法です。本研究では、酵素加水分解によりパルプ細胞の生き生き可能なプロトプラストを得た。単離したプロトプラストを37°Cで30分間、低分子蛍光試薬(Fluo-4/AM)でインキュベートした。 蛍光プローブは細胞細胞系^Ca2+の染色に成功したが、液胞に蓄積しなかった。Ca^3+、Ca2+チャネルブロッカーは、細胞質蛍光強度を低下した。これらの結果は、Fluo-4/AMが果実肉における細胞質^Ca2+の変化を検出するために使用できることを示唆している。要約すると、果実の果実の果体細胞からプロトプラストを効果的に単離し、小分子カルシウム蛍光試薬をパルプ細胞の細胞質に負荷させることで^Ca2+を検出する方法を提示する。

概要

^Ca2+は植物のシグナル伝達と代謝^に重要な役割を^果たす1,2 .また、それは、貯蔵中の硬度、糖度、および生理障害に対する感受性を含む果物品質形質^3、4を調節する^5、6。細胞質Ca^2+は、シグナル伝達に重要な役割を果たし、植物の成長と開発^{を調節する7}.細胞カルシウム恒常性の乱れは、リンゴ^8、梨⁹の褐色スポット病、トマト¹⁰の臍帯病に苦いピットを誘発し、果実の質に影響を及ぼし、深刻な経済的損失を引き起こす^3、11。カルシウムイメージングは十分な空間的および時間的分解能を有し、生細胞^12,13における^Ca2+ダイナミクスを観察するための重要な方法である。

現在、生細胞における細胞内カルシウムイメージングには主に2つの方法がある:一方は化学小分子蛍光プローブ¹⁴を採用し、もう1つは遺伝子コードセンサ(GECI)15,16である。果樹における安定したトランスジェニックシステムの確立と長い果実の開発の難しさを考えると、GECI_Sはフルーツ^Ca2+蛍光イメージングには適していません。

Fluo-4/AMのような低分子蛍光プローブは特に利点があります:そのAMエステル形態(細胞透過性アセトキシメチルエステル誘導体)は、トランスフェクションを必要とせずに生細胞に容易にバルクロードすることができ、柔軟で迅速で非細胞毒性^の17になります。Fluo-4/AMは、ピルス・ピリフォリア¹⁸とペチュニア^、19の花粉管に正常にロードすることができ、また、アビニズナプシス²¹のガードセル²⁰と根髪に入れることができました。

現在のところ、パルプ細胞²²のカルシウム蛍光染色に関する報告はほとんどない。重要なミネラル成分として、リンゴなどの樹果の成長と品質管理においてカルシウムが重要な役割を果たします。リンゴの木は世界的に重要な経済種として認識されており、リンゴは健康的な食品²³と考えられています。本研究では、リンゴ果実パルプから酵素加水分解を介して生存可能なプロトプラストを得てから、細胞質に低分子蛍光試薬をロードして^Ca2+を検出した。

プロトコル

1. プロトプラスト抽出

1. 基本溶液を調製:20 mM CaCl_2、5mM 2-(Nモルフォリノ)エタネスルホン酸、および0.4 M Dソルビトール。
   注:基本溶液のpHは、0.1 Mトリスバッファーで5.8に調整し、0.22 μmの水溶性フィルタを通して濾過し、4°Cで保存しました。
2. 酵素ソリューションを準備する:基本的なソリューションと0.3%(w/v)マセロザイムR-10と0.5%(w/v)セルラーゼR-10をミックス。
3. 0.5 mLの酵素溶液を1.5 mL遠心分離管に加えます。健康で熟したリンゴを選んでください。その後、パルプを10 x 5 x 1 mm³サイズにスライスします(図1A-1C)。
4. リンゴの果実の果肉片を酵素溶液を含む1.5mL遠心分離チューブに入れ、チューブを閉じます(図1D)。
5. 28°Cで1時間インキュベートし、暗闇の中でシェーカーで70rpm/分で揺れます。
6. パルプ部分を洗います。酵素溶液をすべて吸引し、0.5 mLの基本液を加えます。
7. 室温で2分間300×gで遠心分離機。
8. プロトプラスト懸濁液を得るために、遠心分離管の底部から溶液を吸引する(図1E)。

2. 低分子カルシウムイオン蛍光染色

1. Fluo-4/AM負荷溶液を2 mM Fluo-4/AM、20%F-127、10倍のリン酸緩衝生理食塩水(PBS:80 mM Na₂HPO 4、1.36 M NaCI、20 mM KH₂PO_4、26mM KCI)で1:1:2の比率で調製します。
2. 1.5 mL遠心分離管に存在するプロトプラスト懸濁液の99 μLに、Fluo-4/AM負荷溶液を1 μL加えます。蛍光色素の最終濃度が5μMであることを確認し、溶液を混合し、チューブを閉じます。
3. ラ³⁺処理:プロトプラスト懸濁液98 μL、1μLのラ^3+、1μLのFluo-4/AMローディング溶液を1μL用意します。溶液を混ぜてチューブを閉じます。
4. 暗闇の中で37°Cで30分間インキュベートします。
5. プロトプラストを300xgで室温で2分間遠心して洗浄します。70 μLの溶液を吸引し、70 μLの基本溶液を追加します。
6. プロトプラスト懸濁液を37°Cで30分間インキュベートし、完全に脱エステル化します。
7. プロトプラスト懸濁液の15μLを吸引し、スライドに滴下します。
8. 蛍光顕微鏡下で観察する(補助図S1)。
   注:3.45 μmピクセル解像度の3.2 MP(2048 x 1536)CMOSセンサーなど、高感度のカラーカメラを使用してください。
9. イメージング用の GFP チャネルを選択します(20x)。明るさを 0.5 に設定します。
   メモ:照明は、統合されたハードコーティングされたフィルタセットを備えた調整可能な強度LEDライトキューブです。Fluo-4/AMの励起波長は490nmです。

3. プロトプラスト生存アッセイ

1. フルオレセインジアセテート(FDA)ストック溶液を調製する:最終濃度が1mg/mLになるまでFDAをアセトンに溶解する。
2. 1 μLのストック溶液と99 μLのアセトンでFDAの作業ソリューションを準備します。
3. 99 μLのプロトプラスト懸濁液に1 μLのFDA作業溶液を加えます。上下にピペットして溶液を混ぜ、チューブを閉じます。
   注:FDAの最終濃度は100 μg/Lです。
4. 暗闇の中で5分間室温で汚す。
5. スライドを準備し、蛍光顕微鏡で観察します。
6. イメージング用の GFP チャネルを選択します (図 1F)。

4. 画像解析

1. 取得した画像を画像解析およびスプレッドシートソフトウェア(例えば、Image-Pro PlusおよびExcel 2010)を使用して分析します。
2. プロトプラストから2つの垂直直径を選択して蛍光強度を計算する(補助図S2)。異なる治療の下ですべてのプロトプラストの蛍光強度を測定し測定した。最終処理には、写真編集ソフトを使用してください。

5. 統計分析

1. 統計ソフトウェアを使用して統計解析を実行する (補助図 S3)。データは平均±SDで提示されます。実験グループ間の違いを分析するために、学生の t-testを使用しました。

結果

上述したプロトコルに従って、酵素法を用いて、パルプから生き生き可能なプロトプラストを得た(図1)。一部のプロトプラストは空胞を持っていましたが、他のプロトプラストは持っていませんでした。プロトプラストは^、Ca2+ 蛍光指標がそれらにロードされなかったときに蛍光を示さなかった。Fluo-4/AMがプロトプラストに積み込まれると、細胞質は蛍光を発す...

ディスカッション

本研究では、生き生きとしたプロトプラストを酵素加水分解により得た。この方法には新鮮なリンゴが必要であることに注意してください。本プロトコルは、研究研究で使用するために、果肉から多数のプロトプラストを迅速に分離することを可能にする。この方法の適用可能性は「富士」に限定されません。「ドゥーナン」と「ハニークリスプ」のリンゴパルプのプロトプラストも同じプ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.