JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Elma hamuru hücrelerinin izole protoplastları sitoplazmik Ca2+ konsantrasyonu tespit etmek için kalsiyum floresan reaktif ile yüklendi.

Özet

Sitosoleik Ca2+, bitki gelişiminde önemli bir rol oynar. Kalsiyum görüntüleme sitoplazmada Ca2+ dinamik değişiklikleri tespit etmek için en çok yönlü yöntemdir. Bu çalışmada enzimatik hidroliz ile pulpa hücrelerinin uygulanabilir protoplastlarını elde ettik. İzole protoplastlar 37 °C'de 30 dakika boyunca küçük moleküllü floresan reaktif (Fluo-4/AM) ile inkübe edildi. Floresan problar sitosolik Ca2+'yı başarıyla lekeledi, ancak vakuollerde birikmedi. La3+, bir Ca2 + kanal engelleyici, sitoplazmik floresan yoğunluğunu azalttı. Bu sonuçlar Fluo-4/AM'nin meyve etinde sitosolik Ca2+ değişikliklerini tespit etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Özetle, protoplastları meyvenin et hücrelerinden etkili bir şekilde izole etmek ve pulpa hücrelerinin sitoplazmında küçük moleküllü kalsiyum floresan reaktif yükleyerek Ca2+'yı tespit etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Giriş

Ca2+ bitki sinyali transdüksiyonu ve metabolizmasında önemli bir rol oynar1,2. Ayrıca, meyve kalitesi özelliklerini düzenler3,4, sertlik, şeker içeriği ve depolama sırasında fizyolojik bozukluklara duyarlılık dahil5,6. Sitoplazmik Ca2+ sinyal transdüksiyonunda önemli bir rol oynar ve bitki büyümesini ve gelişimini düzenler7. Hücresel kalsiyum homeostaz rahatsızlığı elmalarda acı çukura neden olabilir8, armutlarda kahverengi nokta hastalığı9ve domateslerde göbek çürümesi10, meyve kalitesini etkiler ve ciddi ekonomik kayıplara neden olur3,11. Kalsiyum görüntüleme yeterli mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahiptir ve canlı hücrelerde Ca2+ dinamiklerini gözlemlemek için önemli bir yöntemdir12,13.

Şu anda, canlı hücrelerde hücre içi kalsiyum görüntüleme için iki ana yöntem vardır: biri kimyasal küçük moleküler floresan problar14, diğeri ise gen kodlama sensörü (GECI)15,16. Meyve ağaçlarında kararlı bir transgenik sistem kurmanın zorluğu ve daha uzun meyve gelişimi göz önüne alındığında, GECIS meyve Ca2 + floresan görüntüleme için uygun değildir.

Fluo-4/AM gibi küçük moleküllü floresan probların özel bir avantajı vardır: ester formları (hücre geçirgen asetoksimetil ester türevi) transfeksiyona gerek kalmadan canlı hücrelere kolayca toplu olarak yüklenebilir, bu da onu esnek, hızlı ve sitotoksik olmayan17yapar. Fluo-4/AM, Pyrus pyrifolia18 ve Petunia,19 polen tüpüne ve Arabidopsis21'in 20 ve kök saçlarına başarıyla yüklenebilir.

Şu anda, pulpa hücrelerinin kalsiyum floresan boyanma hakkında çok az rapor vardır22. Önemli bir mineral element olarak kalsiyum, elma gibi ağaç meyvelerinin büyümesinde ve kalite kontrolünde kilit rol oynar. Elma ağaçları küresel olarak önemli bir ekonomik tür olarak kabul edilir ve elmalar sağlıklı bir yiyecek olarak kabul edilir23. Bu çalışmada, enzimatik hidroliz yoluyla elma meyve hamurundan uygulanabilir protoplastlar elde ettik ve daha sonra Ca2+tespit etmek için sitoplazmaya küçük moleküllü floresan reaktifler yükledik.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Protoplast ekstraksiyonu

  1. Temel çözeltiyi hazırlayın: 20 mM CaCl2, 5 mM 2-(N-morfolon)etanesülfonic asit ve 0.4 M D-sorbitol.
    NOT: Temel çözeltinin pH'ı 0,1 M Tris tampon ile 5,8'e ayarlandı, 0,22 μm suda çözünür filtrelerden süzdü ve 4 °C'de depolandı.
  2. Enzymatic çözeltiyi hazırlayın: %0,3(w/v) Macerozyme R-10 ve %0,5(w/v) selüloz R-10'u temel çözelti ile karıştırın.
  3. 1,5 mL santrifüj tüpüne 0,5 mL enzymatic çözelti ekleyin. Sağlıklı ve olgun bir elma seçin. Daha sonra hamuru 10 x 5 x 1 mm3 boyutunda dilimleyin (Şekil 1A-1C).
  4. Elma meyve hamuru parçalarını enzymatic çözelti içeren 1,5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin ve ardından tüpü kapatın (Şekil 1D).
  5. Tüpü 28 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın, karanlıkta bir çalkalayıcıda 70 rpm / dak'ta sallayın.
  6. Hamur parçalarını yıkayın. Tüm enzymatic çözeltiyi epire edin ve ardından temel çözeltinin 0,5 mL'lik kısmını ekleyin.
  7. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj.
  8. Bir protoplast süspansiyonu elde etmek için, çözeltiyi santrifüj tüpünün altından epire edin (Şekil 1E).

2. Küçük moleküllü kalsiyum iyon floresan boyama

  1. Fluo-4/AM yükleme solüsyonını 2 mM Fluo-4/AM ile hazırlayın, 1:1:2 oranında %20 F-127 ve 10x fosfat tamponlu salin (PBS:80 mM Na2HPO4, 1,36 M NaCI,20mM KH 2 PO4ve 26 mM KCI).
  2. 1,5 mL santrifüj tüplerinde bulunan protoplast süspansiyonunun 99 μL'sine 1 μL Fluo-4/AM yükleme çözeltisi ekleyin. Floresan boyanın son konsantrasyonunun 5 μM olduğundan emin olun çözeltiyi karıştırın ve ardından tüpü kapatın.
  3. La3+ tedavisi: 98 μL protoplast süspansiyon,1 μL 10 mM La 3+ ve 1 μL Fluo-4/ yükleme çözümü ile 100 μM La3+çözelti hazırlayın. Çözeltiyi karıştırın ve tüpü kapatın.
  4. Karanlıkta 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
  5. Protoplastları oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme ile yıkayın. Çözeltinin 70 μL'sini epire edin ve temel çözeltinin 70 μL'sini ekleyin.
  6. Protoplast süspansiyonu 37 °C'de 30 dakika boyunca tamamen esterifiye etmek için kuluçkaya yatırın.
  7. Protoplast süspansiyonunun 15 μL'sini epire edin ve bir kaydırağa damlatın.
  8. Floresan mikroskop altında gözlemleyin (Ek Şekil S1).
    NOT: Yüksek hassasiyete sahip bir renkli kamera kullanın, yani 3,45 μm piksel çözünürlüğe sahip 3,2 MP (2048 x 1536) CMOS sensör.
  9. Görüntüleme için GFP kanalını seçin (20x). Parlaklığı 0,5 olarak ayarlayın.
    NOT: Aydınlatma, entegre sert kaplamalı filtre setiyle ayarlanabilir yoğunluklu LED ışık küpleridir. Fluo-4/AM'nin heyecan dalga boyu 490 nm'dir.

3. Protoplast canlılık tahlil

  1. Floresan diasetat (FDA) stok çözeltisini hazırlayın: FDA'yı son konsantrasyon 1 mg/mL olana kadar asetonda çözün.
  2. FDA çalışma çözümünü 1 μL stok çözeltisi ve 99 μL aseton ile hazırlayın.
  3. 99 μL protoplast süspansiyona 1 μL FDA çalışma çözümü ekleyin. Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetle karıştırın ve ardından tüpü kapatın.
    NOT: FDA'nın son konsantrasyonu 100 μg/L'dir.
  4. Karanlıkta 5 dakika oda sıcaklığında leke.
  5. Slaytları hazırlayın ve floresan mikroskop altında gözlemleyin.
  6. Görüntüleme için GFP kanalını seçin (Şekil 1F).

4. Görüntü analizi

  1. Elde edilen görüntüleri görüntü analizi ve elektronik tablo yazılımı (örneğin, Image-Pro Plus ve Excel 2010) kullanarak analiz edin.
  2. Floresan yoğunluğunu hesaplamak için protoplastlardan iki dikey çap seçin (Ek Şekil S2). Farklı tedaviler altında tüm protoplastların floresan yoğunluğu ölçüldü. Son işlem için fotoğraf düzenleme yazılımını kullanın.

5. İstatistiksel analiz

  1. İstatistiksel yazılım kullanarak istatistiksel analiz gerçekleştirin (Tamamlayıcı Şekil S3). Veriler Ortalama ± SD olarak sunulmaktadır. Deneysel gruplar arasındaki farkları analiz etmek için öğrencinin t-testi kullanılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokole uyarak, pulpadan uygulanabilir protoplastlar elde etmek için enzimatik yöntemi kullandık (Şekil 1). Bazı protoplastlarda vakuoller vardı, bazılarında ise yoktu. Protoplastlar, Ca2+ floresan göstergesi onlara yüklenmediğinde floresan sergilemezken. Fluo-4/AM protoplastlara yüklendiğinde, sitoplazma, ancak vakuol değil, floresan oldu (Şekil 2). Bu sonuç, Fluo-4/AM'nin sitoplazmada Ca2+'yı başa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışmada enzimatik hidroliz ile uygulanabilir protoplastlar elde edilmiştir. Bu yöntemin taze elma gerektirdiğini unutmayın. Mevcut protokol, araştırma çalışmalarında kullanılmak üzere çok sayıda protoplastın meyve hamurundan hızlı bir şekilde izole edilmesini sağlar. Bu yöntemin uygulanabilirliği 'Fuji' ile sınırlı değildir; 'Dounan' ve 'Honey Crisp' elma hamurunun protoplastları da aynı protokolle çıkarılabilir (Ek Şekil S4). Enzimolizden sonra protoplast çözelti...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar bu makalenin içeriği ile herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Shandong Eyaleti Tarımsal Çeşitliliği İyileştirme Projesi (2019LZGC007) ve Shandong modern tarım endüstrisi teknoloji sisteminin (SDAIT-06-05) Meyve ağacı inovasyon ekibi tarafından desteklendi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10× phosphate-buffered salineSolarbioP1022PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4. 
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acidSolarbioM8010Biological buffer
CaCl2·2H2OSolarbioC8370Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10Yakult HonshaMX7352Degrade plant cell walls.
D-sorbitolSolarbioS8090It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127Thermo Fisher ScientificP6867Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media. 
FDAThermo Fisher ScientificF1303FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product. 
Fluo-4/AMThermo Fisher ScientificF14201The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscopeThermo FisherEVOS Auto 2Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10Yakult HonshaMX7351Degrade plant tissue to separate single cells.
TrisSolarbioT8060It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.

Referanslar

  1. Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. Fruit calcium: Transport and physiology. Frontiers in Plant Science. 7, 569(2016).
  2. Li, J., Yang, H. -q, Yan, T. -l, Shu, H. -r Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling. Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).
  3. Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening. Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).
  4. Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).
  5. Deell, J. R., Khanizadeh, S., Saad, F., Ferree, D. C. Factors affecting apple fruit firmness--a review. Journal- American Pomological Society. 55 (1), 8-27 (2001).
  6. Johnston, J., Hewett, E., Hertog, M. A. T. M. Postharvest softening of apple (Malus domestica) fruit: A review. New Zealand Journal of Experimental Agriculture. 30 (3), 145-160 (2002).
  7. Demidchik, V., Shabala, S., Isayenkov, S., Cuin, T. A., Pottosin, I. Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions. New Phytologist. 220 (1), 49-69 (2018).
  8. Miqueloto, A., et al. Mechanisms regulating fruit calcium content and susceptibility to bitter pit in cultivars of apple. Acta horticulturae. 1194 (1194), 469-474 (2018).
  9. Kou, X., et al. Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on 'Huangguan' pears during cold storage. Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).
  10. Vinh, T. D., et al. Comparative analysis on blossom-end rot incidence in two tomato cultivars in relation to calcium nutrition and fruit growth. The Horticulture Journal. 87 (1), 97-105 (2018).
  11. Yamane, T. Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees. Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).
  12. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  13. Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T. J., Walker, S., Sanderson, M. J. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. CSH Protocols. 2013 (2), 83(2013).
  14. Hirabayashi, K., et al. Development of practical red fluorescent probe for cytoplasmic calcium ions with greatly improved cell-membrane permeability. Cell Calcium. 60 (4), 256-265 (2016).
  15. Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca(2)(+) dynamics. Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
  16. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
  17. Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
  18. Qu, H., Xing, W., Wu, F., Wang, Y. Rapid and inexpensive method of loading fluorescent dye into pollen tubes and root hairs. PLoS One. 11, 0152320(2016).
  19. Suwińska, A., Wasąg, P., Zakrzewski, P., Lenartowska, M., Lenartowski, R. Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in Petunia. Planta. 245 (5), 909-926 (2017).
  20. Sun, L., et al. NADK2 positively modulates abscisic acid-induced stomatal closure by affecting accumulation of H2O2, Ca2+ and nitric oxide in Arabidopsis guard cells. Plant Science. 262, 81-90 (2017).
  21. Niu, Y. F., et al. Magnesium availability regulates the development of root hairs in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Cell and Environment. 37 (12), 2795-2813 (2014).
  22. Qiu, L., Wang, Y., Qu, H. Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica. Horticulture Research. 7, 91(2020).
  23. Boyer, J., Liu, R. H. Apple phytochemicals and their health benefits. Nutrition Journal. 3 (1), 5(2004).
  24. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).
  25. Qu, H., Shang, Z., Zhang, S., Liu, L., Wu, J. Identification of hyperpolarization-activated calcium channels in apical pollen tubes of Pyrus pyrifolia. New Phytologist. 174 (3), 524-536 (2007).
  26. Hadjantonakis, A. K., Pisano, E., Papaioannou, V. E. Tbx6 regulates left/right patterning in mouse embryos through effects on nodal cilia and perinodal signaling. PLoS One. 3 (6), 2511(2008).
  27. DeSimone, J. A., et al. Changes in taste receptor cell [Ca2+]i modulate chorda tympani responses to salty and sour taste stimuli. Journal of Neurophysiology. 108 (12), 3206-3220 (2012).
  28. Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8179-8184 (1989).
  29. Merritt, J. E., Mccarthy, S. A., Davies, M., Moores, K. E. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2. Biochemical Journal. 269 (2), 513-519 (1990).
  30. Li, W., et al. A comparative study on Ca content and distribution in two Gesneriaceae species reveals distinctive mechanisms to cope with high rhizospheric soluble calcium. Frontiers in Plant Science. 5 (5), 647(2014).
  31. Zhang, W., Rengel, Z., Kuo, J. Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature. Plant Journal. 15 (1), 147-151 (1998).
  32. Qu, H., Jiang, X., Shi, Z., Liu, L., Zhang, S. Fast loading ester fluorescent Ca2+ and pH indicators into pollen of Pyrus pyrifolia. Journal of Plant Research. 125 (1), 185-195 (2012).
  33. Wang, Y., et al. Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis. root hairs. BMC Plant Biology. 10, 53(2010).
  34. Fujimori, T., Jencks, W. P. Lanthanum inhibits steady-state turnover of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase by replacing magnesium as the catalytic ion. Journal of Biological Chemistry. 265 (27), 16262-16270 (1990).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır