Окрашивание цитоплазматического Ca2+ с fluo-4/AM в яблочной мякоти

Резюме

Изолированные протопласты клеток яблочной мякоти нагружали флуоресцентным реагентом кальция для обнаружения цитоплазматической концентрации Ca^2+.

Аннотация

Цитозольный Ca²⁺ играет ключевую роль в развитии растений. Кальциевая визуализация является наиболее универсальным методом обнаружения динамических изменений Ca²⁺ в цитоплазме. В этом исследовании мы получили жизнеспособные протопласты клеток пульпы путем ферментативного гидролиза. Изолированные протопласты инкубировали с маломолекулярным флуоресцентным реагентом (Fluo-4/AM) в течение 30 мин при 37 °C. Флуоресцентные зонды успешно окрашивали цитозольный Ca^2+, но не накапливались в вакуолях. La^3+,блокатор каналов Ca^2+, снижение интенсивности цитоплазматической флуоресценции. Эти результаты свидетельствуют о том, что Fluo-4/AM может быть использован для обнаружения изменений цитозольного Ca²⁺ в мякоти плода. Таким образом, мы представляем метод эффективного выделения протопластов из клеток мякоти плода и обнаружения Ca²⁺ путем загрузки маломолекулярного флуоресцентного реагента кальция в цитоплазму клеток пульпы.

Введение

Ca²⁺ играет важную роль в трансдукции сигналов растений и^{метаболизме 1,2.} Кроме того, он регулирует признаки качества плодов^3,4,включая твердость, содержание сахара и восприимчивость к физиологическим нарушениям при хранении^5,6. Цитоплазматический Ca²⁺ играет важную роль в сигнальной трансдукции и регулирует рост и развитие растений^7. Нарушение клеточного гомеостаза кальция может вызвать горькую косточку в яблоках^8,заболевание коричневых пятн у груш⁹и пуповинную гниль у томатов^10,влияющих на качество плодов и вызывающих серьезные экономические потери^3,11. Кальциевая визуализация имеет достаточное пространственное и временное разрешение и является важным методом наблюдения динамики Ca²⁺ в живых клетках^12,13.

В настоящее время существует два основных метода внутриклеточной визуализации кальция в живых клетках: один использует химические маломолекулярные флуоресцентные зонды^14,а другой - датчик кодирования генов (GECI)^15,16. Учитывая сложность создания стабильной трансгенной системы у фруктовых деревьев и более длительное развитие плодов, GECI_S не подходит для флуоресцентной визуализации фруктов Ca^2+.

Маломолекулярные флуоресцентные зонды, такие как Fluo-4/ AM, имеют особое преимущество: их форма эфира AM (проницаемое в клетки производное ацетоксиметилового эфира) может быть легко загружена массой в живые клетки без необходимости трансфекции, что делает его гибким, быстрым и нецитотоксичным^17. Fluo-4/AM может быть успешно загружен в пыльцевую трубку Pyrus pyrifolia¹⁸ и Petunia,^19, а также в защитные клетки²⁰ и корневые волосы Arabidopsis^21.

В настоящее время имеется мало сообщений о окрашивание кальциевой флуоресценцией клеток^{пульпы 22.} Как важный минеральный элемент, кальций играет ключевую роль в росте и контроле качества плодов деревьев, таких как яблоки. Яблони признаны во всем мире важным экономическим видом, а яблоки считаются здоровой пищей^23. В этом исследовании мы получили жизнеспособные протопласты из мякоти плодов яблок путем ферментативного гидролиза, а затем загрузили маломолекулярные флуоресцентные реагенты в цитоплазму для обнаружения Ca^2+.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Экстракция протопластов

1. Готовят основной раствор: 20 мМ CaCl_2,5 мМ2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты и 0,4 М D-сорбита.
   ПРИМЕЧАНИЕ: РН основного раствора доводили до 5,8 с буфером 0,1 М Триса, фильтроввали через водорастворимые фильтры 0,22 мкм и хранили при 4°С.
2. Приготовить ферментативный раствор: смешать 0,3% (мас./об.) мацероцима R-10 и 0,5% (мас./об.) целлюлазы R-10 с основным раствором.
3. Добавьте 0,5 мл ферментативного раствора в пробирку центрифуги 1,5 мл. Соберите здоровое и спелое яблоко. Затем нарежьте мякоть на размер 10 х 5^{х 1} мм 3(рисунок 1А-1С).
4. Поместите кусочки мякоти плодов яблока в центрифужную трубку размером 1,5 мл, содержащую ферментативный раствор, а затем закройте трубку(рисунок 1D).
5. Инкубируют трубку при 28 °C в течение 1 ч, встряхивая со скоростью 70 об/мин в шейкере в темноте.
6. Кусочки мякоти вымойте. Аспирировать весь ферментативный раствор и затем добавить 0,5 мл основного раствора.
7. Центрифуга при 300 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
8. Для получения суспензии протопласта аспирируют раствор со дна трубки центрифуги(рисунок 1Е).

2. Флуоресцентное окрашивание ионами кальция маломолекулярных

1. Приготовьте загрузочный раствор Fluo-4/AM с 2 мМ Fluo-4/AM, 20% F-127 и 10x фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS: 80 мМ Na₂HPO_4,1,36 М NaCI, 20 мМ KH₂PO₄и 26 мМ KCI) в соотношении 1:1:2.
2. Добавьте 1 мкл загрузочного раствора Fluo-4/AM к 99 мкл суспензии протопласта, присутствующей в трубках центрифуги объемом 1,5 мл. Убедитесь, что конечная концентрация флуоресцентного красителя составляет 5 мкМ. Смешайте раствор и закройте трубку.
3. Обработка La^3+: Приготовьте 100 мкМ раствора La³⁺ с 98 мкл суспензии протопласта, 1 мкл 10 мМ La³⁺и 1 мкл раствора Fluo-4/AM с нагрузкой. Перемешайте раствор и закройте трубку.
4. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C в темноте.
5. Промыть протопласты центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Аспират 70 мкл раствора и добавляют 70 мкл основного раствора.
6. Инкубируют суспензию протопласта при 37 °C в течение 30 мин до полной деэтерификации.
7. Аспирировать 15 мкл суспензии протопласта и капать на горку.
8. Наблюдение под флуоресцентным микроскопом(Дополнительный рисунок S1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте цветную камеру с высокой чувствительностью, т.е. CMOS-сенсор 3,2 Мп (2048 x 1536) с разрешением 3,45 мкм пикселей.
9. Выберите канал GFP для создания изображений (20x). Установите яркость на 0,5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Освещение - это светодиодные кубы с регулируемой интенсивностью и встроенным набором фильтров с твердым покрытием. Длина волны возбуждения Fluo-4/AM составляет 490 нм.

3. Анализ жизнеспособности протопласта

1. Приготовьте раствор флуоресцеина диацетата (FDA): растворите FDA в ацетоне до тех пор, пока конечная концентрация не сойдёт 1 мг/мл.
2. Готовят в FDA рабочий раствор с 1 мкл запасного раствора и 99 мкл ацетона.
3. Добавьте 1 мкл рабочего раствора FDA к 99 мкл суспензии протопласта. Перемешайте раствор, пипетируя вверх и вниз, а затем закройте трубку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация FDA составляет 100 мкг/л.
4. Окрашивать при комнатной температуре в течение 5 мин в темноте.
5. Подготовьте слайды и наблюдайте под флуоресцентным микроскопом.
6. Выберите канал GFP для визуализации(рисунок 1F).

4. Анализ изображений

1. Анализируйте полученные изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений и электронных таблиц (например, Image-Pro Plus и Excel 2010).
2. Выберите два вертикальных диаметра из протопластов для расчета интенсивности флуоресценции(дополнительный рисунок S2). Измеряли интенсивность флуоресценции всех протопластов при различных методах лечения. Для окончательной обработки используйте программное обеспечение для редактирования фотографий.

5. Статистический анализ

1. Выполнение статистического анализа с помощью статистического программного обеспечения(дополнительный рисунок S3). Данные представлены в средней ± УР. Тест студента t-testиспользовался для анализа различий между экспериментальными группами.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Следуя описанному выше протоколу, мы использовали ферментативный метод для получения жизнеспособных протопластов из пульпы(рисунок 1). Некоторые протопласты имели вакуоли, в то время как другие этого не делали. В то время как протопласты не проявляли флуоресценции, ког?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом исследовании жизнеспособные протопласты были получены ферментативным гидролизом. Отметим, что для этого способа требуются свежие яблоки. Настоящий протокол позволяет быстро изолировать большое количество протопластов из мякоти плодов для использования в научных исследовани?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.