애플 펄프에서 플루오-4/AM으로 세포질 Ca2+ 염색

요약

사과 펄프 세포의 분리된 전형세포는 세포질 Ca²⁺ 농도를 검출하기 위해 칼슘 형광 시약으로 적재되었다.

초록

사이토솔릭 Ca^2+는 식물 개발에 중요한 역할을 합니다. 칼슘 이미징은 세포질에서 Ca^2+의 동적 변화를 감지하는 가장 다양한 방법입니다. 이 연구에서는 효소 가수분해에 의해 펄프 세포의 생존 가능한 전도를 얻었습니다. 격리된 프토프러스트들은 37°C에서 30분 동안 소분자 형광 시약(Fluo-4/AM)으로 배양되었다. 형광 프로브는 성공적으로 염색 된 세포색 Ca^{2 +} 그러나 vacuoles에 축적되지 않았습니다. La^3+,Ca²⁺ 채널 차단제, 세포질 형광 강도 감소. 이러한 결과는 Fluo-4/AM이 과일 육체에서 세포색 Ca^2+의 변화를 감지하는 데 사용될 수 있음을 시사합니다. 요약하자면, 우리는 과일의 살 세포로부터 프톱서를 효과적으로 분리하고 펄프 세포의 세포질에 소분자 칼슘 형광 시약을 적재하여 Ca^2+를 검출하는 방법을 제시한다.

서문

Ca²⁺ 식물 신호 변환 및 신진 대사 에 중요 한 역할을^1,2. 또한, 저장^5,6동안 경도, 당도 및 생리장애에 대한 감수성을 포함한 과일 품질 특성^3,4를조절한다. 세포질 Ca²⁺ 신호 변환에 중요 한 역할을 하 고 식물 성장 및 개발을 조절^7. 세포칼슘 항상성의 교란은 사과^8,배^9의갈색 반점 질환,^{토마토(10)의}배부패에 쓰라린 구덩이를 유도할 수 있으며, 과일 품질에 영향을 미치고 심각한 경제적 손실을 유발할 수^{있다 3,11.} 칼슘 이미징은 충분한 공간 적 및 시간적 해상도를 가지며 살아있는 세포^12,13에서Ca²⁺ 역학을 관찰하는 중요한 방법입니다.

현재, 살아있는 세포에서 세포내 칼슘 이미징을 위한 두 가지 주요 방법이 있다: 하나는 화학적 소분자 형광^{프로브(14)를}채택하고, 다른 하나는 유전자 인코딩 센서(GECI)^15,16이다. 과일 나무에 안정적인 형질 전환 시스템을 확립하고 더 긴 과일 발달의 어려움을 감안할 때, GECI_S는 과일 Ca^{2 +} 형광 화상 진찰에 적합하지 않습니다.

플루오-4/AM과 같은 소분자 형광 프로브는 특별한 장점이 있습니다: 그들의 AM 에스테르 형태(세포 투과성 아세톡시메틸 에스테르 유도체)는 형질, 급속및 비 세포독성^17을만드는 형질이 없는 살아있는 세포에 쉽게 대량으로 적재될 수 있다. 플루오-4/AM은 피루스 피리폴리아^18과 페투니아,^19의 꽃가루 튜브에 성공적으로 적재될 수 있을 뿐만 아니라 가드^셀(20)과 아라비도시스(21)의루트 모발에 탑재될 수 있다.

현재, 펄프^{세포(22)의}칼슘 형광 염색에 대한 보고는 거의 없다. 중요한 미네랄 요소로서 칼슘은 사과와 같은 나무 과일의 성장과 품질 관리에 중요한 역할을 합니다. 사과 나무는 전 세계적으로 중요한 경제 종으로 인식되고, 사과는 건강한 음식으로 간주됩니다^23. 이 연구에서는 효소 가수분해를 통해 사과 과일 펄프에서 실행 가능한 전도를 얻은 다음 소분자 형광 시약을 세포질에 로드하여 Ca^2+를검출했습니다.

프로토콜

1. 프토플라스트 추출

1. 기본 용액 준비: 20 mM CaCl_2,5 mM 2-(N-morpholino)에탄술포닉산, 0.4 M D-소르비톨.
   참고: 기본 용액의 pH는 0.1M Tris 버퍼로 5.8로 조정되고 0.22 μm 수용성 필터를 통해 여과하고 4°C에 저장하였다.
2. 효소 용액 준비: 0.3%(w/v) Macerozyme R-10 및 0.5%(w/v) 셀룰라아제 R-10을 기본 솔루션과 함께 혼합합니다.
3. 1.5mL 원심분리기 튜브에 0.5mL의 효소 용액을 추가합니다. 건강하고 잘 익은 사과를 선택하십시오. 그런 다음 펄프를 10 x 5 x 1mm³ 크기(그림 1A-1C)로슬라이스합니다.
4. 사과 과일 펄프 조각을 효소 용액을 함유한 1.5mL 원심분리기 튜브에 넣은 다음튜브(그림 1D)를닫습니다.
5. 1 h에 대 한 28°C에서 튜브를 배양 하 고 어둠 속에서 셰이커에서 70 rpm/min에서 흔들.
6. 펄프 조각을 씻으시면 됩니다. 모든 효소 솔루션을 흡인한 다음 기본 솔루션의 0.5mL를 추가합니다.
7. 실온에서 2 분 동안 300 x g의 원심 분리기.
8. 프토플라스트 서스펜션을 얻으려면 원심분리관의 바닥에서 용액을 흡인한다(도1E).

2. 소분자 칼슘 이온 형광 염색

1. 플루오-4/AM 로딩 솔루션을 1:1:2비율로 2mM 플루오-4/AM, 20% F-127, 10배 인산완충식(PBS:80m MM Na₂HPO_4,1.36M NaCI, 20mM KH₂PO_4,26mM KCI)으로 준비한다.
2. 플루오-4/AM 로딩 용제 1μL을 1.5mL 원심분리기 튜브에 존재하는 프토플라스트 서스펜션의 99 μL에 추가합니다. 형광염의 최종 농도가 5 μM인지 확인하십시오.
3. La³⁺ 처리: 프토플라스트 서스펜션의 98 μL, 10mM La³⁺ 1 μL, 플루오-4/AM 로딩 솔루션 1μL로 100 μM La³⁺용액을 준비합니다. 용액을 섞고 튜브를 닫습니다.
4. 어둠 속에서 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
5. 상온에서 2 분 동안 300 x g에서 원심 분리로 프토플라스트를 씻으시면 됩니다. 용액의 70 μL을 흡인하고 기본 용액의 70 μL을 추가합니다.
6. 37°C에서 37°C의 프로토프스트 서스펜션을 30분 동안 배양하여 완전히 스테스테리프를 제거합니다.
7. 프토플라스트 서스펜션의 15 μL을 흡인하고 슬라이드에 떨어뜨립니다.
8. 형광 현미경(보충 도서 S1)에서관찰하십시오.
   참고: 3.45 μm 픽셀 해상도의 3.2 MP(2048 x 1536) CMOS 센서와 같은 고감도컬러 카메라를 사용합니다.
9. 이미징(20x)을 위해 GFP 채널을 선택합니다. 밝기를 0.5로 설정합니다.
   참고: 조명은 통합 된 하드 코팅 필터 세트와 조절 강도 LED 라이트 큐브입니다. 플루오-4/AM의 흥분 파장은 490 nm입니다.

3. 확률 성생존 분석

1. 플루오레세인 디아세테이트(FDA) 재고 용액 준비: 최종 농도가 1 mg/mL가 될 때까지 아세톤에 FDA를 용해하십시오.
2. 주식 용액 의 1 μL 및 아세톤의 99 μL로 FDA 작업 솔루션을 준비하십시오.
3. 99 μL의 프토플라스트 서스펜션에 FDA 작동 솔루션 1μL을 추가합니다. 위아래로 파이프팅하여 용액을 섞은 다음 튜브를 닫습니다.
   참고: FDA의 최종 농도는 100 μg/L입니다.
4. 어둠 속에서 5 분 동안 실온에서 얼룩.
5. 슬라이드를 준비하고 형광 현미경으로 관찰하십시오.
6. 이미징을 위한 GFP 채널을 선택합니다(그림1F).

4. 이미지 분석

1. 이미지 분석 및 스프레드시트 소프트웨어(예: 이미지 프로 플러스 및 Excel 2010)를 사용하여 획득한 이미지를 분석합니다.
2. 형광강도(보충 도서 S2)를계산하기 위해 프톱서스트에서 두 개의 수직 직경을 선택합니다. 다른 치료하에서 모든 프토플라스트의 형광 강도를 측정하여 측정했습니다. 최종 처리를 위해 사진 편집 소프트웨어를 사용합니다.

5. 통계 분석

1. 통계소프트웨어(보충 도S3)를사용하여 통계 분석을 수행합니다. 데이터는 평균 ± SD에 표시됩니다. 학생의 t-시험은실험 그룹 간의 차이점을 분석하는 데 사용되었습니다.

결과

상술한 프로토콜에 따라, 우리는 펄프(도1)로부터실행 가능한 프톱라스트를 얻기 위해 효소 방법을 사용했다. 일부 프톱라스에는 바쿨올레가 있었고, 다른 프로토프라스는 그렇지 않았다. Protoplasts는 Ca²⁺ 형광 표시등이 그(것)들에 로드되지 않았을 때 형광을 전시하지 않았습니다. 플루오-4/AM이 프토플라스트에 적재되었을 때, 세포질은 바쿨올이 아닌 형광이

토론

이 연구에서는, 생존 성 전도는 효소 가수 분해에 의해 얻어졌다. 이 방법은 신선한 사과를 필요로합니다. 본 프로토콜은 연구 연구에 사용하기 위해 과일 펄프에서 많은 수의 프토플라스트를 신속하게 격리할 수 있게 합니다. 이 방법의 적용가능성은 '후지'에 만전을 기하지 않습니다. '두난'과 '꿀 크리스프'의 사과 펄프의 프톱스트도 동일한프로토콜(보충 도면 S4)을통해 추출할 수 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.