Coloration du Ca2+ cytoplasmique avec Fluo-4/AM dans la pulpe de pomme

Résumé

Des protoplastes isolés de cellules de pulpe de pomme ont été chargés d’un réactif fluorescent de calcium pour détecter la concentration cytoplasmique de Ca^2+.

Résumé

Le Ca²⁺ cytosolique joue un rôle clé dans le développement des plantes. L’imagerie calcique est la méthode la plus polyvalente pour détecter les changements dynamiques dans le Ca²⁺ dans le cytoplasme. Dans cette étude, nous avons obtenu des protoplastes viables de cellules pulpaires par hydrolyse enzymatique. Des protoplastes isolés ont été incubés avec le réactif fluorescent à petites molécules (Fluo-4/AM) pendant 30 min à 37 °C. Les sondes fluorescentes ont réussi à coloré le Ca²⁺ cytosolique mais ne se sont pas accumulées dans les vacuoles. La^3+,un bloqueur de canaux Ca^2+, a diminué l’intensité de la fluorescence cytoplasmique. Ces résultats suggèrent que Fluo-4/AM peut être utilisé pour détecter les changements dans le Ca²⁺ cytosolique dans la chair du fruit. En résumé, nous présentons une méthode pour isoler efficacement les protoplastes des cellules de chair du fruit et détecter le Ca²⁺ en chargeant un réactif fluorescent de calcium à petites molécules dans le cytoplasme des cellules pulpaires.

Introduction

Ca²⁺ joue un rôle important dans la transduction du signal végétal et le métabolisme^1,2. En outre, il régule les caractéristiques de qualité des fruits^3,4, y compris la dureté, la teneur en sucre et la susceptibilité aux troubles physiologiques pendant le stockage^5,6. Le Ca²⁺ cytoplasmique joue un rôle important dans la transduction du signal et régule la croissance et le développement des plantes⁷. La perturbation de l’homéostasie cellulaire du calcium peut induire une fosse amère dans les pommes⁸, la maladie des taches brunes dans les poires⁹et la pourriture ombilicale dans les tomates¹⁰, affectant la qualité des fruits et causant de graves pertes économiques^3,11. L’imagerie calcique a une résolution spatiale et temporelle suffisante et est une méthode importante pour observer la dynamique du Ca²⁺ dans les cellules vivantes^12,13.

À l’heure actuelle, il existe deux méthodes principales pour l’imagerie calcique intracellulaire dans les cellules vivantes: l’une utilise des sondes fluorescentes chimiques à petites molécules¹⁴, et l’autre est le capteur de codage génique (GECI)^15,16. Compte tenu de la difficulté d’établir un système transgénique stable dans les arbres fruitiers et du développement plus long des fruits, GECI_S ne convient pas à l’imagerie par fluorescence ca²⁺ des fruits.

Les sondes fluorescentes à petites molécules telles que Fluo-4/AM présentent un avantage particulier : leur forme d’ester AM (dérivé d’ester acétoxyméthyléfiable aux cellules) peut être facilement chargée en vrac dans des cellules vivantes sans avoir besoin de transfection, ce qui la rend flexible, rapide et non cytotoxique^17. Fluo-4 / AM pourrait être chargé avec succès dans le tube pollinique de Pyrus pyrifolia¹⁸ et Petunia,^{19 ainsi} que dans les cellules de garde²⁰ et les poils racinaires d’Arabidopsis ²¹.

À l’heure actuelle, il existe peu de rapports sur la coloration par fluorescence de calcium des cellules de la pulpe²². En tant qu’élément minéral important, le calcium joue un rôle clé dans la croissance et le contrôle de la qualité des fruits des arbres tels que les pommes. Les pommiers sont mondialement reconnus comme une espèce économique importante, et les pommes sont considérées comme un aliment sain²³. Dans cette étude, nous avons obtenu des protoplastes viables à partir de pulpe de fruit de pomme par hydrolyse enzymatique, puis chargé des réactifs fluorescents à petites molécules dans le cytoplasme pour détecter ca^2+.

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Protocole

1. Extraction de protoplastes

1. Préparer la solution de base : 20 mM de_CaCl2,5 mM d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique et 0,4 M de D-sorbitol.
   REMARQUE: Le pH de la solution de base a été ajusté à 5,8 avec un tampon Tris de 0,1 M, filtré à travers des filtres solubles dans l’eau de 0,22 μm et stocké à 4 °C.
2. Préparer la solution enzymatique : Mélanger 0,3 % (p/v) de Macerozyme R-10 et 0,5 % (p/v) de cellulase R-10 avec la solution de base.
3. Ajouter 0,5 mL de solution enzymatique dans un tube centrifuge de 1,5 mL. Choisissez une pomme saine et mûre. Ensuite, coupez la pâte en 10 x 5 x 1 mm³ (Figure 1A-1C).
4. Placer les morceaux de pulpe de pomme dans un tube centrifuge de 1,5 mL contenant une solution enzymatique, puis fermer le tube (Figure 1D).
5. Incuber le tube à 28 °C pendant 1 h, en agitant à 70 tr/min dans un shaker dans l’obscurité.
6. Lavez les morceaux de pulpe. Aspirer toute la solution enzymatique, puis ajouter 0,5 mL de la solution de base.
7. Centrifuger à 300 x g pendant 2 min à température ambiante.
8. Pour obtenir une suspension de protoplaste, aspirer la solution par le fond du tube de centrifugation (Figure 1E).

2. Coloration par fluorescence des ions calcium à petites molécules

1. Préparer la solution de chargement Fluo-4/AM avec 2 mM de Fluo-4/AM, 20 % de F-127 et 10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS:80 mM Na₂HPO_4,1,36 M NaCI, 20 mM KH₂PO₄et 26 mM KCI) dans un rapport de 1:1:2.
2. Ajouter 1 μL de solution de charge Fluo-4/AM à 99 μL de la suspension de protoplaste présente dans les tubes centrifuges de 1,5 mL. Assurez-vous que la concentration finale du colorant fluorescent est de 5 μM. Mélangez la solution, puis fermez le tube.
3. Traitement La³⁺ : Préparer une solution de La^{3+ de} 100 μM avec 98 μL de suspension de protoplaste, 1 μL de 10 mM De La³⁺et 1 μL de solution de charge Fluo-4/AM. Mélanger la solution et fermer le tube.
4. Incuber pendant 30 min à 37 °C dans l’obscurité.
5. Laver les protoplastes par centrifugation à 300 x g pendant 2 min à température ambiante. Aspirer 70 μL de la solution et ajouter 70 μL de la solution de base.
6. Incuber la suspension de protoplaste à 37 °C pendant 30 min pour se désestérifier complètement.
7. Aspirer 15 μL de la suspension de protoplaste et égoutter sur une lame.
8. Observer au microscope à fluorescence(figure supplémentaire S1).
   REMARQUE: Utilisez un appareil photo couleur avec une sensibilité élevée, c’est-à-dire un capteur CMOS de 3,2 MP (2048 x 1536) avec une résolution de pixels de 3,45 μm.
9. Sélectionnez le canal GFP pour l’imagerie (20x). Réglez la luminosité sur 0,5.
   REMARQUE: L’éclairage est des cubes de lumière LED à intensité réglable avec un ensemble de filtres à revêtement dur intégré. La longueur d’onde d’excitation de Fluo-4/AM est de 490 nm.

3. Test de viabilité du protoplaste

1. Préparer la solution diacétate de fluorescéine (FDA) : Dissoudre la FDA dans l’acétone jusqu’à ce que la concentration finale soit de 1 mg/mL.
2. Préparer la solution de travail FDA avec 1 μL de la solution stock et 99 μL d’acétone.
3. Ajouter 1 μL de solution de travail FDA à 99 μL de suspension de protoplaste. Mélanger la solution en pipetant de haut en bas, puis fermer le tube.
   REMARQUE: La concentration finale de la FDA est de 100 μg / L.
4. Tache à température ambiante pendant 5 min dans l’obscurité.
5. Préparez les lames et observez-les au microscope à fluorescence.
6. Sélectionnez le canal GFP pour l’imagerie (Figure 1F).

4. Analyse d’images

1. Analysez les images acquises à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images et de tableur (p. ex., Image-Pro Plus et Excel 2010).
2. Sélectionnez deux diamètres verticaux parmi les protoplastes pour calculer l’intensité de fluorescence (Figure supplémentaire S2). Mesurer l’intensité de fluorescence de tous les protoplastes sous différents traitements a été mesurée. Pour le traitement final, utilisez un logiciel de retouche photo.

5. Analyse statistique

1. Effectuer une analyse statistique à l’aide d’un logiciel statistique (Figure supplémentaire S3). Les données sont présentées dans moyenne ± SD. Le test tde l’étudiant a été utilisé pour analyser les différences entre les groupes expérimentaux.

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Résultats

Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons utilisé la méthode enzymatique pour obtenir des protoplastes viables à partir de la pulpe (Figure 1). Certains protoplastes avaient des vacuoles, tandis que d’autres n’en avaient pas. Alors que les protoplastes ne présentaient aucune fluorescence lorsque l’indicateur fluorescent Ca²⁺ n’y était pas chargé. Lorsque Fluo-4/AM a été chargé dans les protoplastes, le cytoplasme, mais pas la vacuole, est devenu fluoresce...

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Discussion

Dans cette étude, des protoplastes viables ont été obtenus par hydrolyse enzymatique. Notez que cette méthode nécessite des pommes fraîches. Le présent protocole permet l’isolement rapide d’un grand nombre de protoplastes de la pulpe de fruit pour une utilisation dans des études de recherche. L’applicabilité de cette méthode ne se limite pas à « Fuji »; les protoplastes de la pulpe de pomme de 'Dounan' et 'Honey Crisp' peuvent également être extraits par le même protocole(Figure supplémen...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.